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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Enhancer-RNAs (eRNAs) sind nicht-kodierende RNAs, die aus aktiven Enhancern hergestellt werden. Ein optimaler Ansatz zur Untersuchung der eRNA-Funktionen besteht darin, ihre Spiegel in den nativen Chromatinregionen zu manipulieren. Hier stellen wir ein robustes System für eRNA-Studien vor, bei dem CRISPR-dCas9-fusionierte transkriptionelle Aktivatoren verwendet werden, um die Expression von eRNAs von Interesse zu induzieren.

Zusammenfassung

Enhancer sind zentrale genomische Elemente, die über das Genom von Säugetieren verstreut sind und gewebespezifische Genexpressionsprogramme vorgeben. Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass Enhancer nicht nur DNA-Bindungsmotive für Transkriptionsfaktoren (TFs) liefern, sondern auch nicht-kodierende RNAs erzeugen, die als eRNAs bezeichnet werden. Studien haben gezeigt, dass eRNA-Transkripte eine wichtige Rolle bei der Genregulation sowohl in der Physiologie als auch bei der Krankheit spielen können. Häufig verwendete Methoden zur Untersuchung der Funktion von eRNAs sind auf "Loss-of-Function"-Ansätze durch Knockdown von eRNAs oder durch chemische Hemmung der Enhancer-Transkription beschränkt. Bisher gab es keine robuste Methode zur Durchführung von "Gain-of-Function"-Studien von eRNAs, um bestimmte Krankheitszustände wie Krebs beim Menschen nachzuahmen, bei denen eRNAs oft überexprimiert werden. Hier stellen wir eine Methode zur präzisen und robusten Aktivierung von eRNAs für die funktionelle Abfrage ihrer Rollen vor, indem wir das dCas9-vermittelte synergistische Aktivierungsmediatoren (SAM) System anwenden. Wir stellen den gesamten Workflow der eRNA-Aktivierung vor, von der Auswahl der eRNAs, dem Design der gRNAs bis hin zur Validierung der eRNA-Aktivierung mittels RT-qPCR. Diese Methode stellt einen einzigartigen Ansatz dar, um die Rolle einer bestimmten eRNA bei der Genregulation und Krankheitsentwicklung zu untersuchen. Darüber hinaus kann dieses System für ein unvoreingenommenes CRISPR-Screening eingesetzt werden, um phänotyp-treibende eRNA-Ziele im Kontext einer bestimmten Krankheit zu identifizieren.

Einleitung

Das menschliche Genom enthält eine Konstellation von regulatorischen Elementen 1,2,3. Unter diesen stellen sich Enhancer als eine der kritischsten Kategorien heraus 4,5,6. Enhancer spielen eine wesentliche Rolle bei der Regulierung der Entwicklung und sind verantwortlich für die Generierung räumlich-zeitlicher Genexpressionsprogramme zur Bestimmung der Zellidentität 5,6,7. Herkömmlicherweise werden Enhancer nur als DNA-Elemente angesehen, die Bindungsmotive für Transkriptionsfaktoren (TFs) liefern, die dann die Zielgenexpression steuern 6,8. Eine Reihe von Studien ergab jedoch, dass viele aktive Enhancer auch nicht-kodierende Enhancer-RNAs (d. h. eRNAs) transkribieren4,9,10.

Es wurde festgestellt, dass das Ausmaß der eRNA-Transkription mit der Aktivität eines Enhancers korreliert 4,10. Aktive Enhancer produzieren mehr eRNA-Transkripte und weisen einen höheren Gehalt an Epigenommarkern auf, die mit aktiver Transkription assoziiert sind, wie z. B. H3K27ac und H3K4me1 9,11,12. Einige Studien haben gezeigt, dass eRNA-Transkripte eine wichtige Rolle bei der transkriptionellen Aktivierung von Zielgenen spielenkönnen 10,12. Es wurde festgestellt, dass eine große Anzahl von eRNAs bei menschlichen Krebserkrankungendereguliert ist 13,14,15,16, von denen viele eine hohe Spezifität und klinische Relevanz für Krebsarten aufwiesen. Diese Ergebnisse bieten Möglichkeiten, dass die Aufklärung von eRNAs, die die Tumorgenese antreiben/fördern können, neue Ziele für therapeutische Interventionen bietenkann 13,15.

