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Resumo

Os RNAs intensificadores (eRNAs) são RNAs não codificantes produzidos a partir de intensificadores ativos. Uma abordagem ideal para estudar as funções do eRNA é manipular seus níveis nas regiões nativas da cromatina. Aqui, apresentamos um sistema robusto para estudos de eRNA usando ativadores transcricionais fundidos com CRISPR-dCas9 para induzir a expressão de eRNAs de interesse.

Resumo

Os intensificadores são elementos genômicos essenciais espalhados pelo genoma dos mamíferos e ditam programas de expressão gênica específicos do tecido. Evidências crescentes mostraram que os intensificadores não apenas fornecem motivos de ligação ao DNA para fatores de transcrição (TFs), mas também geram RNAs não codificantes que são chamados de eRNAs. Estudos demonstraram que os transcritos de eRNA podem desempenhar papéis significativos na regulação gênica tanto na fisiologia quanto na doença. Os métodos comumente usados para investigar a função dos eRNAs são restritos a abordagens de "perda de função" por knockdown de eRNAs ou por inibição química da transcrição do intensificador. Não houve um método robusto para conduzir estudos de "ganho de função" de eRNAs para imitar condições específicas de doenças, como câncer humano, onde os eRNAs são frequentemente superexpressos. Aqui, apresentamos um método para ativar eRNAs de forma precisa e robusta para interrogação funcional de seus papéis, aplicando o sistema de Mediadores de Ativação Sinérgica (SAM) mediados por dCas9. Apresentamos todo o fluxo de trabalho de ativação de eRNA, desde a seleção de eRNAs, o desenho de gRNAs até a validação da ativação de eRNA por RT-qPCR. Este método representa uma abordagem única para estudar os papéis de um eRNA específico na regulação gênica e no desenvolvimento de doenças. Além disso, esse sistema pode ser empregado para triagem CRISPR imparcial para identificar alvos de eRNA que conduzem o fenótipo no contexto de uma doença específica.

Introdução

O genoma humano contém uma constelação de elementos reguladores 1,2,3. Dentre estes, os intensificadores emergem como uma das categorias mais críticas 4,5,6. Os intensificadores desempenham papéis essenciais na regulação do desenvolvimento e são responsáveis por gerar programas de expressão gênica espaço-temporal para determinar a identidade celular 5,6,7. Convencionalmente, os intensificadores são considerados apenas elementos de DNA que fornecem motivos de ligação para fatores de transcrição (TFs), que então controlam a expressão do gene alvo 6,8. No entanto, uma série de estudos descobriu que muitos intensificadores ativos também transcrevem RNAs intensificadores não codificantes (ou seja, eRNAs) 4 , 9 , 10 .

O nível de transcrição do eRNA foi correlacionado com a atividade de um intensificador 4,10. Os intensificadores ativos produzem mais transcritos de eRNA e mostram níveis mais altos de marcadores de epigenoma associados à transcrição ativa, como H3K27ac e H3K4me1 9,11,12. Alguns estudos demonstraram que os transcritos de eRNA podem desempenhar papéis importantes na ativação transcricional de genes-alvo10,12. Um grande número de eRNAs foi identificado como desregulado em cânceres humanos 13,14,15,16, muitos dos quais exibiram alta especificidade do tipo de câncer e relevância clínica. Esses achados trazem oportunidades de que a elucidação de eRNAs que podem conduzir / promover a tumorigênese pode oferecer novos alvos para intervenção terapêutica13,15.

Os métodos atuais para estudar as funções do eRNA são quase exclusivamente baseados em estratégias de knockdown que usaram pequenos RNAs de interferência (siRNA), RNAs de grampo curto (shRNAs) ou oligonucleotídeos antisense (ASOs, dos quais os ácidos nucléicos bloqueados (LNAs) são o tipo comumente usado em pesquisa) 10 , 12 , 17 . No entanto, doenças humanas como o câncer mostram predominantemente superexpressão de eRNAs em comparação com seu tecido normal adjacente15, exigindo ferramentas para "superexpressar" eRNAs para imitar seus padrões de expressão relevantes para a doença para estudos funcionais. Para conseguir isso, um sistema de superexpressão ectópica baseado em plasmídeo não é ideal porque os locais exatos de início e término da transcrição dos eRNAs permanecem pouco claros. Além disso, um sistema de expressão de plasmídeo pode alterar a localização dos eRNAs, causando potenciais artefatos de suas funções18. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para facilitar a caracterização funcional dos eRNAs, reforçando sua "superexpressão" no locus genômico nativo de sua produção (ou seja, in situ), que é baseado no Sistema de Mediadores de Ativação Sinérgica (SAM) CRISPR / dCas9.

