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Résumé

Les ARN amplificateurs (ARNe) sont des ARN non codants produits à partir d’amplificateurs actifs. Une approche optimale pour étudier les fonctions des ARNe consiste à manipuler leurs niveaux dans les régions natives de la chromatine. Ici, nous introduisons un système robuste pour les études d’ARNe en utilisant des activateurs transcriptionnels fusionnés à CRISPR-dCas9 pour induire l’expression d’ARNe d’intérêt.

Résumé

Les amplificateurs sont des éléments génomiques essentiels disséminés dans le génome des mammifères et dictent des programmes d’expression génique spécifiques aux tissus. De plus en plus de preuves ont montré que les amplificateurs fournissent non seulement des motifs de liaison à l’ADN pour les facteurs de transcription (TF), mais génèrent également des ARN non codants appelés ARNe. Des études ont démontré que les transcrits de l’ARNe peuvent jouer un rôle important dans la régulation des gènes, tant dans la physiologie que dans la maladie. Les méthodes couramment utilisées pour étudier la fonction des ARNe sont limitées à des approches de « perte de fonction » par l’inactivation des ARNe ou par l’inhibition chimique de la transcription de l’amplificateur. Il n’existe pas de méthode solide pour mener des études de « gain de fonction » sur les ARNe afin d’imiter des maladies spécifiques telles que le cancer humain, où les ARNe sont souvent surexprimés. Ici, nous présentons une méthode permettant d’activer avec précision et robustesse les ARNe pour l’interrogation fonctionnelle de leurs rôles en appliquant le système de médiateurs d’activation synergique (SAM) médiés par dCas9. Nous présentons l’ensemble du flux de travail de l’activation des ARNe, de la sélection des ARNe, de la conception des ARNg à la validation de l’activation des ARNe par RT-qPCR. Cette méthode représente une approche unique pour étudier les rôles d’un ARNe particulier dans la régulation des gènes et le développement de la maladie. De plus, ce système peut être utilisé pour le criblage CRISPR non biaisé afin d’identifier les cibles d’ARNe à base de phénotypes dans le contexte d’une maladie spécifique.

Introduction

Le génome humain contient une constellation d’éléments régulateurs 1,2,3. Parmi ceux-ci, les amplificateurs apparaissent comme l’une des catégories les plus critiques 4,5,6. Les amplificateurs jouent un rôle essentiel dans la régulation du développement et sont responsables de la génération de programmes d’expression génique spatio-temporels pour déterminer l’identité cellulaire 5,6,7. Conventionnellement, les amplificateurs ne sont considérés que comme des éléments de l’ADN qui fournissent des motifs de liaison pour les facteurs de transcription (TF), qui contrôlent ensuite l’expression des gènes cibles 6,8. Cependant, une série d’études a révélé que de nombreux amplificateurs actifs transcrivent également des ARN amplificateurs non codants (c’est-à-dire des ARNe)4,9,10.

Il a été constaté que le niveau de transcription de l’ARNe était en corrélation avec l’activité d’un amplificateur 4,10. Les amplificateurs actifs produisent plus de transcrits d’ARNe et présentent des niveaux plus élevés de marqueurs épigénomiques associés à la transcription active, tels que H3K27ac et H3K4me1 9,11,12. Certaines études ont démontré que les transcrits d’ARNe peuvent jouer un rôle important dans l’activation transcriptionnelle des gènes cibles10,12. Un grand nombre d’ARNe ont été identifiés comme étant dérégulés dans les cancers humains 13,14,15,16, dont beaucoup présentaient une spécificité de type de cancer élevée et une pertinence clinique. Ces résultats offrent des opportunités que l’élucidation d’eRNA qui peuvent entraîner/promouvoir la tumorigenèse peut offrir de nouvelles cibles pour une intervention thérapeutique13,15.