Aktuelle Methoden zur Untersuchung von eRNA-Funktionen basieren fast ausschließlich auf Knockdown-Strategien, bei denen kleine Interferenz-RNAs (siRNAs), kurze Hairpin-RNAs (shRNAs) oder Antisense-Oligonukleotide (ASOs, von denen gesperrte Nukleinsäuren (LNAs) der in der Forschung häufig verwendete Typ sind) verwendet werden10,12,17. Menschliche Krankheiten wie Krebs zeigen jedoch überwiegend eine Überexpression von eRNAs im Vergleich zu ihrem angrenzenden normalen Gewebe15, was Werkzeuge zur "Überexpression" von eRNAs erfordert, um ihre krankheitsrelevanten Expressionsmuster für funktionelle Studien nachzuahmen. Um dies zu erreichen, ist ein Plasmid-basiertes ektopisches Überexpressionssystem nicht optimal, da die genauen Start- und Endpunkte der Transkription von eRNAs weitgehend unklar sind. Darüber hinaus kann ein Plasmidexpressionssystem die Position von eRNAs verändern, was zu potenziellen Artefakten ihrer Funktionen führt18. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, um die funktionelle Charakterisierung von eRNAs zu erleichtern, indem ihre "Überexpression" im nativen genomischen Locus ihrer Produktion (d.h. in situ) forciert wird, der auf dem CRISPR/dCas9-Synergistic Activation Mediators System (SAM) basiert.

Das SAM-System wurde ursprünglich für die Aktivierung kodierender Gene und langer intergener nicht-kodierender RNAs (lincRNAs) entwickelt, die mit BRAF-Inhibitor-Resistenz in Melanomzellen assoziiert sind19. Im Gegensatz zu anderen CRISPR-Aktivierungstechnologien (CRISPRa) besteht das SAM-System aus einer Kombination von Transkriptionsaktivatoren, um eine robuste transkriptionelle Aktivierung der Zielregionen zu gewährleisten. Zu diesen Aktivatoren gehören: ein enzymatisch totes Cas9 (dCas9), das mit VP64 fusioniert ist (d. h. dCas9-VP64); eine Guide-RNA, die zwei MS2-RNA-Aptamere und ein MS2-p65-HSF1-Fusionsaktivatorprotein enthält. Das Vorhandensein der MS2-Aptamere in der gRNA kann das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein in die Nähe von dCas9/gRNA-Bindungsstellen rekrutieren. Unter diesen ist VP64 ein manipuliertes Tetramer der Herpes-simplex-VP16-Transkriptionsaktivatordomäne, von der gezeigt wurde, dass sie die Gentranskription stark aktiviert, indem sie allgemeine Transkriptionsfaktoren rekrutiert 20,21,22. Das Fusionsprotein MS2-p65-HSF1 besteht aus drei Teilen. Der erste Teil, das MS2-N55K, ist eine mutierte Form des MS2-Bindungsproteins mit einer stärkeren Affinität23; Die beiden anderen Teile dieses Fusionsproteins sind die Transaktivierungsdomäne von p65 und der Hitzeschockfaktor 1 (HSF1), beides Transkriptionsfaktoren, die starke Transaktivierungsdomänen besitzen und robuste Transkriptionsprogramme induzieren können 24,25. Daher erzeugte das SAM-System im Wesentlichen einen hochpotenten Aktivatorkomplex, um die Transkription von designierten kodierenden Genen und lincRNAszu aktivieren 19.

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Protokoll

Der gesamte Arbeitsablauf dieses Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Auswahl der Enhancer-RNA (eRNA)

  1. Identifizieren Sie eine mutmaßliche Enhancer-Region von Interesse unter Verwendung von Bindungspeaks von Chromatin-Immunpräzipitationssequenzierungsdaten (ChIP-Seq), d. h. von Histonmodifikationen (z. B. H3K4me1 und H3K27ac) oder von Transkriptionskoaktivatoren (z. B. p300).
  2. Identifizieren Sie die interessierende eRNA, indem Sie den ChIP-Seq-Peak mit RNA-Seq-Signalen kreuzen (z. B. aus dem Gesamt-RNA-Seq oder aus naszierendem RNA-Seq wie Global Run-On Sequencing (GRO-Seq).
    HINWEIS: Die für das Design von gRNAs gewählte Region sollte in der Regel auf die "Enhancer-Core"-Region beschränkt werden, in der TFs oder Koaktivatoren (z. B. p300) klare ChIP-seq-Peaks zeigten (Abbildung 2A). Das dCas9 und seine Fusionskoaktivatoren werden von einer gRNA in diese Region rekrutiert, um die native Bindung von Koaktivatoren nachzuahmen (Abbildung 2A). Wenn spezifische Datensätze wie Cap Analysis of Gene Expression (CAGE)4 oder GRO-cap26 zur Verfügung stehen, können diese zur präzisen Bestimmung des "Enhancer-Kerns" verwendet werden, der Region zwischen zwei Transkriptionsstartstellen der in entgegengesetzte Richtungen transkribierten eRNAs 4,10,26.