O sistema SAM foi inicialmente desenvolvido para ativar genes codificantes e RNAs não codificantes intergênicos longos (lincRNAs) associados à resistência ao inibidor de BRAF em células de melanoma19. Ao contrário de outras tecnologias de ativação CRISPR (CRISPRa), o sistema SAM consiste em uma combinação de ativadores de transcrição para conferir ativação transcricional robusta de regiões-alvo. Esses ativadores incluem: um Cas9 enzimaticamente morto (dCas9) fundido com VP64 (ou seja, dCas9-VP64); um RNA guia contendo dois aptâmeros de RNA MS2 e uma proteína ativadora de fusão MS2-p65-HSF1. A presença dos aptâmeros MS2 no gRNA pode recrutar a proteína de fusão MS2-p65-HSF1 para as proximidades dos locais de ligação dCas9/gRNA. Entre estes, VP64 é um tetrâmero projetado do domínio ativador transcricional VP16 do herpes simplex, que demonstrou ativar fortemente a transcrição gênica recrutando fatores de transcrição gerais 20,21,22. A proteína de fusão MS2-p65-HSF1 consiste em três partes. A primeira parte, a MS2-N55K, é uma forma mutante da proteína de ligação a MS2 que tem uma afinidade mais forte23; as outras duas partes dessa proteína de fusão são o domínio de transativação de p65 e o fator de choque térmico 1 (HSF1), ambos fatores de transcrição que possuem fortes domínios de transativação e podem induzir programas de transcrição robustos24,25. Portanto, o sistema SAM criou essencialmente um complexo ativador altamente potente para ativar a transcrição de genes codificadores designados e lincRNAs19.

Protocolo

Todo o fluxo de trabalho desse protocolo é mostrado na Figura 1.

1. Seleção de RNA intensificador (eRNA)

  1. Identifique uma suposta região potenciadora de interesse usando picos de ligação de dados de sequenciamento de imunoprecipitação de cromatina (ChIP-Seq), ou seja, de modificações de histonas (por exemplo, H3K4me1 e H3K27ac) ou de coativadores de transcrição (por exemplo, p300).
  2. Identifique o eRNA de interesse cruzando o pico de ChIP-Seq com sinais de RNA-seq (por exemplo, de RNA-seq total ou de RNA-seq nascente, como Global Run-On Sequencing (GRO-Seq).
    NOTA: A região escolhida para projetar gRNAs deve ser geralmente limitada à região do "núcleo intensificador", onde TFs ou coativadores (por exemplo, p300) mostraram picos claros de ChIP-seq (Figura 2A). O dCas9 e seus coativadores de fusão serão recrutados por um gRNA para esta região para mimetizar a ligação nativa dos coativadores (Figura 2A). Se conjuntos de dados específicos, como Cap Analysis of Gene Expression (CAGE)4 ou GRO-cap26, estiverem disponíveis, eles podem ser usados para determinar com precisão o "núcleo intensificador", a região entre dois locais de início de transcrição dos eRNAs transcritos em direções opostas 4,10,26.

2. Projeto de gRNA

  1. Use ferramentas comuns de design de gRNA CRISPR, como o CRISPOR27 , para selecionar gRNAs com baixo potencial fora do alvo (http://crispor.tefor.net/).
    NOTA: Outras ferramentas como Benchling28 ou CHOPCHOP29 também podem ser usadas como opções adicionais para o projeto de gRNA.
  2. Cole a sequência de DNA do núcleo do intensificador na coluna Etapa 1 no site do CRISPOR e clique no botão suspenso para escolher o genoma correspondente (por exemplo, humano) na coluna Etapa 2 . Clique no botão suspenso para definir a sequência do Motivo Adjacente do Protoespaçador (PAM) como "NGG" na coluna Etapa 3 e, em seguida, clique no botão "Enviar" para gerar sequências de guia com um comprimento de 20 bp.
  3. Escolha guias com pontuações de especificidade mais altas na ferramenta CRISPOR, ou seja, baixo potencial fora do alvo, adicione "CACCG" à extremidade 5' e "C" à extremidade 3', respectivamente.
    NOTA: Selecione os guias com pontuações de especificidade mais altas (>85 no CRISPOR é o preferido).
  4. Solicite oligonucleotídeos para cada sequência de sentido e antisentido de fontes comerciais.
    NOTA: Instruções adicionais sobre o design do gRNA CRISPR/Cas9 podem ser encontradas em outros estudos 30,31. As saliências na etapa 2.2 tornarão o gRNA compatível com o esqueleto de gRNA SAM (Addgene # 61427), que usa a enzima de restrição BsmBI.