Les méthodes actuelles d’étude des fonctions des ARNe sont presque exclusivement basées sur des stratégies d’inactivation qui utilisent de petits ARN interférents (siRNA), des ARN en épingle à cheveux courts (shRNA) ou des oligonucléotides antisens (ASOs, dont les acides nucléiques verrouillés (LNA) sont le type couramment utilisé dans la recherche)10,12,17. Cependant, les maladies humaines telles que le cancer présentent principalement une surexpression des ARNe par rapport à leurs tissus normaux adjacents15, exigeant des outils pour « surexprimer » les ARNe afin d’imiter leurs modèles d’expression pertinents pour la maladie pour les études fonctionnelles. Pour y parvenir, un système de surexpression ectopique basé sur un plasmide n’est pas optimal, car les sites exacts de début et de fin de la transcription des ARNe restent largement incertains. De plus, un système d’expression plasmidique peut modifier l’emplacement des ARNe, provoquant des artefacts potentiels de leurs fonctions18. Nous fournissons ici un protocole détaillé pour faciliter la caractérisation fonctionnelle des ARNe en renforçant leur « surexpression » dans le locus génomique natif de leur production (c’est-à-dire in situ), qui est basé sur le système CRISPR/dCas9-Synergistic Activation Mediators System (SAM).

Le système SAM a été initialement développé pour activer des gènes codants et de longs ARN non codants intergéniques (lincRNA) associés à la résistance aux inhibiteurs de BRAF dans les cellules de mélanome19. Contrairement à d’autres technologies d’activation CRISPR (CRISPRa), le système SAM consiste en une combinaison d’activateurs de transcription pour conférer une activation transcriptionnelle robuste des régions cibles. Ces activateurs comprennent : un Cas9 mort enzymatiquement (dCas9) fusionné avec VP64 (c’est-à-dire dCas9-VP64) ; un ARN guide contenant deux aptamères d’ARN MS2 et une protéine activatrice de fusion MS2-p65-HSF1. La présence des aptamères MS2 dans l’ARNg peut recruter la protéine de fusion MS2-p65-HSF1 à proximité des sites de liaison dCas9/ARNg. Parmi ceux-ci, VP64 est un tétramère modifié du domaine activateur transcriptionnel de l’herpès simplex VP16, dont il a été démontré qu’il active fortement la transcription des gènes en recrutant les facteurs de transcription généraux 20,21,22. La protéine de fusion MS2-p65-HSF1 se compose de trois parties. La première partie, la MS2-N55K, est une forme mutante de la protéine de liaison MS2 qui a une affinité plus forte23 ; les deux autres parties de cette protéine de fusion sont le domaine de transactivation de p65 et le facteur de choc thermique 1 (HSF1), qui sont tous deux des facteurs de transcription qui possèdent de forts domaines de transactivation et peuvent induire des programmes de transcription robustes24,25. Par conséquent, le système SAM a essentiellement créé un complexe d’activateur très puissant pour activer la transcription des gènes codants désignés et des lincRNAs19.

Protocole

L’ensemble du flux de travail de ce protocole est illustré à la figure 1.

1. Sélection de l’ARN amplificateur (eRNA)

  1. Identifiez une région d’intérêt potentielle en utilisant des pics de liaison de données de séquençage par immunoprécipitation de la chromatine (ChIP-Seq), c’est-à-dire des modifications d’histones (par exemple, H3K4me1 et H3K27ac), ou des coactivateurs de transcription (par exemple, p300).
  2. Identifiez l’eRNA d’intérêt en croisant le pic ChIP-Seq avec des signaux de RNA-seq (par exemple, à partir du RNA-seq total ou du RNA-seq naissant tel que le séquençage global (GRO-Seq).
    REMARQUE : La région choisie pour la conception des ARNg doit généralement être limitée à la région du « noyau d’amplification », où les TF ou les coactivateurs (par exemple, p300) ont montré des pics clairs de ChIP-seq (Figure 2A). Le dCas9 et ses coactivateurs de fusion seront recrutés par un ARNg dans cette région pour imiter la liaison native des coactivateurs (Figure 2A). Si des ensembles de données spécifiques tels que Cap Analysis of Gene Expression (CAGE)4 ou GRO-cap26 sont disponibles, ils peuvent être utilisés pour déterminer précisément le « noyau d’amplification », la région située entre deux sites de début de transcription des ARNe transcrits dans des directions opposées 4,10,26.