2. gRNA-Design

  1. Verwenden Sie gängige CRISPR-gRNA-Design-Tools wie CRISPOR27 , um gRNAs mit geringem Off-Targeting-Potenzial (http://crispor.tefor.net/) auszuwählen.
    HINWEIS: Andere Werkzeuge wie Benchling28 oder CHOPCHOP29 können ebenfalls als zusätzliche Optionen für das gRNA-Design verwendet werden.
  2. Fügen Sie die DNA-Sequenz des Enhancer-Kerns in die Spalte Schritt 1 auf der CRISPOR-Website ein und klicken Sie dann auf die Dropdown-Schaltfläche, um das entsprechende Genom (z. B. Mensch) in der Spalte Schritt 2 auszuwählen. Klicken Sie auf die Dropdown-Schaltfläche, um die Protospacer Adjacent Motif (PAM)-Sequenz in der Spalte Schritt 3 auf "NGG" festzulegen, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche "Senden", um Hilfssequenzen mit einer Länge von 20 bp zu generieren.
  3. Wählen Sie Leitfäden mit den höchsten Spezifitätswerten im CRISPOR-Tool, d. h. mit geringem Off-Target-Potenzial, und fügen Sie dann "CACCG" am 5'-Ende bzw. "C" am 3'-Ende hinzu.
    HINWEIS: Wählen Sie die Leitfäden mit den höchsten Spezifitätswerten aus (>85 in CRISPOR wird bevorzugt).
  4. Bestellen Sie Oligonukleotide für jede Sense- und Antisense-Sequenz aus kommerziellen Quellen.
    HINWEIS: Zusätzliche Anweisungen zum CRISPR/Cas9-gRNA-Design finden Sie in anderen Studien30,31. Die Überhänge in Schritt 2.2 machen die gRNA kompatibel mit dem SAM gRNA-Rückgrat (Addgene #61427), das das BsmBI-Restriktionsenzym verwendet.

3. Klonen Sie gRNAs in ein lentivirales Konstrukt

  1. Um Oligos zu annealen, mischen Sie 1 μl jedes gepaarten Oligos bei 100 μM, 1 μl 10x T4-Ligationspuffer, 0,5 μl T4-DNA-Ligase (400.000 Einheiten/ml) und 6,5 μl H2O, um ein Gesamtvolumen von 10 μl zu erreichen. Inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 °C, dann 5 ΰC lang. und auf 25 °C bei 5 °C/min herunterfahren. Mit H2O auf 100 μl verdünnen.
  2. Verdauen Sie das gRNA-Rückgrat, indem Sie 2 μl 10x Restriktionsenzym (RE)-Puffer, 300 ng lenti_gRNA(MS2)_zeo Rückgratplasmid (Addgene #61427) in 1 μl, 1 μl BsmBI-Enzym und 16 μl H2O mischen, um ein Gesamtvolumen von 20 μl zu erreichen. 15 min bei 55 °C inkubieren.
  3. Mischen Sie die Ligationskomponenten mit 20 μl Aufschlussprodukt, indem Sie 2,5 μl 10x T4-Ligationspuffer, 1 μl verdünntes Glühprodukt und 1,5 μl T4-DNA-Ligase (400.000 Einheiten/ml) in ein 25-μl-System geben. 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  4. Transformieren Sie 2 μl der Ligationsmischung aus Schritt 3.3 in Stbl3-kompetente E.coli-Zellen . Auf einer Ampicillin-LB-Agar-Platte anrichten und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
  5. Entnehmen und impfen Sie eine einzelne Bakterienkolonie und extrahieren Sie das Plasmid. Senden Sie es zur Sanger-Sequenzierung, um zu bestätigen, dass die gRNA-Sequenz korrekt eingefügt wurde.
    HINWEIS: Die Sequenzen für die Primer und gRNAs sind in der ergänzenden Tabelle 1 verfügbar. Es wird empfohlen, hier Stbl3-E.coli-Zellen zu verwenden, da sie eine höhere Plasmid-DNA-Ausbeute und eine höhere Plasmidstabilität bei der Erzeugung von instabilitätsanfälligen Lentivirus-Plasmiden aufweisen32.

4. gRNA-Effizienztest

HINWEIS: Obwohl dies möglicherweise nicht für jede gRNA erforderlich ist, wird empfohlen, dass Forscher die Qualität der gRNA durch Durchführung eines Surveyor-Assays (d. h. eines Mismatch-Spaltungsassays) untersuchen, um Indels oder Mutationen nachzuweisen, die nur durch gRNAs guter Qualität effizient erzeugt werden können33,34. Andere Methoden, wie z. B. Tracking of Indels by Decomposition (TIDE), können ebenfalls zur Bestimmung der gRNA-Effizienz verwendet werden30,35. Die Surveyor-Nuklease gehört zu einer Familie von Mismatch-spezifischen Endonukleasen, die doppelsträngige DNA mit Mismatches schneiden können (Abbildung 3A). Die Qualität von gRNAs lässt sich an der Wirksamkeit der Herstellung kleinerer DNA-Spezies ablesen. In der Praxis kann die Wirksamkeit des Surveyor-Schneidens auch durch die Transfektionseffizienz von gRNAs und Cas9 beeinflusst werden.