3. Clone gRNAs em uma construção lentiviral

  1. Para recozer oligos, misture 1 μL de cada oligo emparelhado a 100 μM, 1 μL de tampão de ligação 10x T4, 0,5 μL de T4 DNA Ligase (400.000 unidades/mL) e 6,5 μL de H2O para atingir um volume total de 10 μL. Incube a 37 °C por 30 min, depois 95 °C por 5 min, e reduzir para 25 °C a 5 °C/min. Diluir a 100 μL com H2O.
  2. Digerir a estrutura do gRNA misturando 2 μL de tampão de enzima de restrição (RE) 10x, 300 ng de plasmídeo de lenti_gRNA(MS2)_zeo (Addgene #61427) em 1 μL, 1 μL de enzima BsmBI e 16 μL de H2O para atingir um volume total de 20 μL. Incube a 55 °C por 15 min.
  3. Misture os componentes de ligação com 20 μL de produto de digestão adicionando 2,5 μL de tampão de ligação 10x T4, 1 μL de produto de recozimento diluído e 1,5 μL de DNA ligase T4 (400.000 unidades/mL) em um sistema de 25 μL. Incubar em temperatura ambiente por 30 min.
  4. Transforme 2 μL da mistura de ligação da etapa 3.3 em células de E.coli competentes para Stbl3. Coloque-os em uma placa de ampicilina LB-ágar e incube durante a noite a 37 ° C.
  5. Escolha e inocule uma única colônia de bactérias e extraia o plasmídeo. Envie-o para sequenciamento Sanger para confirmar se a sequência de gRNA está inserida corretamente.
    NOTA: As sequências para os primers e gRNAs estão disponíveis na Tabela Suplementar 1. Recomenda-se o uso de células de E.coli Stbl3 quimicamente competentes aqui porque têm um maior rendimento de DNA de plasmídeo e maior estabilidade de plasmídeo ao gerar plasmídeos de lentivírus propensos à instabilidade32.

4. Teste de eficiência de gRNA

NOTA: Embora possa não ser necessário para todos os gRNA, recomenda-se que os pesquisadores examinem a qualidade do gRNA realizando o ensaio Surveyor (ou seja, ensaio de clivagem de incompatibilidade) para detectar indels ou mutações que só podem ser geradas com eficiência por gRNAs de boa qualidade33,34. Outros métodos, como o Tracking of Indels by Decomposition (TIDE), também podem ser usados para determinar a eficiência do gRNA30,35. A nuclease do surveyor é um membro de uma família de endonucleases específicas de incompatibilidade que podem cortar DNA de fita dupla com incompatibilidades ( Figura 3A ). A qualidade dos gRNAs pode ser revelada pela eficácia da produção de espécies menores de DNA. Praticamente, a eficácia do corte do agrimensor também pode ser afetada pela eficiência de transfecção de gRNAs e Cas9.

  1. GRNA transfecto junto com o plasmídeo pSpCas9(BB)-2A-Puro (Addgene #62988) que expressa a proteína Cas9 em células 293T usando um reagente de transfecção à base de lipídios. Use 1,2 μg/mL para cada plasmídeo por poço em uma placa de 6 poços. Continue a cultivar as células por 3 dias após a transfecção. Colher e extrair DNA genômico de acordo com o protocolo do fabricante36.
  2. Use a reação em cadeia da polimerase (PCR) para amplificar a região intensificadora alvo do DNA genômico. Use as condições de PCR mostradas na Tabela Suplementar 2. Use primers na Tabela Suplementar 1 para um exemplo de intensificador, NET1e. Desnature os produtos de PCR incubando a 95 ° C por 10 min e hibridize-os novamente diminuindo de 95 ° C para 25 ° C na velocidade de -0,3 ° C / s para permitir que o DNA de fita simples (ssDNA) com e sem indels ou mutações induzidas por gRNA se recoza uns aos outros.
  3. Digerir o DNA hibridizado pela nuclease Surveyor (Figura 3A) seguindo o protocolo do fabricante37. Misture 400 ng de DNA hibridizado da etapa 4.2, 1 μL de nuclease Surveyor, 1 μL de intensificador Surveyor e 5 μL de 0,15 M MgCl2 em um sistema de 50 μL. Incubar a 42 °C durante 60 min. Analise o DNA em um gel de agarose. Use controle negativo, como células apenas com Cas9, mas sem direcionar gRNAs, no ensaio e na eletroforese em gel (Figura 3B).