2. Conception de l’ARNg

  1. Utilisez des outils de conception d’ARNg CRISPR courants tels que CRISPOR27 pour sélectionner des ARNg à faible potentiel de ciblage (http://crispor.tefor.net/).
    REMARQUE : D’autres outils comme Benchling28 ou CHOPCHOP29 peuvent également être utilisés comme options supplémentaires pour la conception d’ARNg.
  2. Collez la séquence d’ADN du noyau de l’amplificateur dans la colonne Étape 1 du site Web CRISPOR, puis cliquez sur le bouton déroulant pour choisir le génome correspondant (par exemple, humain) dans la colonne Étape 2 . Cliquez sur le bouton déroulant pour définir la séquence PAM (Protospacer Adjacent Motif) comme « NGG » dans la colonne Étape 3 , puis cliquez sur le bouton « Soumettre » pour générer des séquences guides d’une durée de 20 pb.
  3. Choisissez des guides avec les scores de spécificité les plus élevés dans l’outil CRISPOR, c’est-à-dire un faible potentiel hors cible, puis ajoutez « CACCG » à l’extrémité 5' et « C » à l’extrémité 3', respectivement.
    REMARQUE : Sélectionnez les guides avec les scores de spécificité les plus élevés (>85 dans CRISPOR est préféré).
  4. Commandez des oligonucléotides pour chaque séquence sensorielle et antisens à partir de sources commerciales.
    REMARQUE : Des instructions supplémentaires sur la conception de l’ARNg CRISPR/Cas9 peuvent être trouvées dans d’autres études30,31. Les surplombs de l’étape 2.2 rendront l’ARNg compatible avec le squelette d’ARNg SAM (Addgene #61427), qui utilise l’enzyme de restriction BsmBI.

3. Cloner des ARNg dans une construction lentivirale

  1. Pour recuire les oligos, mélangez 1 μL de chaque oligo apparié à 100 μM, 1 μL de tampon de ligature 10x T4, 0,5 μL d’ADN Ligase T4 (400 000 unités/mL) et 6,5 μL de H2O pour atteindre un volume total de 10 μL. Incuber à 37 °C pendant 30 min, puis à 95 °C pendant 5 min, et descendre à 25 °C à 5 °C/min. Diluer à 100 μL à l’aide de H2O.
  2. Digérer le squelette de l’ARNg en mélangeant 2 μL de tampon d’enzyme de restriction (RE) 10x, 300 ng de plasmide de base lenti_gRNA(MS2)_zeo (Addgene #61427) dans 1 μL, 1 μL d’enzyme BsmBI et 16 μL de H2O pour atteindre un volume total de 20 μL. Incuber à 55 °C pendant 15 min.
  3. Mélangez les composants de ligature avec 20 μL de produit de digestion en ajoutant 2,5 μL de tampon de ligature 10x T4, 1 μL de produit de recuit dilué et 1,5 μL d’ADN ligase T4 (400 000 unités/mL) dans un système de 25 μL. Incuber à température ambiante pendant 30 min.
  4. Transformez 2 μL du mélange de ligature de l’étape 3.3 en cellules E.coli compétentes Stbl3. Dressez-les sur une plaque de gélose LB-gélose à l’ampicilline et incubez une nuit à 37 °C.
  5. Choisissez et inoculez une seule colonie bactérienne et extrayez le plasmide. Envoyez-le pour le séquençage de Sanger afin de confirmer que la séquence d’ARNg est correctement insérée.
    REMARQUE : Les séquences des amorces et des ARNg sont disponibles dans le tableau supplémentaire 1. Il est recommandé d’utiliser ici les cellules E.coli chimiquement compétentes Stbl3 car elles ont un rendement en ADN plasmidique plus élevé et une stabilité plasmidique plus élevée lors de la génération de plasmides lentivirus sujets à l’instabilité32.

4. Test d’efficacité de l’ARNg

REMARQUE : Bien que cela ne soit peut-être pas nécessaire pour tous les ARNg, il est recommandé que les chercheurs examinent la qualité de l’ARNg en effectuant un test Surveyor (c’est-à-dire un test de clivage des mésappariements) pour détecter des indels ou des mutations qui ne peuvent être générées efficacement que par des ARNg de bonne qualité33,34. D’autres méthodes telles que le suivi des indels par décomposition (TIDE) peuvent également être utilisées pour déterminer l’efficacité de l’ARNg30,35. La nucléase Surveyor est un membre d’une famille d’endonucléases spécifiques aux mésappariements qui peuvent couper l’ADN double brin avec des mésappariements (Figure 3A). La qualité des ARNg peut être révélée par l’efficacité de la production d’espèces d’ADN plus petites. En pratique, l’efficacité de la coupe du géomètre peut également être affectée par l’efficacité de transfection des ARNg et de Cas9.