  1. Transfect gRNA zusammen mit dem pSpCas9(BB)-2A-Puro (Addgen #62988) Plasmid, das das Cas9-Protein in 293T-Zellen exprimiert, unter Verwendung eines lipidbasierten Transfektionsreagenzes. Verwenden Sie 1,2 μg/ml für jedes Plasmid pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte. Kultivieren Sie die Zellen nach der Transfektion 3 Tage lang. Ernte und Extraktion genomischer DNA gemäß dem Protokoll des Herstellers36.
  2. Verwenden Sie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), um die Ziel-Enhancer-Region aus genomischer DNA zu amplifizieren. Verwenden Sie die PCR-Bedingungen, die in der ergänzenden Tabelle 2 aufgeführt sind. Verwenden Sie die Primer in der ergänzenden Tabelle 1 für ein Beispiel-Enhancer, NET1e. Denaturieren Sie die PCR-Produkte, indem Sie 10 Minuten lang bei 95 °C inkubieren, und rehybridisieren Sie sie, indem Sie von 95 °C auf 25 °C bei einer Geschwindigkeit von -0,3 °C/s herunterfahren, damit die Einzelstrang-DNA (ssDNA) mit und ohne gRNA-induzierte Indels oder Mutationen aneinander aneinander andocken kann.
  3. Verdau der hybridisierten DNA durch die Surveyor-Nuklease (Abbildung 3A) gemäß dem Protokoll des Herstellers37. Mischen Sie 400 ng hybridisierte DNA aus Schritt 4.2, 1 μl Surveyor-Nuklease, 1 μl Surveyor-Enhancer und 5 μl 0,15 M MgCl2 in einem 50-μl-System. Bei 42 °C 60 min inkubieren. Analysieren Sie die DNA auf einem Agarose-Gel. Verwenden Sie im Assay und in der Gelelektrophorese Negativkontrollen, z. B. Zellen mit nur Cas9, aber ohne Targeting auf gRNAs (Abbildung 3B).

5. Erzeugung von Lentiviren

  1. Fügen Sie psPAX2, pMD2.G und ein Zielplasmid (z. B. lenti_dCas9-VP64_Blast, Addgene #61425; oder lenti_MS2-p65-HSF1_Hygro, Addgene #61426) im Verhältnis 3 μg : 1 μg : 4 μg in ein 1,5-ml-Polypropylen-Röhrchen hinzu. Mischen Sie sie mit 500 μl Opti-MEM und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur.
  2. In ein separates Röhrchen werden 10 μl des lipidbasierten Transfektionsreagenzes in 500 μl Opti-MEM gegeben und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
  3. Die Produkte aus den Schritten 5.1 und 5.2 vermischen und 20 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  4. Platten Sie 293T-Zellen einen Tag vor der Transfektion und lassen Sie sie zum Zeitpunkt der Transfektion in einer 10-cm-Schale einen Konfluenz von ~30% erreichen. Fügen Sie 4 ml normales Medium (DMEM mit 10 % FBS) hinzu und geben Sie dann den Komplex aus Schritt 5.3 tropfenweise in die Zellen. Fügen Sie DMEM mit 10 % FBS hinzu, um das endgültige Volumen auf bis zu 6 ml zu erhöhen. Über Nacht in einem Zellinkubator bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubieren.
  5. Wechseln Sie am nächsten Tag das Medium auf 10 mL neues DMEM mit 10 % FBS. Ernten Sie das Medium 24 h nach dem Mediumwechsel. Verwenden Sie einen Spritzenvorsatzfilter (z. B. 0,45 μm), um das virushaltige Medium zu filtern, und fahren Sie dann mit Schritt 6 fort oder lagern Sie das Virus bei -80 °C.
    HINWEIS: Für den Betrieb von Lentiviren ist ein Schrank der BioSicherheitsstufe II erforderlich. Bei der sicheren Handhabung der virusassoziierten Experimente ist Vorsicht geboten. Und wenn ein Behälter direkten Kontakt mit dem Virusmedium hat, muss er mehr als 20 Minuten lang gebleicht werden, bevor er als biologische Gefahr entsorgt wird.