5. Geração de lentivírus

  1. Adicione psPAX2, pMD2.G e um plasmídeo alvo (por exemplo, lenti_dCas9-VP64_Blast, Addgene # 61425; ou lenti_MS2-p65-HSF1_Hygro, Addgene # 61426) na proporção de 3 μg: 1 μg: 4 μg em um tubo de polipropileno de 1,5 mL. Misture-os com 500 μL de Opti-MEM e incube por 5 min em temperatura ambiente.
  2. Em um tubo separado, coloque 10 μL do reagente de transfecção à base de lipídios em 500 μL de Opti-MEM e incube por 5 min em temperatura ambiente.
  3. Combine os produtos das etapas 5.1 e 5.2 e incube por 20 min em temperatura ambiente.
  4. Plaquee as células 293T um dia antes da transfecção e deixe-as atingir uma confluência de ~ 30% em uma placa de 10 cm no momento da transfecção. Adicione 4 mL de meio regular (DMEM com 10% de FBS) e, em seguida, adicione o complexo da etapa 5.3 gota a gota às células. Adicione DMEM com 10% de FBS para fazer o volume final de até 6 mL. Incubar durante a noite em uma incubadora de células a 37 ° C com 5% de CO2.
  5. No dia seguinte, troque o meio para 10 mL de novo DMEM com 10% de FBS. Colha o meio 24 h após a mudança do meio. Use um filtro de seringa (por exemplo, 0,45 μm) para filtrar o meio que contém o vírus e, em seguida, prossiga para a etapa 6 ou armazene o vírus a -80 °C.
    NOTA: As operações de lentivírus requerem um gabinete de nível de biossegurança II. É preciso ter cuidado para lidar com segurança com os experimentos associados ao vírus; e se algum recipiente tiver contato direto com o meio viral, ele precisa ser branqueado por mais de 20 min antes do descarte como risco biológico.

6. Cultura celular

  1. Manter as células numa incubadora de cultura de células de CO2 a 37 °C com 5% de CO2.
  2. Cultura de células MCF7 e 293T em meio Modified Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco com 10% de FBS.
  3. Cultive células em placas de 10 cm e divida na proporção de 1:3 a 1:5 quando confluente.

7. Infecção e seleção celular

  1. Semeie as células-alvo (por exemplo, MCF7) diretamente em uma mistura de meio viral contendo 0,5 mL de lenti_dCas9-VP64_Blast (Addgene # 61425) e 0,5 mL de lenti_MS2-p65-HSF1_Hygro (Addgene # 61426). Adicione 8 μg/ml de brometo de hexadimetrina para aumentar a eficiência da infeção. Use um poço de células não infectadas como um controle negativo para examinar a eficácia da seleção de antibióticos.
    NOTA: A quantidade de meio viral é recomendada da seguinte forma: 6 mL de meio viral para placa de 10 cm, 1 mL para um poço de uma placa de 6 poços e 0.5 mL para um poço de uma placa de 12 poços.
  2. Às 24 h após a infecção, adicione às células meio fresco contendo Blasticidina (5 μg/mL para células MCF7) e Higromicina (200 μg/mL para células MCF7).
  3. Manter as células em meio de seleção de antibióticos até que as células de controle negativo desapareçam.
    NOTA: O tempo pode variar para que diferentes linhagens celulares se tornem estáveis. Para MCF7, geralmente leva de 5 a 7 dias para que as células não infectadas morram completamente. Uma curva de morte usando uma variedade de concentrações de antibióticos deve ser testada para uma nova linhagem celular antes dos experimentos. É aceitável usar uma mistura de células para as próximas etapas, mas uma alternativa é escolher colônias unicelulares que sejam homogêneas em termos de expressão das duas proteínas efetoras. A linha estável obtida é referida como linha parental efetora SAM (por exemplo, linha efetora SAM MCF7) neste artigo. Recomenda-se que uma linhagem celular parental efetora SAM compartilhada seja usada para infecção por diferentes gRNAs direcionados ou não, especialmente se seus efeitos forem comparados.
  4. Use western blotting para determinar se as células expressam de forma estável as duas proteínas efetoras (um exemplo é mostrado na Figura 4A). Use a transcrição reversa de RNAs totais seguida de PCR quantitativo (RT-qPCR) como um método alternativo para examinar os níveis de expressão dos dois mRNAs (dCas9-VP64 e MS2-p65-HSF1, Figura 4B).
    NOTA: Os primers para examinar os níveis de mRNA dos dois efetores dCas9 estão disponíveis na Tabela Suplementar 1.
  5. Gere lentivírus de gRNAs construídos na etapa 3.5 e infecte a linha celular SAM estável expressando duplamente dCas9-VP64 e MS2-p65-HSF1 com lentivírus gRNA individual. Adicione Zeocina (100 μg/mL para células MCF7) ao meio 24 h após a transdução viral do gRNA. Gere um controle negativo que expresse gRNA não direcionado (NT-gRNA) na linhagem celular SAM parental.
    NOTA: Certifique-se de que o medicamento de seleção seja específico para o construto de interesse.

