JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Энхансерные РНК (эРНК) — это некодирующие РНК, продуцируемые активными энхансерами. Оптимальным подходом к изучению функций эРНК является манипулирование их уровнями в нативных участках хроматина. В данной работе мы представляем надежную систему для исследований эРНК с использованием слитых с помощью CRISPR-dCas9 транскрипционных активаторов для индуцирования экспрессии представляющих интерес эРНК.

Аннотация

Энхансеры являются ключевыми элементами генома, разбросанными по всему геному млекопитающих и определяющими тканеспецифичные программы экспрессии генов. Все больше доказательств показывает, что энхансеры не только обеспечивают мотивы связывания ДНК для факторов транскрипции (ТФ), но и генерируют некодирующие РНК, которые называются эРНК. Исследования показали, что транскрипты эРНК могут играть важную роль в регуляции генов как в физиологии, так и при заболеваниях. Обычно используемые методы исследования функции эРНК ограничены подходами «потери функции» путем нокдауна эРНК или химического ингибирования транскрипции энхансера. Не существует надежного метода проведения исследований «усиления функции» эРНК для имитации конкретных заболеваний, таких как рак человека, где эРНК часто чрезмерно экспрессируются. В данной работе мы представляем метод точной и надежной активации эРНК для функционального исследования их ролей с применением системы синергетических активационных медиаторов (SAM), опосредованной dCas9. Мы представляем весь процесс активации эРНК, от выбора эРНК, дизайна гРНК до валидации активации эРНК с помощью ОТ-кПЦР. Этот метод представляет собой уникальный подход к изучению роли конкретной эРНК в регуляции генов и развитии заболеваний. Кроме того, эта система может быть использована для объективного скрининга CRISPR для выявления мишеней eRNA, управляющих фенотипом, в контексте конкретного заболевания.

Введение

Геном человека содержит созвездие регуляторных элементов 1,2,3. Среди них энхансеры являются одной из наиболее важных категорий 4,5,6. Энхансеры играют важную роль в регулировании развития и отвечают за создание пространственно-временных программ экспрессии генов для определения идентичности клеток 5,6,7. Традиционно энхансеры рассматриваются только как элементы ДНК, обеспечивающие связывающие мотивы для транскрипционных факторов (ТФ), которые затем контролируют экспрессию генов-мишеней 6,8. Тем не менее, серия исследований показала, что многие активные энхансеры также транскрибируют некодирующие энхансерные РНК (т.е. эРНК)4,9,10.

Установлено, что уровень транскрипции эРНК коррелирует с активностью энхансера 4,10. Активные энхансеры производят больше транскриптов эРНК и демонстрируют более высокие уровни эпигеномных маркеров, связанных с активной транскрипцией, таких как H3K27ac и H3K4me1 9,11,12. Некоторые исследования показали, что транскрипты эРНК могут играть важную роль в транскрипционной активации генов-мишеней10,12. Было идентифицировано большое количество эРНК, нарушающих регуляцию при раке человека 13,14,15,16, многие из которых продемонстрировали высокую специфичность типа рака и клиническую значимость. Эти результаты открывают возможности для того, чтобы выяснение эРНК, которые могут стимулировать/способствовать онкогенезу, может предложить новые мишени для терапевтического вмешательства13,15.

Современные методы изучения функций эРНК почти исключительно основаны на нокдаун-стратегиях, в которых используются малые интерференционные РНК (миРНК), короткие шпильчатые РНК (шРНК) или антисмысловые олигонуклеотиды (АСО, из которых обычно используются в исследованиях заблокированные нуклеиновые кислоты (ЛНК)10,12,17. Тем не менее, заболевания человека, такие как рак, преимущественно демонстрируют сверхэкспрессию эРНК по сравнению с соседними нормальнымитканями15, что требует инструментов для «сверхэкспрессии» эРНК для имитации их паттернов экспрессии, связанных с заболеванием, для функциональных исследований. Для достижения этой цели система эктопической сверхэкспрессии на основе плазмид не является оптимальной, поскольку точные сайты начала и окончания транскрипции эРНК остаются в значительной степени неясными. Кроме того, система экспрессии плазмид может изменять расположение эРНК, вызывая потенциальные артефакты их функций18. Здесь мы предоставляем подробный протокол для облегчения функциональной характеристики эРНК путем обеспечения их «сверхэкспрессии» в нативном геномном локусе их продукции (т.е. in situ), который основан на CRISPR/dCas9-синергетической системе медиаторов активации (SAM).