  1. ARNg transfectif avec le plasmide pSpCas9(BB)-2A-Puro (Addgene #62988) qui exprime la protéine Cas9 dans 293 cellules T à l’aide d’un réactif de transfection à base de lipides. Utilisez 1,2 μg/mL pour chaque plasmide par puits dans une plaque à 6 puits. Continuez à cultiver les cellules pendant 3 jours après la transfection. Récoltez et extrayez l’ADN génomique selon le protocole du fabricant36.
  2. Utilisez la réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour amplifier la région d’amplification ciblée à partir de l’ADN génomique. Utilisez les conditions de PCR indiquées dans le tableau supplémentaire 2. Utilisez les amorces du tableau supplémentaire 1 pour un exemple d’exhausteur, NET1e. Dénaturer les produits de PCR en les incubant à 95 °C pendant 10 min, et les réhybrider en les réduisant de 95 °C à 25 °C à la vitesse de -0,3 °C/s pour permettre à l’ADN monocaténaire (ADNsb) avec et sans indels ou mutations induits par l’ARNg de se recuire les uns aux autres.
  3. Digérer l’ADN hybridé par la nucléase Surveyor (Figure 3A) selon le protocole37 du fabricant. Mélangez 400 ng d’ADN hybridé de l’étape 4.2, 1 μL de nucléase Surveyor, 1 μL d’amplificateur Surveyor et 5 μL de 0,15 M MgCl2 dans un système de 50 μL. Incuber à 42 °C pendant 60 min. Analysez l’ADN sur un gel d’agarose. Utilisez des témoins négatifs, tels que des cellules avec Cas9 uniquement mais sans cibler les ARNg, dans le test et l’électrophorèse sur gel (Figure 3B).

5. Génération de lentivirus

  1. Ajoutez psPAX2, pMD2.G et un plasmide cible (par exemple, lenti_dCas9-VP64_Blast, Addgene #61425 ; ou lenti_MS2-p65-HSF1_Hygro, Addgene #61426) dans un rapport de 3 μg : 1 μg : 4 μg dans un tube en polypropylène de 1,5 mL. Mélangez-les avec 500 μL d’Opti-MEM et incubez pendant 5 min à température ambiante.
  2. Dans un tube séparé, mettez 10 μL de réactif de transfection à base de lipides dans 500 μL d’Opti-MEM, et incubez pendant 5 min à température ambiante.
  3. Combinez les produits des étapes 5.1 et 5.2 et incubez pendant 20 min à température ambiante.
  4. Plaquez les cellules 293T un jour avant la transfection et laissez-les atteindre une confluence de ~30 % dans une boîte de 10 cm au moment de la transfection. Ajoutez 4 ml de milieu régulier (DMEM avec 10 % de FBS), puis ajoutez le complexe de l’étape 5.3 goutte à goutte aux cellules. Ajoutez du DMEM avec 10 % de FBS pour porter le volume final à 6 ml. Incuber une nuit dans un incubateur cellulaire à 37 °C avec 5 % de CO2.
  5. Le lendemain, changez le milieu à 10 ml de nouveau DMEM avec 10 % de FBS. Récoltez le milieu 24 h après le changement de milieu. À l’aide d’un filtre à seringue (par ex. 0,45 μm), filtrez le milieu contenant le virus, puis passez à l’étape 6 ou stockez le virus à -80 °C.
    REMARQUE : Les opérations de lentivirus nécessitent une armoire de biosécurité de niveau II. Il faut faire preuve de prudence pour manipuler en toute sécurité les expériences associées au virus ; Et si un récipient est en contact direct avec le milieu viral, il doit être blanchi pendant plus de 20 minutes avant d’être éliminé en tant que risque biologique.

6. Culture cellulaire

  1. Maintenir les cellules dans un incubateur de culture cellulaire de CO2 à 37 °C avec 5 % de CO2.
  2. Cultivez des cellules MCF7 et 293T dans un milieu DMEM (Modified Eagle Medium) de Dulbecco avec 10 % de FBS.
  3. Cultivez les cellules dans des boîtes de 10 cm et divisez-les selon un rapport de 1:3 à 1:5 lorsqu’elles sont confluentes.