8. Extração de RNA e RT-PCR quantitativo para examinar os níveis de eRNA

  1. Extraia RNAs totais de linhagens celulares SAM expressando NT-gRNA ou gRNAs direcionados usando um kit de extração de RNA38 ou outro método baseado em clorofórmio de fenol. Use células de ~ 80% de confluência em um poço de uma placa de seis poços para extração de RNA.
    NOTA: Nenhuma diferença significativa foi observada em nossa prática para detecção de eRNA quando os RNAs são extraídos por colunas de ligação comerciais ou por reagentes de fenol clorofórmio.
  2. Produza DNA complementar (cDNA) a partir do RNA purificado por reação de transcrição reversa com hexâmero aleatório, seguindo o protocolo do fabricante39. Condições de uso na Tabela Suplementar 2.
    NOTA: Como a maioria dos eRNAs não é poliadenilada 1,2,4,9,10, o hexâmero aleatório é usado rotineiramente para a geração de cDNA.
  3. Projete primers para eRNAs alvo de medição de RT-qPCR usando uma ferramenta de design de primer respeitável (por exemplo, Primer 3). Teste a linearidade de amplificação dos pares de primers examinando se os primers amplificarão linearmente os cDNAs diluídos em série e mostrarão as diferenças esperadas do ciclo de qPCR. Condições de uso na Tabela Suplementar 2.
    NOTA: Os primers para RT-qPCR devem ter como alvo a região altamente transcrita no RNA-seq nascente, e o teste de linearidade dos primers deve incluir uma ampla gama de diluições de cDNA para garantir que todos os níveis de eRNA possivelmente encontrados sejam testados. Um exemplo de teste de linearidade é mostrado na Figura 5A.
  4. Realize RT-qPCR e analise os níveis de expressão de eRNA em células de controle (linha celular SAM com NT-gRNA) e na linha celular SAM com gRNAs direcionados a eRNA (por exemplo, NET1e gRNA # 1) (por exemplo, Figura 6A). Os primers para RNA NET1e são mostrados na Tabela Suplementar 1. Condições de uso na Tabela Suplementar 2.  

9. dCas9 ChIP e qPCR

NOTA: Esta etapa é um experimento opcional para validar a ligação do complexo dCas9 / SAM-gRNA ao intensificador alvo pelos gRNAs específicos. Embora seja recomendável que os usuários executem esta etapa, não é necessário testar cada gRNA. Consulte um exemplo mostrado na Figura 5B. Consulte os primers listados na Tabela Suplementar 1.