6. Zellkultur

  1. Halten Sie die Zellen in einem CO2 -Zellkultur-Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2.
  2. Kultur von MCF7- und 293T-Zellen in Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) Medium mit 10 % FBS.
  3. Züchten Sie die Zellen in 10-cm-Schalen und teilen Sie sie im Verhältnis 1:3 bis 1:5, wenn sie zusammenfließen.

7. Zellinfektion und Selektion

  1. Aussaat der Zielzellen (z. B. MCF7) direkt in einer Mischung aus viralem Medium, die 0,5 ml lenti_dCas9-VP64_Blast (Addgen #61425) und 0,5 ml lenti_MS2-p65-HSF1_Hygro (Addgen #61426) enthält. Fügen Sie 8 μg/ml Hexadimethrinbromid hinzu, um die Wirksamkeit der Infektion zu erhöhen. Verwenden Sie eine Vertiefung mit nicht infizierten Zellen als Negativkontrolle, um die Wirksamkeit der Antibiotikaauswahl zu untersuchen.
    HINWEIS: Die Menge des Virusmediums wird wie folgt empfohlen: 6 ml Virusmedium für eine 10-cm-Schale, 1 ml für eine Vertiefung einer 6-Well-Platte und 0,5 ml für eine Vertiefung einer 12-Well-Platte.
  2. 24 Stunden nach der Infektion wird den Zellen frisches Medium zugesetzt, das Blasticidin (5 μg/ml für MCF7-Zellen) und Hygromycin (200 μg/ml für MCF7-Zellen) enthält.
  3. Bewahren Sie die Zellen in einem Antibiotika-Selektionsmedium auf, bis die negativen Kontrollzellen absterben.
    HINWEIS: Es kann unterschiedlich lange dauern, bis verschiedene Zelllinien stabil werden. Bei MCF7 dauert es in der Regel 5-7 Tage, bis nicht infizierte Zellen vollständig ausgestorben sind. Vor den Experimenten sollte eine Tötungskurve mit einer Reihe von Antibiotikakonzentrationen auf eine neue Zelllinie getestet werden. Es ist akzeptabel, für die nächsten Schritte eine Zellmischung zu verwenden, aber eine Alternative besteht darin, Einzelzellkolonien auszuwählen, die in Bezug auf die Expression der beiden Effektorproteine homogen sind. Die erhaltene stabile Linie wird in dieser Arbeit als SAM-Effektor-Elternlinie (z. B. MCF7 SAM-Effektorlinie) bezeichnet. Es wird empfohlen, eine gemeinsame SAM-Effektor-Elternzelllinie für die Infektion mit unterschiedlichen zielgerichteten oder nicht-zielgerichteten gRNAs zu verwenden, insbesondere wenn deren Wirkungen verglichen werden.
  4. Mit Western Blotting können Sie feststellen, ob die Zellen die beiden Effektorproteine stabil exprimieren (ein Beispiel ist in Abbildung 4A dargestellt). Verwenden Sie die reverse Transkription von Gesamt-RNAs, gefolgt von quantitativer PCR (RT-qPCR) als alternative Methode, um die Expressionsniveaus der beiden mRNAs (dCas9-VP64 und MS2-p65-HSF1, Abbildung 4B) zu untersuchen.
    HINWEIS: Primer zur Untersuchung der mRNA-Spiegel der beiden dCas9-Effektoren sind in der ergänzenden Tabelle 1 verfügbar.
  5. Erzeugung von Lentiviren aus gRNAs, die in Schritt 3.5 konstruiert wurden, und Infektion der stabilen SAM-Zelllinie, die dCas9-VP64 und MS2-p65-HSF1 doppelt exprimiert, mit individuellen gRNA-Lentiviren. Fügen Sie Zeocin (100 μg/ml für MCF7-Zellen) 24 h nach der gRNA-Virustransduktion zum Medium hinzu. Generieren Sie eine Negativkontrolle, die nicht-targeting-gRNA (NT-gRNA) in der elterlichen SAM-Zelllinie exprimiert.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Auswahlmedikament spezifisch für das interessierende Konstrukt ist.