7. Infection et sélection cellulaire

  1. Ensemencer les cellules cibles (p. ex., MCF7) directement dans un mélange de milieu viral contenant 0,5 mL de lenti_dCas9-VP64_Blast (Addgene #61425) et 0,5 mL de lenti_MS2-p65-HSF1_Hygro (Addgene #61426). Ajouter 8 μg/mL de bromure d’hexadiméthrine pour augmenter l’efficacité de l’infection. Utilisez un puits de cellules non infectées comme contrôle négatif pour examiner l’efficacité de la sélection d’antibiotiques.
    REMARQUE : La quantité de milieu viral recommandée est la suivante : 6 mL de milieu viral pour une parabole de 10 cm, 1 mL pour un puits d’une plaque à 6 puits et 0,5 mL pour un puits d’une assiette à 12 puits.
  2. 24 h après l’infection, ajouter aux cellules un milieu frais contenant de la blasticidine (5 μg/mL pour les cellules MCF7) et de l’hygromycine (200 μg/mL pour les cellules MCF7).
  3. Conservez les cellules dans un milieu de sélection d’antibiotiques jusqu’à ce que les cellules de contrôle négatives meurent.
    REMARQUE : Le temps peut varier pour que différentes lignées cellulaires deviennent stables. Pour le MCF7, il faut généralement 5 à 7 jours pour que les cellules non infectées meurent complètement. Une courbe de destruction utilisant une gamme de concentrations d’antibiotiques devrait être testée pour une nouvelle lignée cellulaire avant les expériences. Il est acceptable d’utiliser un mélange cellulaire pour les étapes suivantes, mais une alternative consiste à choisir des colonies unicellulaires homogènes en termes d’expression des deux protéines effectrices. La lignée stable obtenue est appelée lignée parentale SAM-effecteur (par exemple, la lignée SAM-effecteur MCF7) dans cet article. Il est recommandé d’utiliser une lignée cellulaire parentale SAM-effecteur partagée pour l’infection par différents ARNg ciblant ou non ciblant, surtout si leurs effets seront comparés.
  4. Utilisez le western blot pour déterminer si les cellules expriment de manière stable les deux protéines effectrices (un exemple est montré à la figure 4A). Utilisez la transcription inverse des ARN totaux suivie d’une PCR quantitative (RT-qPCR) comme méthode alternative pour examiner les niveaux d’expression des deux ARNm (dCas9-VP64 et MS2-p65-HSF1, Figure 4B).
    REMARQUE : Des amorces pour l’examen des niveaux d’ARNm des deux effecteurs dCas9 sont disponibles dans le tableau supplémentaire 1.
  5. Générer un lentivirus à partir d’ARNg construit à l’étape 3.5 et infecter la lignée cellulaire stable SAM exprimant en double dCas9-VP64 et MS2-p65-HSF1 avec un lentivirus à ARNg individuel. Ajouter Zeocin (100 μg/mL pour les cellules MCF7) au milieu 24 heures après la transduction virale de l’ARNg. Générer un contrôle négatif qui exprime l’ARNg non ciblé (ARNg-NT) dans la lignée cellulaire SAM parentale.
    REMARQUE : Assurez-vous que le médicament de sélection est spécifique pour le construit d’intérêt.