  1. Células de reticulação
    1. Remova o meio das células e adicione formaldeído a 1% dissolvido em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Deixe por 10 min.
    2. Adicione 2,5 M de glicina no volume 1:20 para extinguir a reticulação e lave as células duas vezes com PBS gelado. Adicione 700 μL de PBS gelado e raspe as células para um tubo de 1,5 mL.
    3. Centrifugue a 2.000 x g por 5 minutos a 4 °C. Prossiga para a etapa 9.2 ou congele e armazene a -80 °C.
  2. Sonicate
    1. Faça novos buffers LB1, LB2 e LB3. LB1: 50 mM Hepes-KOH (pH 7,5), 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% de glicerol, 0,5% de NP-40, 0,25% de Triton-X 100 e 1x inibidor de protease. LB2: 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA e 1x inibidor de protease. LB3: 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 0,1% Na-desoxicolato, 0,5% N-lauroilsarcosina e 1x inibidor de protease. Suplemento 1x inibidor de protease
    2. Adicione 1 mL de tampão LB1 aos pellets celulares, pipete bem, gire a 4 ° C por 10 min e gire a 2.000 x g por 5 minutos a 4 ° C. Despeje o sobrenadante, adicione 1 mL de tampão LB2, gire a 4 ° C por 10 min e gire a 2.000 x g por 5 min a 4 ° C. Despeje o sobrenadante e remova o excesso do tampão LB2. Adicione 300 μL de tampão LB3.
    3. Sonicar e fragmentar o DNA da cromatina a um tamanho médio de ~ 200-400 pb usando um sistema sonicador adequado. Após a sonicação, adicione 30 μL de Triton-X 100 a 10% e misture bem. Teste o tempo de sonicação adequado se uma nova linha celular for usada.
    4. Centrifugue a 14.000 x g para remover o pellet. Transfira o sobrenadante para o novo tubo e adicione 630 μL de LB3 e 70 μL de Triton X-100 a 10% para um volume total de 1 mL. Adicionar 2 μg do anticorpo Cas9 ao sobrenadante e rodar a 4 °C durante a noite.
  3. Captura de imunocomplexos e reticulação reversa
    1. Prepare tampão RIPA (50 mM HEPES pH 7,6, 1 mM EDTA, 0,7% Na-desoxicolato, 1% NP-40, 0,5 M LiCl) e tampão de eluição (1% SDS e 0,1 M NaHCO3).
    2. Lave as dynabeads de proteína G com 1% de BSA em PBS 3 vezes e tampão LB3 uma vez.
    3. Adicione 30 μL de dinamarga de proteína G à amostra e incube a 4 °C por 4 h.
    4. Lave o imunocomplexo de esferas em 500 μL de tampão RIPA 6x. Não deixe as contas secarem.
    5. Lave o imunocomplexo de esferas uma vez com tampão TE; Remova o buffer.
    6. Adicionar 200 μL de tampão de eluição ao imunocomplexo e vórtice dos grânulos; em seguida, coloque-o em um agitador aquecido de temperatura ajustável para 65 °C com agitação de 600 rpm por 6-16 h para reverter a reticulação.
  4. Extração de DNA
    1. Remova os tubos do shaker, gire brevemente as contas e coloque-as em um suporte magnético. Transferir 200 μL do sobrenadante para um tubo novo e adicionar 200 μL de tampão TE.
    2. Adicione 1 μL de RNase A (1 mg / mL) ao tubo e incube a 37 ° C por 1 h.
    3. Após 1 h de incubação, adicione 2 μL de proteinase K (20 mg / mL) à amostra e incube-a a 65 ° C por 2 h.
    4. Centrifugar brevemente e adicionar 400 μL de mistura de fenol, clorofórmio e álcool isoamílico. Misture bem e centrifugue por 5 min a 10.000 x g.
    5. Mova 400 μL da camada superior para um tubo de 1,7 mL contendo 16 μL de NaCl 5 M e 1 μL de glicogênio (20 μg/μL) e misture bem.
    6. Adicione 800 μL de etanol 100% e deixe durante a noite a -20 °C.
    7. Na manhã seguinte, centrifugue os tubos a 4 °C a 14.000 x g durante 15 min.
    8. Remova o sobrenadante e lave o pellet com 1 mL de etanol a 70%. Gire para baixo a 14.000 x g por 10 min.
    9. Remova o etanol, seque o pellet ao ar e ressuspenda em 50 μL de TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM).
  5. Realize ChIP-qPCR para examinar o recrutamento do complexo SAM para o local de direcionamento por um par de primers de direcionamento de núcleo intensificador. Use um par de primers visando uma região irrelevante como controle negativo.

10. Ensaio de crescimento celular e outros testes funcionais de superativação de eRNA

  1. Tripsinizar as linhas celulares SAM que expressam o gRNA não direcionado ou gRNAs direcionados ao eRNA e a placa ~ 3.000 células por poço em uma placa de 96 poços.
  2. Meça o crescimento celular usando um gerador de imagens de células vivas ou outros métodos (por exemplo, contagem de células ou ensaio de sal de tetrazólio solúvel em água-1).
  3. Use a concentração inibitória semimáxima (IC50) para testar as respostas celulares a medicamentos específicos contra o câncer em células com ou sem superexpressão de NET1e por SAM15.
    NOTA: Os resultados dos ensaios de crescimento celular e testes de sensibilidade a drogas de células de câncer de mama são apresentados após a superexpressão de um eRNA transcrito adjacente ao gene NET1 , que foi referido como NET1e15. Outros ensaios podem ser conduzidos nos níveis celular ou do organismo com base na necessidade de cada projeto específico.

Resultados

A Figura 1 ilustra o fluxo de trabalho geral desse protocolo. Nosso foco foi em um eRNA representativo, NET1e15, que é superexpresso no câncer de mama, para o qual o sistema SAM foi usado para ativar e estudar seu papel biológico na regulação da expressão gênica, proliferação celular e resposta a medicamentos contra o câncer. Para este intensificador NET1 , vários picos de p300 ChIP-Seq, flanqueados por tr...