Система SAM была первоначально разработана для активации кодирующих генов и длинных межгенных некодирующих РНК (линкРНК), связанных с резистентностью к ингибиторам BRAF в клетках меланомы19. В отличие от других технологий активации CRISPR (CRISPRa), система SAM состоит из комбинации активаторов транскрипции для обеспечения надежной транскрипционной активации целевых областей. Эти активаторы включают: ферментативно мертвый Cas9 (dCas9), слитый с VP64 (т.е. dCas9-VP64); направляющая РНК, содержащая два аптамера РНК MS2, и белок-активатор слияния MS2-p65-HSF1. Присутствие аптамеров MS2 в гРНК может рекрутировать гибридный белок MS2-p65-HSF1 в окрестности сайтов связывания dCas9/гРНК. Среди них VP64 является сконструированным тетрамером домена активатора транскрипции VP16 простого герпеса, который, как было показано, сильно активирует транскрипцию генов путем рекрутирования общих факторов транскрипции 20,21,22. Гибридный белок MS2-p65-HSF1 состоит из трех частей. Первая часть, MS2-N55K, представляет собой мутантную форму MS2-связывающего белка, которая имеет более сильное сродство23; двумя другими частями этого гибридного белка являются трансактивационный домен p65 и фактор теплового шока 1 (HSF1), оба из которых являются факторами транскрипции, обладающими сильными трансактивационными доменами и способными индуцировать устойчивые транскрипционные программы24,25. Таким образом, система SAM по существу создала высокоэффективный активаторный комплекс для активации транскрипции обозначенных кодирующих генов и линкРНК19.

протокол

Весь рабочий процесс этого протокола показан на рисунке 1.

1. Выбор энхансерной РНК (эРНК)

  1. Идентификация предполагаемой области энхансера, представляющей интерес, с помощью данных пиков связывания иммунопреципитационного секвенирования хроматина (ChIP-Seq), т.е. модификаций гистонов (например, H3K4me1 и H3K27ac), или коактиваторов транскрипции (например, p300).
  2. Идентификация интересующей эРНК путем пересечения пика ChIP-Seq с сигналами РНК-секвенирования (например, из общего количества РНК-секвенирования или из зарождающегося РНК-секвенирования, такого как Global Run-On Sequencing (GRO-Seq).
    Примечание: Область, выбранная для конструирования гРНК, обычно должна быть ограничена областью «энхансерного ядра», где TF или коактиваторы (например, p300) показали явные пики ChIP-seq (рис. 2A). dCas9 и его коактиваторы слияния будут рекрутироваться гРНК в эту область, чтобы имитировать нативное связывание коактиваторов (рис. 2A). Если доступны специальные наборы данных, такие как Cap Analysis of Gene Expression (CAGE)4 или GRO-cap26, они могут быть использованы для точного определения «энхансерного ядра», области между двумя сайтами начала транскрипции эРНК, транскрибируемых в противоположных направлениях 4,10,26.

2. Дизайн гРНК

  1. Используйте распространенные инструменты проектирования гРНК CRISPR, такие как CRISPOR27 , для выбора гРНК с низким потенциалом ненацеливания (http://crispor.tefor.net/).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Другие инструменты, такие как Benchling28 или CHOPCHOP29 , также могут быть использованы в качестве дополнительных опций для дизайна гРНК.
  2. Вставьте последовательность ДНК ядра энхансера в столбец « Шаг 1 » на веб-сайте CRISPOR, затем нажмите кнопку раскрывающегося списка, чтобы выбрать соответствующий геном (например, человека) в столбце « Шаг 2 ». Нажмите кнопку раскрывающегося списка, чтобы установить последовательность протоспейсерного смежного мотива (PAM) как "NGG" в столбце Шага 3 , а затем нажмите кнопку "Отправить", чтобы создать направляющие последовательности длиной 20.н.
  3. Выберите шаблоны с самыми высокими показателями специфичности в инструменте CRISPOR, т.е. с низким нецелевым потенциалом, затем добавьте «CACCG» на 5' конец и «C» на 3' конец соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выбирайте руководства с самыми высокими показателями специфичности (предпочтительно >85 в CRISPOR).
  4. Заказывайте олигонуклеотиды для каждого чувства и антисмысловой последовательности из коммерческих источников.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительные инструкции по дизайну гРНК CRISPR/Cas9 можно найти в других исследованиях30,31. Выступы на шаге 2.2 сделают гРНК совместимой с основой гРНК SAM (Addgene #61427), которая использует фермент рестрикции BsmBI.