8. RNA-Extraktion und quantitative RT-PCR zur Untersuchung des eRNA-Spiegels

  1. Extraktion von Gesamt-RNAs aus SAM-Zelllinien, die entweder NT-gRNA exprimieren oder auf gRNAs abzielen, unter Verwendung eines RNA-Extraktionskits38 oder einer anderen auf Phenolchloroform basierenden Methode. Verwenden Sie Zellen mit einer Konfluenz von ~80 % in einer Vertiefung einer Sechs-Well-Platte für die RNA-Extraktion.
    HINWEIS: In unserer Praxis für den eRNA-Nachweis wurde kein signifikanter Unterschied festgestellt, wenn RNAs entweder durch kommerzielle Bindungssäulen oder durch Phenolchloroform-Reagenzien extrahiert werden.
  2. Komplementäre DNA (cDNA) aus der gereinigten RNA durch reverse Transkriptionsreaktion mit zufälligem Hexamer nach dem Protokoll des Herstellersherstellen 39. Verwendungsbedingungen in der ergänzenden Tabelle 2.
    HINWEIS: Da die meisten eRNAs nicht polyadenyliert sind 1,2,4,9,10, wird routinemäßig zufälliges Hexamer für die cDNA-Erzeugung verwendet.
  3. Entwerfen Sie Primer für die RT-qPCR-Messung von Ziel-eRNAs mit einem renommierten Primer-Design-Tool (z. B. Primer 3). Testen Sie die Amplifikationslinearität der Primerpaare, indem Sie untersuchen, ob die Primer serielle verdünnte cDNAs linear amplifizieren und die erwarteten Unterschiede im qPCR-Zyklus aufweisen. Verwendungsbedingungen in der ergänzenden Tabelle 2.
    HINWEIS: Die Primer für die RT-qPCR sollten auf die stark transkribierte Region im entstehenden RNA-seq abzielen, und der Linearitätstest der Primer sollte einen breiten Bereich von cDNA-Verdünnungen umfassen, um sicherzustellen, dass alle möglicherweise anzutreffenden eRNA-Spiegel getestet werden. Ein Beispiel für einen Linearitätstest ist in Abbildung 5A dargestellt.
  4. Führen Sie eine RT-qPCR durch und analysieren Sie die eRNA-Expressionsniveaus in Kontrollzellen (SAM-Zelllinie mit NT-gRNA) und in SAM-Zelllinien mit eRNA-targeting-gRNAs (z. B. NET1e gRNA#1) (z. B. Abbildung 6A). Primer für NET1e-RNA sind in der ergänzenden Tabelle 1 aufgeführt. Verwendungsbedingungen in der ergänzenden Tabelle 2.  

9. dCas9 ChIP und qPCR

HINWEIS: Bei diesem Schritt handelt es sich um ein optionales Experiment zur Validierung der Bindung des dCas9/SAM-gRNA-Komplexes an den Ziel-Enhancer durch die spezifischen gRNAs. Es wird zwar empfohlen, dass Benutzer diesen Schritt durchführen, aber es ist nicht notwendig, jede einzelne gRNA zu testen. Beziehen Sie sich auf ein Beispiel in Abbildung 5B. Siehe Primer, die in der ergänzenden Tabelle 1 aufgeführt sind.