Discussão

Com base em nossos dados, concluímos que o sistema SAM é adequado para estudar o papel dos eRNAs na regulação dos fenótipos celulares, por exemplo, crescimento celular ou resistência a medicamentos. No entanto, é necessário um design cuidadoso de gRNA para uma ativação robusta de eRNA, devido aos seguintes motivos. Em primeiro lugar, o local de início da transcrição (TSS) do eRNA em cada linhagem/tipo de célula específica permanece menos claramente anotado. Devido a isso, ...

Divulgações

O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais do Instituto de Pesquisa e Prevenção do Câncer do Texas.

Agradecimentos

Este trabalho é apoiado por doações para WL (Instituto de Pesquisa e Prevenção do Câncer do Texas, CPRIT RR160083 e RP180734; NCI K22CA204468; NIGMS R21GM132778; Prêmio UT Stars da Universidade do Texas; e a Fundação Welch AU-2000-20190330) e uma bolsa de pós-doutorado para JL (UTHealth Innovation for Cancer Prevention Research Training Program Post-doctoral Fellowship, CPRIT RP160015). Reconhecemos a publicação original15 de onde algumas de nossas figuras atuais foram adotadas (com modificações), que segue a licença Creative Commons (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
BlasticidinGoldbioB-800-100
BsmBI restriction enzymeNew England BioLabs Inc.R0580S
Cas9 mAbActive Motif61757Lot: 10216001
Deoxynucleotide (dNTP) Solution MixNew England BioLabs Inc.N0447S
Dulbecco’s Modified Eagle MediumCorning10-013-CM
Dynabeads Protein GThermo Fisher Scientific65002
EDTAThermo Fisher ScientificBP118-500
EGTASigmaE3889
Fetal Bovine SerumGenDEPOTF0900-050
GlycogenThermo Fisher Scientific10814010
Hepes-KOHThermo Fisher ScientificBP310-100
Hexadimethrine BromideSigmaH9268
Hygromycin BGoldbioH-270-25
IGEPAL CA630SigmaD6750
IncuCyte live-cell imagerEssen BioScienceIncuCyte S3 Live-Cell Analysis System
lenti_dCAS-VP64_BlastAddgene61425
lenti_gRNA(MS2)_zeo backboneAddgene61427
lenti_MS2-p65-HSF1_HygroAddgene61426
LiCLSigmaL9650
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668-500
NaClSigmaS3014
Na-DeoxycholateSigmaD6750
NaHCO3Thermo Fisher ScientificBP328-500
N-lauroylsarcosineSigma97-78-9
Opti-MEM Reduced Serum MediumThermo Fisher Scientific31985070
PES syringe filterBASIX13-1001-07
Protease Inhibitor Cocktail TabletRoche Diagnostic11836145001
pSpCas9(BB)-2A-PuroAddgene62988
Q5 High-Fidelity DNA PolymeraseNew England BioLabs Inc.M0491S
Q5 Reaction BufferNew England BioLabs Inc.B9027S
Quick-DNA MiniprepZYMO ResearchD3025
Quick-RNA MiniprepZYMO ResearchR1054
Restriction enzyme bufferNew England BioLabs Inc.B7203S
RT-qPCR Detection SystemThermo Fisher ScientificQuant Studio3
SDSThermo Fisher ScientificBP359-500
SonicatorQsonicaQ800R2
Sso Advanced Universal SYBR Green SupermixBio-Rad Laboratories1725274
Stbl3 competent cellThermo Fisher ScientificC7373-03
Superscript IV reverse transcriptThermo Fisher Scientific719000
Surveyor Mutation Detection KitsIntegrated DNA Technologies706020
T4 DNA LigaseNew England BioLabs Inc.M0202S
T4 DNA Ligase Reaction BufferNew England BioLabs Inc.B0202S
TE bufferThermo Fisher Scientific46009CM
Thermal cyclerBio-Rad LaboratoriesT100
ThermomixerSigma5384000020
ZeocinThermo Fisher Scientificant-zn-1p