3. Клонирование гРНК в лентивирусную конструкцию

  1. Для отжига олигопластов смешивают 1 мкл каждого парного олиго при 100 мкМ, 1 мкл 10x буфера для лигирования Т4, 0,5 мкл Т4 ДНК-лигазы (400 000 ЕД/мл) и 6,5 мклН2О до достижения общего объема 10 мкл. Инкубируют при 37 °С в течение 30 мин, затем при 95 °С в течение 5 мин, и снизить температуру до 25 °C при 5 °C/мин. Разбавить до 100 мкл с помощью H2O.
  2. Расщепляйте костяк гРНК, смешивая 2 мкл 10-кратного буфера фермента рестрикции (RE), 300 г lenti_gRNA(MS2)_zeo основной плазмиды (Addgene #61427) в 1 мкл, 1 мкл фермента BsmBI и 16 мкл H2O до получения общего объема 20 мкл. Инкубируйте при 55 °C в течение 15 мин.
  3. Смешайте компоненты лигирования с 20 мкл продукта распада, добавив 2,5 мкл 10-кратного буфера для лигирования Т4, 1 мкл разбавленного продукта отжига и 1,5 мкл Т4 ДНК-лигазы (400 000 единиц/мл) в систему объемом 25 мкл. Выдерживать при комнатной температуре в течение 30 минут.
  4. Трансформируйте 2 мкл смеси для лигирования с шага 3.3 в Stbl3-компетентные клетки E.coli . Поместите их на планшет с ампициллиновым LB-агаром и инкубируйте в течение ночи при 37 °C.
  5. Выберите и привите одну колонию бактерий и извлеките плазмиду. Отправьте его на секвенирование по Сэнгеру, чтобы подтвердить, что последовательность гРНК вставлена правильно.
    Примечание: Последовательности праймеров и гРНК доступны в дополнительной таблице 1. Здесь рекомендуется использовать химически компетентные клетки E.coli , поскольку они обладают более высоким выходом плазмидной ДНК и более высокой стабильностью плазмид при генерации склонных к нестабильности лентивирусных плазмид32.

4. Тест на эффективность гРНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя это может быть не обязательно для каждой гРНК, исследователям рекомендуется изучить качество гРНК путем проведения анализа Surveyor (т.е. анализа расщепления несоответствия) для обнаружения инделов или мутаций, которые могут быть эффективно сгенерированы только высококачественными гРНК33,34. Другие методы, такие как отслеживание инделов по разложению (TIDE), также могут быть использованы для определения эффективности гРНК30,35. Сервейерная нуклеаза является членом семейства эндонуклеаз, специфичных для несоответствия, которые могут разрезать двухцепочечную ДНК с несоответствиями (рис. 3A). Качество гРНК может быть выявлено по эффективности производства более мелких видов ДНК. На практике эффективность резки геодезиста также может зависеть от эффективности трансфекции гРНК и Cas9.

  1. Трансфектируйте гРНК вместе с плазмидой pSpCas9(BB)-2A-Puro (Addgene #62988), экспрессирующей белок Cas9, в клетки 293T с помощью реагента для трансфекции на основе липидов. Используйте 1,2 мкг/мл на каждую плазмиду на лунку в 6-луночном планшете. Продолжайте культивировать клетки в течение 3 дней после трансфекции. Сбор и извлечение геномной ДНК в соответствии с протоколом производителя36.
  2. Используйте полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для амплификации целевого энхансерного участка из геномной ДНК. Используйте условия ПЦР, указанные в дополнительной таблице 2. Используйте праймеры из Дополнительной таблицы 1 для примера усилителя NET1e. Денатурируйте продукты ПЦР путем инкубации при 95 °C в течение 10 мин и повторно гибридизуйте их, снижая температуру с 95 °C до 25 °C со скоростью -0,3 °C/с, чтобы позволить одноцепочечной ДНК (ssDNA) с индуцированными гРНК инделами или мутациями и без них отжигаться друг от друга.
  3. Расщепляют гибридизованную ДНК с помощью нуклеазы Surveyor (рисунок 3A) в соответствии с протоколом производителя37. Смешайте 400 нг гибридизированной ДНК из стадии 4.2, 1 мкл нуклеазы Surveyor, 1 мкл энхансера Surveyor и 5 мкл 0,15 М MgCl2 в системе объемом 50 мкл. Выдерживать при температуре 42 °C в течение 60 минут. Проанализируйте ДНК на агарозном геле. Используйте отрицательный контроль, например, клетки только с Cas9, но без нацеливания на гРНК, в анализе и гель-электрофорезе (рис. 3B).