8. Extraction d’ARN et RT-PCR quantitative pour examiner les niveaux d’ARNe

  1. Extrayez les ARN totaux des lignées cellulaires SAM exprimant soit l’ARNg NT, soit les ARNg ciblés à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN38 ou d’une autre méthode à base de phénol chloroforme. Utilisez des cellules de ~80 % de confluence dans un puits d’une plaque à six puits pour l’extraction de l’ARN.
    REMARQUE : Aucune différence significative n’a été observée dans notre pratique pour la détection des ARNe lorsque les ARN sont extraits soit par des colonnes de liaison commerciales, soit par des réactifs de phénol chloroforme.
  2. Fabriquer de l’ADN complémentaire (ADNc) à partir de l’ARN purifié par réaction de transcription inverse avec un hexamère aléatoire, en suivant le protocole39 du fabricant. Conditions d’utilisation dans le tableau supplémentaire 2.
    REMARQUE : Étant donné que la majorité des ARNe sont des 1,2,4,9,10 non polyadénylés, l’hexamère aléatoire est couramment utilisé pour la génération d’ADNc.
  3. Concevez des amorces pour la mesure par RT-qPCR d’eRNs cibles à l’aide d’un outil de conception d’amorces réputé (par exemple, Primer 3). Testez la linéarité d’amplification des paires d’amorces en examinant si les amorces amplifieront linéairement les ADNc dilués en série et montreront les différences de cycle qPCR attendues. Conditions d’utilisation dans le tableau supplémentaire 2.
    REMARQUE : Les amorces pour la RT-qPCR doivent cibler la région hautement transcrite dans le séquençage de l’ARN naissant, et le test de linéarité des amorces doit inclure une large gamme de dilutions de l’ADNc pour s’assurer que tous les niveaux d’ARNe éventuellement rencontrés sont testés. Un exemple de test de linéarité est illustré à la figure 5A.
  4. Effectuez une RT-qPCR et analysez les niveaux d’expression de l’ARNe dans les cellules témoins (lignée cellulaire SAM avec NT-gRNA) et dans la lignée cellulaire SAM avec des ARNg ciblant l’eRNA (par exemple, NET1e gRNA#1) (par exemple, Figure 6A). Les amorces de l’ARN NET1e sont présentées dans le tableau supplémentaire 1. Conditions d’utilisation dans le tableau supplémentaire 2.  

9. dCas9 ChIP et qPCR

REMARQUE : Cette étape est une expérience facultative permettant de valider la liaison du complexe dCas9/SAM-gRNA à l’amplificateur cible par les ARNg spécifiques. Bien qu’il soit encouragé les utilisateurs à effectuer cette étape, il n’est pas nécessaire de tester chaque ARNg. Reportez-vous à un exemple illustré à la figure 5B. Reportez-vous aux amorces énumérées dans le tableau supplémentaire 1.