  1. Zellen vernetzen
    1. Entfernen Sie das Medium aus den Zellen und fügen Sie 1 % Formaldehyd hinzu, das in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gelöst ist. 10 Min. ziehen lassen.
    2. Fügen Sie 2,5 M Glycin bei einem Volumen von 1:20 hinzu, um die Vernetzung zu löschen, und waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskaltem PBS. Fügen Sie 700 μl eiskaltes PBS hinzu und kratzen Sie die Zellen in ein 1,5 ml-Röhrchen.
    3. Bei 2.000 x g 5 Min. bei 4 °C zentrifugieren. Fahren Sie mit Schritt 9.2 fort oder frieren Sie es ein und lagern Sie es bei -80 °C.
  2. Beschallt
    1. Stellen Sie frische LB1-, LB2- und LB3-Puffer her. LB1: 50 mM Hepes-KOH (pH 7,5), 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 % Glycerin, 0,5 % NP-40, 0,25 % Triton-X 100 und 1x Proteasehemmer. LB2: 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA und 1x Proteasehemmer. LB3: 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 0,1 % Na-Desoxycholat, 0,5 % N-Lauroylsarcosin und 1x Proteaseinhibitor. 1x Proteasehemmer vor dem Versuch frisch in den Puffer geben.
    2. Geben Sie 1 ml Puffer LB1 zu den Zellpellets, pipettieren Sie es gut, drehen Sie es 10 Minuten lang bei 4 °C und drehen Sie es 5 Minuten lang bei 4 °C bei 2.000 x g . Gießen Sie den Überstand ab, fügen Sie 1 mL LB2-Puffer hinzu, drehen Sie ihn 10 min lang bei 4 °C und schleudern Sie ihn 5 min lang bei 4 °C bei 2.000 x g . Gießen Sie den Überstand ab und entfernen Sie den Überschuss des LB2-Puffers. 300 μl Puffer LB3 zugeben.
    3. Beschallung und Fragmentierung der Chromatin-DNA auf eine durchschnittliche Größe von ~200-400 bp mit einem geeigneten Ultraschallsystem. Nach der Beschallung 30 μl 10% Triton-X 100 hinzufügen und gut mischen. Testen Sie die richtige Beschallungszeit, wenn eine neue Zelllinie verwendet wird.
    4. Zentrifugieren Sie bei 14.000 x g , um das Pellet zu entfernen. Übertragen Sie den Überstand in das neue Röhrchen und fügen Sie 630 μl LB3 und 70 μl 10 % Triton X-100 zu einem Gesamtvolumen von 1 ml hinzu. Geben Sie 2 μg des Cas9-Antikörpers in den Überstand und drehen Sie ihn über Nacht bei 4 °C.
  3. Immuno-Komplex-Capture und Reverse Crosslinking
    1. Bereiten Sie RIPA-Puffer (50 mM HEPES pH 7,6, 1 mM EDTA, 0,7 % Na-Desoxycholat, 1 % NP-40, 0,5 M LiCl) und Elutionspuffer (1 % SDS und 0,1 M NaHCO3) vor.
    2. Waschen Sie Protein G Dynabeads mit 1% BSA in PBS 3 mal und LB3 Puffer einmal.
    3. 30 μl Protein G Dynabeads in die Probe geben und 4 Stunden lang bei 4 °C inkubieren.
    4. Waschen Sie den Kügelchen-Immun-Komplex in 500 μL RIPA-Puffer 6x. Lassen Sie die Perlen nicht austrocknen.
    5. Waschen Sie den Kügelchen-Immun-Komplex einmal mit TE-Puffer; Entfernen Sie den Puffer.
    6. Geben Sie 200 μl Elutionspuffer in den Beads-Immuno-Komplex und den Vortex; Dann in einen temperatureinstellbaren, beheizten Shaker geben, der auf 65 °C mit 600 U/min eingestellt ist, 6-16 h lang geschüttelt werden, um die Vernetzung umzukehren.
  4. DNA-Extraktion
    1. Nehmen Sie die Röhrchen aus dem Shaker, drehen Sie die Kügelchen kurz herunter und legen Sie sie auf einen Magnetständer. 200 μl des Überstands werden in ein frisches Röhrchen überführt und 200 μl TE-Puffer hinzugefügt.
    2. 1 μl RNase A (1 mg/ml) in das Röhrchen geben und 1 h lang bei 37 °C inkubieren.
    3. Nach 1 h Inkubation geben Sie 2 μl Proteinase K (20 mg/ml) in die Probe und inkubieren Sie sie 2 h lang bei 65 °C.
    4. Kurz zentrifugieren und 400 μl Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Gemisch zugeben. Gut mischen, dann 5 min bei 10.000 x g zentrifugieren.
    5. 400 μl der oberen Schicht in ein 1,7-ml-Röhrchen mit 16 μl 5 M NaCl und 1 μl Glykogen (20 μg/μl) geben und gut mischen.
    6. 800 μl 100 % Ethanol zugeben und über Nacht bei -20 °C stehen lassen.
    7. Am nächsten Morgen zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 4 °C bei 14.000 x g für 15 min.
    8. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet mit 1 ml 70%igem Ethanol. Bei 14.000 x g 10 min runterschleudern.
    9. Entfernen Sie das Ethanol, trocknen Sie das Pellet an der Luft und resuspendieren Sie es in 50 μl TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA).
  5. Führen Sie eine ChIP-qPCR durch, um die Rekrutierung des SAM-Komplexes an der Zielstelle durch ein Paar Enhancer-Core-Targeting-Primer zu untersuchen. Verwenden Sie ein Primerpaar, das auf eine irrelevante Region abzielt, als Negativkontrolle.

10. Zellwachstumsassay und andere funktionelle Tests der eRNA-Überaktivierung

  1. Trypsinisieren Sie SAM-Zelllinien, die die nicht zielgerichtete gRNA oder eRNA-gerichtete gRNAs exprimieren, und plattieren Sie ~3.000 Zellen pro Well in einer 96-Well-Platte.
  2. Messen Sie das Zellwachstum mit einem Lebendzell-Imager oder anderen Methoden (z. B. Zellzählung oder wasserlöslicher Tetrazoliumsalz-1-Assay).
  3. Verwenden Sie die halbmaximale Hemmkonzentration (IC50), um die zellulären Reaktionen auf spezifische Krebsmedikamente in Zellen mit oder ohne NET1e-Überexpression durch SAM15 zu testen.
    HINWEIS: Die Ergebnisse von Zellwachstumsassays und Arzneimittelsensitivitätstests von Brustkrebszellen werden nach Überexpression einer eRNA präsentiert, die neben dem NET1-Gen transkribiert wurde und als NET1e15 bezeichnet wurde. Andere Assays können auf zellulärer oder organismischer Ebene durchgeführt werden, je nach den Anforderungen des jeweiligen Projekts.