5. Генерация лентивирусов

  1. Добавьте psPAX2, pMD2.G и плазмиду-мишень (например, lenti_dCas9-VP64_Blast, Addgene #61425; или lenti_MS2-p65-HSF1_Hygro, Addgene #61426) в соотношении 3 мкг : 1 мкг : 4 мкг в полипропиленовую пробирку объемом 1,5 мл. Смешайте их с 500 μл Opti-MEM и инкубируйте в течение 5 минут при комнатной температуре.
  2. В отдельную пробирку поместить 10 мкл липидного реагента для трансфекции в 500 мкл Opti-MEM и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
  3. Соедините продукты из этапов 5.1 и 5.2 и инкубируйте в течение 20 минут при комнатной температуре.
  4. Поместите 293Т-клетки в таблицу за день до трансфекции и дайте им достичь конфлюенции ~30% в 10-сантиметровой чашке во время трансфекции. Добавьте 4 мл обычной среды (DMEM с 10% FBS), затем добавьте комплекс с шага 5.3 по каплям в клетки. Добавьте DMEM с 10% FBS, чтобы получить итоговый объем до 6 мл. Инкубировать в течение ночи в клеточном инкубаторе при температуре 37 °C с 5%CO2.
  5. На следующий день смените среду на 10 мл нового DMEM с 10% FBS. Убирайте урожай через 24 часа после смены среды. Используйте шприцевой фильтр (например, 0,45 мкм) для фильтрации среды, содержащей вирус, а затем перейдите к шагу 6 или храните вирус при температуре -80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для работы с лентивирусами требуется шкаф уровня биобезопасности II. Необходимо соблюдать осторожность для безопасного проведения экспериментов, связанных с вирусами; И если какой-либо контейнер имеет прямой контакт с вирусной средой, его необходимо отбелить более чем на 20 минут, прежде чем утилизировать как биологически опасный.

6. Культура клеток

  1. Поддерживайте клетки в инкубаторе для клеточных культур CO2 при температуре 37 °C с 5% CO2.
  2. Культивирование клеток MCF7 и 293T в среде Modified Eagle Medium (DMEM) от Dulbecco с 10% FBS.
  3. Выращивайте клетки в чашках по 10 см и разделяйте в соотношении от 1:3 до 1:5 при слиянии.

7. Клеточное инфицирование и отбор

  1. Засейте клетки-мишени (например, MCF7) непосредственно в смесь вирусной среды, содержащую 0,5 мл lenti_dCas9-VP64_Blast (Addgene #61425) и 0,5 мл lenti_MS2-p65-HSF1_Hygro (Addgene #61426). Добавьте 8 мкг/мл гексадиметрина бромида для повышения эффективности инфекции. Используйте лунку с неинфицированными клетками в качестве отрицательного контроля для изучения эффективности выбора антибиотиков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемое количество вирусной среды следующее: 6 мл вирусной среды для чашки 10 см, 1 мл для лунки 6-луночной тарелки и 0,5 мл для лунки 12-луночной тарелки.
  2. Через 24 ч после заражения добавьте в клетки свежую среду, содержащую бластицидин (5 мкг/мл для клеток MCF7) и гигромицин (200 мкг/мл для клеток MCF7).
  3. Держите клетки в среде отбора антибиотиков до тех пор, пока отрицательные контрольные клетки не умрут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время может варьироваться для того, чтобы различные клеточные линии стали стабильными. Для MCF7 обычно требуется 5-7 дней, чтобы неинфицированные клетки полностью вымерли. Перед началом экспериментов следует протестировать кривую убийства с использованием диапазона концентраций антибиотиков для новой клеточной линии. Для следующих этапов допустимо использовать клеточную смесь, но альтернативой является выбор колоний одиночных клеток, которые являются однородными с точки зрения экспрессии двух эффекторных белков. Полученная стабильная линия в данной работе называется родительской линией SAM-эффектора (например, линия SAM-эффектора MCF7). Рекомендуется использовать общую SAM-эффекторную родительскую клеточную линию для инфицирования различными таргетными или нецелевыми гРНК, особенно если их эффекты будут сравниваться.
  4. Используйте вестерн-блоттинг, чтобы определить, стабильно ли клетки экспрессируют два эффекторных белка (пример показан на рисунке 4А). Используйте обратную транскрипцию общих РНК с последующей количественной ПЦР (ОТ-кПЦР) в качестве альтернативного метода для изучения уровней экспрессии двух мРНК (dCas9-VP64 и MS2-p65-HSF1, рисунок 4B).
    Примечание: Праймеры для исследования уровней мРНК двух эффекторов dCas9 доступны в дополнительной таблице 1.
  5. Сгенерировать лентивирус из гРНК, построенных на шаге 3.5, и интазировать стабильную клеточную линию SAM, дуаль экспрессирующую dCas9-VP64 и MS2-p65-HSF1, с помощью индивидуальной гРНК лентивируса. Добавьте цеоцин (100 мкг/мл для клеток MCF7) в среду через 24 ч после вирусной трансдукции гРНК. Генерируйте отрицательный контроль, экспрессирующий нецелевую гРНК (NT-gRNA) в родительской клеточной линии SAM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что выбранный препарат специфичен для интересующего вас конструкта.