Referências

  1. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  2. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
  3. Kundaje, A., et al. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  4. Andersson, R., et al. An atlas of active enhancers across human cell types and tissues. Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).
  5. Heinz, S., Romanoski, C. E., Benner, C., Glass, C. K. The selection and function of cell type-specific enhancers. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (3), 144-154 (2015).
  6. Ong, C. T., Corces, V. G. Enhancer function: new insights into the regulation of tissue-specific gene expression. Nature Reviews Genetics. 12 (4), 283-293 (2011).
  7. Hnisz, D., et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell. 155 (4), 934-947 (2013).
  8. Grossman, S. R., et al. Systematic dissection of genomic features determining transcription factor binding and enhancer function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1291-1300 (2017).
  9. Kim, T. K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465 (7295), 182-187 (2010).
  10. Li, W., Notani, D., Rosenfeld, M. G. Enhancers as non-coding RNA transcription units: recent insights and future perspectives. Nature Reviews Genetics. 17 (4), 207-223 (2016).
  11. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  12. Li, W., et al. Functional roles of enhancer RNAs for oestrogen-dependent transcriptional activation. Nature. 498 (7455), 516-520 (2013).
  13. Lee, J. H., Xiong, F., Li, W. Enhancer RNAs in cancer: regulation, mechanisms and therapeutic potential. RNA Biology. , 1-10 (2020).
  14. Sur, I., Taipale, J. The role of enhancers in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (8), 483-493 (2016).
  15. Zhang, Z., et al. Transcriptional landscape and clinical utility of enhancer RNAs for eRNA-targeted therapy in cancer. Nature Communications. 10 (1), 4562 (2019).
  16. Chen, H., et al. A Pan-Cancer Analysis of Enhancer Expression in Nearly 9000 Patient Samples. Cell. 173 (2), 386-399 (2018).
  17. Kopp, F., Mendell, J. T. Functional Classification and Experimental Dissection of Long Noncoding RNAs. Cell. 172 (3), 393-407 (2018).
  18. Lubelsky, Y., Ulitsky, I. Sequences enriched in Alu repeats drive nuclear localization of long RNAs in human cells. Nature. 555 (7694), 107-111 (2018).
  19. Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
  20. Beerli, R. R., Segal, D. J., Dreier, B., Barbas, C. R. Toward controlling gene expression at will: specific regulation of the erbB-2/HER-2 promoter by using polydactyl zinc finger proteins constructed from modular building blocks. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (25), 14628-14633 (1995).
  21. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  22. Hirai, H., Tani, T., Kikyo, N. Structure and functions of powerful transactivators: VP16, MyoD and FoxA. International Journal of Developmental Biology. 54 (11-12), 1589-1596 (2010).
  23. Lim, F., Spingola, M., Peabody, D. S. Altering the RNA binding specificity of a translational repressor. Journal of Biological Chemistry. 269 (12), 9006-9010 (1994).
  24. Schmitz, M. L., Baeuerle, P. A. The p65 subunit is responsible for the strong transcription activating potential of NF-kappa B. EMBO Journal. 10 (12), 3805-3817 (1991).
  25. Vihervaara, A., Sistonen, L. HSF1 at a glance. Journal of Cell Science. 127, 261-266 (2014).
  26. Core, L. J., et al. Analysis of nascent RNA identifies a unified architecture of initiation regions at mammalian promoters and enhancers. Nature Genetics. 46 (12), 1311-1320 (2014).
  27. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
  28. . Benchling [Biology Software] Available from: https://benchling.com (2020)
  29. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
  30. Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nature Biotechnology. , (2020).
  31. Nageshwaran, S., et al. CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems. Journal of Visualized Experiments. (140), e57998 (2018).
  32. Al-Allaf, F. A., Tolmachov, O. E., Zambetti, L. P., Tchetchelnitski, V., Mehmet, H. Remarkable stability of an instability-prone lentiviral vector plasmid in Escherichia coli Stbl3. 3 Biotech. 3 (1), 61-70 (2013).
  33. Qiu, P., et al. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
  34. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  35. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
  36. Quick-DNA Miniprep Kit. ZYMO Available from: https://files.zymoresearch.com/protocols/_d3024_d3025_quick-dna_miniprep_kit.pdf (2020)
  37. SURVEYOR Mutation Detection Kit. IDT Available from: https://sfvideo.blob.core.windows.net/sitefinity/docs/default-source/user-guide-manual/surveyor-kit-for-gel-electrophoresis-user-guide.pdf?sfvrsn=a9123407_6 (2020)
  38. Quick-RNA Miniprep Kit. ZYMO Available from: https://files.zymoresearch.com/protocols/_r1054_r1055_quick_rna_miniprep_kit.pdf (2020)
  39. SuperScript IV Reverse Transcriptase Product Manual. Thermo Fisher Scientific Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/SSIV_Reverse_Transcriptase_UG.pdf (2020)
  40. Ounzain, S., et al. Functional importance of cardiac enhancer associated noncoding RNAs in heart development and disease. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 76, 55-70 (2014).
  41. McCleland, M. L., et al. CCAT1 is an enhancer-templated RNA that predicts BET sensitivity in colorectal cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 639-652 (2016).
  42. Miao, Y., et al. Enhancer-associated long non-coding RNA LEENE regulates endothelial nitric oxide synthase and endothelial function. Nature Communications. 9 (1), 292 (2018).

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