  1. Cellules de réticulation
    1. Retirez le milieu des cellules et ajoutez 1 % de formaldéhyde dissous dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Laisser agir 10 min.
    2. Ajoutez 2,5 M de glycine à un volume de 1:20 pour étancher la réticulation et lavez les cellules deux fois avec du PBS glacé. Ajoutez 700 μL de PBS glacé et grattez les cellules dans un tube de 1,5 ml.
    3. Centrifugeuse à 2 000 x g pendant 5 min à 4 °C. Passez à l’étape 9.2 ou congelez-le et rangez-le à -80 °C.
  2. Sonicate
    1. Préparez de nouveaux tampons LB1, LB2 et LB3. LB1 : 50 mM d’Hepes-KOH (pH 7,5), 140 mM de NaCl, 1 mM d’EDTA, 10 % de glycérol, 0,5 % de NP-40, 0,25 % de Triton-X 100 et 1x inhibiteur de protéase. LB2 : 10 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 200 mM de NaCl, 1 mM d’EDTA, 0,5 mM d’EGTA et 1x inhibiteur de protéase. LB3 : 10 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM de NaCl, 1 mM d’EDTA, 0,5 mM d’EGTA, 0,1 % de Na-désoxycholate, 0,5 % de N-lauroylsarcosine et 1x inhibiteur de protéase. Complétez 1x inhibiteur de protéase fraîchement dans le tampon avant l’expérience.
    2. Ajouter 1 mL de tampon LB1 aux pastilles de cellules, bien pipeter, tourner à 4 °C pendant 10 min et tourner à 2 000 x g pendant 5 min à 4 °C. Videz le surnageant, ajoutez 1 mL de tampon LB2, tournez à 4 °C pendant 10 min et tournez à 2 000 x g pendant 5 min à 4 °C. Videz le surnageant et retirez l’excédent de tampon LB2. Ajouter 300 μL de tampon LB3.
    3. Sonicate et fragmente l’ADN de la chromatine à une taille moyenne de ~200-400 pb à l’aide d’un système de sonicateur approprié. Après la sonication, ajoutez 30 μL de Triton-X 100 à 10 % et mélangez bien. Testez le temps de sonication approprié si une nouvelle lignée cellulaire est utilisée.
    4. Centrifuger à 14 000 x g pour retirer la pastille. Transférez le surnageant dans le nouveau tube et ajoutez 630 μL de LB3 et 70 μL de Triton X-100 à 10 % pour obtenir un volume total de 1 mL. Ajouter 2 μg de l’anticorps Cas9 au surnageant et faire pivoter à 4 °C pendant la nuit.
  3. Capture immuno-complexe et réticulation inverse
    1. Préparez le tampon RIPA (50 mM HEPES pH 7,6, 1 mM EDTA, 0,7 % de Na-désoxycholate, 1 % de NP-40, 0,5 M de LiCl) et le tampon d’élution (1 % de SDS et 0,1 M de NaHCO3).
    2. Lavez les dynabeads de protéine G avec 1 % de BSA dans PBS 3 fois et le tampon LB3 une fois.
    3. Ajouter 30 μL de dynabilles de protéine G à l’échantillon et incuber à 4 °C pendant 4 h.
    4. Laver les billes du complexe immunologique dans 500 μL de tampon RIPA 6x. Ne laissez pas les perles se dessécher.
    5. Lavez les billes-immuno-complexe une fois avec le tampon TE ; Retirez la mémoire tampon.
    6. Ajouter 200 μL de tampon d’élution au complexe immuno-billes et au vortex ; puis placez-le dans un agitateur chauffé réglable en température réglé à 65 °C avec une agitation de 600 tr/min pendant 6 à 16 h pour inverser la réticulation.
  4. Extraction de l’ADN
    1. Retirez les tubes de l’agitateur, faites tourner brièvement les perles et placez-les sur un support magnétique. Transférez 200 μL de surnageant dans un tube frais et ajoutez 200 μL de tampon TE.
    2. Ajouter 1 μL de RNase A (1 mg/mL) dans le tube et incuber à 37 °C pendant 1 h.
    3. Après 1 h d’incubation, ajouter 2 μL de protéinase K (20 mg/mL) à l’échantillon et l’incuber à 65 °C pendant 2 h.
    4. Centrifuger brièvement et ajouter 400 μL de mélange phénol-chloroforme-alcool isoamylique. Bien mélanger, puis centrifuger 5 min à 10 000 x g.
    5. Déplacer 400 μL de la couche supérieure dans un tube de 1,7 mL contenant 16 μL de 5 M de NaCl et 1 μL de glycogène (20 μg/μL) et bien mélanger.
    6. Ajouter 800 μL d’éthanol à 100 % et laisser reposer toute la nuit à -20 °C.
    7. Le lendemain matin, centrifugez les tubes à 4 °C à 14 000 x g pendant 15 min.
    8. Retirez le surnageant et lavez la pastille avec 1 ml d’éthanol à 70 %. Essorage à 14 000 x g pendant 10 min.
    9. Retirer l’éthanol, sécher les granules à l’air libre et les remettre en suspension dans 50 μL d’ÉT (10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM d’EDTA).
  5. Effectuez une ChIP-qPCR pour examiner le recrutement du complexe SAM sur le site de ciblage par une paire d’amorces de ciblage de noyau d’enhancer. Utilisez une paire d’amorces ciblant une région non pertinente comme contrôle négatif.

10. Test de croissance cellulaire et autres tests fonctionnels de suractivation de l’ARNe

  1. Trypsinisez les lignées cellulaires SAM exprimant l’ARNg non ciblé ou les ARNe ciblant l’ARNe et mettez en plaque ~3 000 cellules par puits dans une plaque de 96 puits.
  2. Mesurez la croissance cellulaire à l’aide d’un imageur de cellules vivantes ou d’autres méthodes (p. ex., comptage cellulaire ou dosage du sel de tétrazolium-1 soluble dans l’eau).
  3. Utilisez la concentration inhibitrice demi-maximale (IC50) pour tester les réponses cellulaires à des médicaments anticancéreux spécifiques dans des cellules avec ou sans surexpression de NET1e par SAM15.
    REMARQUE : Les résultats des tests de croissance cellulaire et des tests de sensibilité aux médicaments des cellules cancéreuses du sein sont présentés après surexpression d’un ARNe transcrit à côté du gène NET1 , appelé NET1e15. D’autres tests peuvent être effectués au niveau cellulaire ou de l’organisme en fonction des besoins de chaque projet spécifique.