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Ergebnisse

Abbildung 1 veranschaulicht den allgemeinen Arbeitsablauf dieses Protokolls. Unser Fokus lag auf einer repräsentativen eRNA, NET1e15, die bei Brustkrebs überexprimiert wird, für die das SAM-System verwendet wurde, um seine biologische Rolle bei der Regulierung der Genexpression, der Zellproliferation und der Reaktion auf Krebsmedikamente zu aktivieren und zu untersuchen. Für diesen NET1-Enhancer wurden mehrere p3...

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Diskussion

Basierend auf unseren Daten kommen wir zu dem Schluss, dass das SAM-System geeignet ist, um die Rolle von eRNAs bei der Regulierung zellulärer Phänotypen, z.B. Zellwachstum oder Arzneimittelresistenz, zu untersuchen. Für eine robuste eRNA-Aktivierung ist jedoch aus den folgenden Gründen ein sorgfältiges gRNA-Design erforderlich. Zunächst einmal ist die Transkriptionsstartstelle (TSS) der eRNA in den einzelnen Zelllinien/-typen weniger klar annotiert. Aus diesem Grund müssen epigen...

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Offenlegungen

Der Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offizielle Meinung des Cancer Prevention and Research Institute of Texas wieder.

Danksagungen

Diese Arbeit wird durch Zuschüsse an W.L (Cancer Prevention and Research Institute of Texas, CPRIT RR160083 und RP180734; NCI K22CA204468; NIGMS R21GM132778; den UT Stars Award der Universität von Texas; und die Welch Foundation AU-2000-20190330) und ein Postdoktorandenstipendium an J.L (UTHealth Innovation for Cancer Prevention Research Training Program Post-doctoral Fellowship, CPRIT RP160015). Wir erkennen die ursprüngliche Veröffentlichung15 an, aus der einige unserer aktuellen Abbildungen (mit Modifikationen) übernommen wurden, die der Creative Commons-Lizenz (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) folgt.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
BlasticidinGoldbioB-800-100
BsmBI restriction enzymeNew England BioLabs Inc.R0580S
Cas9 mAbActive Motif61757Lot: 10216001
Deoxynucleotide (dNTP) Solution MixNew England BioLabs Inc.N0447S
Dulbecco’s Modified Eagle MediumCorning10-013-CM
Dynabeads Protein GThermo Fisher Scientific65002
EDTAThermo Fisher ScientificBP118-500
EGTASigmaE3889
Fetal Bovine SerumGenDEPOTF0900-050
GlycogenThermo Fisher Scientific10814010
Hepes-KOHThermo Fisher ScientificBP310-100
Hexadimethrine BromideSigmaH9268
Hygromycin BGoldbioH-270-25
IGEPAL CA630SigmaD6750
IncuCyte live-cell imagerEssen BioScienceIncuCyte S3 Live-Cell Analysis System
lenti_dCAS-VP64_BlastAddgene61425
lenti_gRNA(MS2)_zeo backboneAddgene61427
lenti_MS2-p65-HSF1_HygroAddgene61426
LiCLSigmaL9650
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668-500
NaClSigmaS3014
Na-DeoxycholateSigmaD6750
NaHCO3Thermo Fisher ScientificBP328-500
N-lauroylsarcosineSigma97-78-9
Opti-MEM Reduced Serum MediumThermo Fisher Scientific31985070
PES syringe filterBASIX13-1001-07
Protease Inhibitor Cocktail TabletRoche Diagnostic11836145001
pSpCas9(BB)-2A-PuroAddgene62988
Q5 High-Fidelity DNA PolymeraseNew England BioLabs Inc.M0491S
Q5 Reaction BufferNew England BioLabs Inc.B9027S
Quick-DNA MiniprepZYMO ResearchD3025
Quick-RNA MiniprepZYMO ResearchR1054
Restriction enzyme bufferNew England BioLabs Inc.B7203S
RT-qPCR Detection SystemThermo Fisher ScientificQuant Studio3
SDSThermo Fisher ScientificBP359-500
SonicatorQsonicaQ800R2
Sso Advanced Universal SYBR Green SupermixBio-Rad Laboratories1725274
Stbl3 competent cellThermo Fisher ScientificC7373-03
Superscript IV reverse transcriptThermo Fisher Scientific719000
Surveyor Mutation Detection KitsIntegrated DNA Technologies706020
T4 DNA LigaseNew England BioLabs Inc.M0202S
T4 DNA Ligase Reaction BufferNew England BioLabs Inc.B0202S
TE bufferThermo Fisher Scientific46009CM
Thermal cyclerBio-Rad LaboratoriesT100
ThermomixerSigma5384000020
ZeocinThermo Fisher Scientificant-zn-1p

Referenzen

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