Résultats

La figure 1 illustre le flux de travail global de ce protocole. Nous nous sommes concentrés sur un ARNe représentatif, NET1e15, qui est surexprimé dans le cancer du sein, pour lequel le système SAM a été utilisé pour activer et étudier son rôle biologique dans la régulation de l’expression des gènes, la prolifération cellulaire et la réponse aux médicaments anticancéreux. Pour cet amplificateur NET1 ...

Discussion

Sur la base de nos données, nous concluons que le système SAM est adapté à l’étude du rôle des ARNe dans la régulation des phénotypes cellulaires, par exemple, la croissance cellulaire ou la résistance aux médicaments. Cependant, une conception minutieuse de l’ARNg est nécessaire pour une activation robuste de l’ARNe, pour les raisons suivantes. Tout d’abord, le site de début de transcription (TSS) de l’ARNe dans chaque lignée/type cellulaire spécifique reste moin...

Déclarations de divulgation

Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles de l’Institut de prévention et de recherche sur le cancer du Texas.

Remerciements

Ce travail est soutenu par des subventions à W.L (Cancer Prevention and Research Institute of Texas, CPRIT RR160083 et RP180734 ; NCI K22CA204468 ; NIGMS R21GM132778 ; le prix UT Stars de l’Université du Texas ; et la fondation Welch AU-2000-20190330) et une bourse postdoctorale à J.L (UTHealth Innovation for Cancer Prevention Research Training Program, Post-doctoral Fellowship, CPRIT RP160015). Nous reconnaissons la publicationoriginale 15 d’où certaines de nos figurines actuelles ont été adoptées (avec des modifications), qui suit la licence Creative Commons (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
BlasticidinGoldbioB-800-100
BsmBI restriction enzymeNew England BioLabs Inc.R0580S
Cas9 mAbActive Motif61757Lot: 10216001
Deoxynucleotide (dNTP) Solution MixNew England BioLabs Inc.N0447S
Dulbecco’s Modified Eagle MediumCorning10-013-CM
Dynabeads Protein GThermo Fisher Scientific65002
EDTAThermo Fisher ScientificBP118-500
EGTASigmaE3889
Fetal Bovine SerumGenDEPOTF0900-050
GlycogenThermo Fisher Scientific10814010
Hepes-KOHThermo Fisher ScientificBP310-100
Hexadimethrine BromideSigmaH9268
Hygromycin BGoldbioH-270-25
IGEPAL CA630SigmaD6750
IncuCyte live-cell imagerEssen BioScienceIncuCyte S3 Live-Cell Analysis System
lenti_dCAS-VP64_BlastAddgene61425
lenti_gRNA(MS2)_zeo backboneAddgene61427
lenti_MS2-p65-HSF1_HygroAddgene61426
LiCLSigmaL9650
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668-500
NaClSigmaS3014
Na-DeoxycholateSigmaD6750
NaHCO3Thermo Fisher ScientificBP328-500
N-lauroylsarcosineSigma97-78-9
Opti-MEM Reduced Serum MediumThermo Fisher Scientific31985070
PES syringe filterBASIX13-1001-07
Protease Inhibitor Cocktail TabletRoche Diagnostic11836145001
pSpCas9(BB)-2A-PuroAddgene62988
Q5 High-Fidelity DNA PolymeraseNew England BioLabs Inc.M0491S
Q5 Reaction BufferNew England BioLabs Inc.B9027S
Quick-DNA MiniprepZYMO ResearchD3025
Quick-RNA MiniprepZYMO ResearchR1054
Restriction enzyme bufferNew England BioLabs Inc.B7203S
RT-qPCR Detection SystemThermo Fisher ScientificQuant Studio3
SDSThermo Fisher ScientificBP359-500
SonicatorQsonicaQ800R2
Sso Advanced Universal SYBR Green SupermixBio-Rad Laboratories1725274
Stbl3 competent cellThermo Fisher ScientificC7373-03
Superscript IV reverse transcriptThermo Fisher Scientific719000
Surveyor Mutation Detection KitsIntegrated DNA Technologies706020
T4 DNA LigaseNew England BioLabs Inc.M0202S
T4 DNA Ligase Reaction BufferNew England BioLabs Inc.B0202S
TE bufferThermo Fisher Scientific46009CM
Thermal cyclerBio-Rad LaboratoriesT100
ThermomixerSigma5384000020
ZeocinThermo Fisher Scientificant-zn-1p

Références

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