8. Экстракция РНК и количественная ОТ-ПЦР для исследования уровня эРНК

  1. Экстрагируйте общие РНК из клеточных линий SAM, экспрессирующие либо NT-гРНК, либо нацеленные на гРНК с помощью набора для экстракции РНК38 или другого метода на основе фенолахлороформа. Используйте клетки с ~80% конфлюенцией в одной лунке шестилуночного планшета для экстракции РНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В нашей практике обнаружения эРНК не наблюдалось существенной разницы при экстракции РНК либо с помощью коммерческих связывающих колонок, либо с помощью фенолхлороформных реагентов.
  2. Получить комплементарную ДНК (кДНК) из очищенной РНК путем реакции обратной транскрипции со случайным гексамером в соответствии с протоколом производителя39. Условия использования в Дополнительной таблице 2.
    Примечание: Поскольку большинство эРНК не являются полиаденилированными 1,2,4,9,10, случайный гексамер обычно используется для генерации кДНК.
  3. Разработка праймеров для измерения мишеней eРНК методом ОТ-кПЦР с использованием авторитетного инструмента для разработки праймеров (например, Primer 3). Проверьте линейность амплификации пар праймеров, исследуя, будут ли праймеры линейно амплифицировать серийные разбавленные кДНК и показывать ожидаемые различия в циклах количественной ПЦР. Условия использования в Дополнительной таблице 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Праймеры для ОТ-кПЦР должны быть нацелены на сильно транскрибируемую область в зарождающемся РНК-секвенировании, а тест на линейность праймеров должен включать широкий спектр разведений кДНК, чтобы гарантировать тестирование всех возможных уровней эРНК. Пример теста на линейность показан на рисунке 5A.
  4. Проведите ОТ-кПЦР и проанализируйте уровни экспрессии эРНК в контрольных клетках (клеточная линия SAM с NT-гРНК) и в клеточной линии SAM с гРНК, нацеленными на эРНК (например, NET1e gRNA#1) (например, рис. 6A). Праймеры для РНК NET1e показаны в дополнительной таблице 1. Условия использования в Дополнительной таблице 2.  

9. dCas9 ChIP и кПЦР

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап является необязательным экспериментом для проверки связывания комплекса dCas9/SAM-гРНК с энхансером-мишенью специфическими гРНК. Несмотря на то, что пользователям рекомендуется выполнить этот шаг, нет необходимости тестировать каждую отдельную гРНК. Обратитесь к примеру, показанному на рисунке 5B. Обратитесь к праймерам, перечисленным в дополнительной таблице 1.

  1. Сшитые ячейки
    1. Удалите среду из клеток и добавьте 1% формальдегида, растворенного в фосфатно-солевом буфере (PBS). Оставить на 10 минут.
    2. Добавьте 2,5 М глицина в объеме 1:20, чтобы погасить сшивку, и дважды промойте клетки ледяным PBS. Добавьте 700 μL ледяного PBS и соскребите клетки в пробирку объемом 1,5 мл.
    3. Центрифугируйте при давлении 2 000 x g в течение 5 минут при 4 °C. Перейдите к шагу 9.2 или заморозьте и храните при температуре -80 °C.
  2. Ультразвук
    1. Приготовьте свежие буферы LB1, LB2 и LB3. LB1: 50 мМ Hepes-KOH (pH 7,5), 140 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 10% глицерин, 0,5% NP-40, 0,25% Triton-X 100 и 1x ингибитор протеазы. LB2: 10 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 200 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,5 мМ EGTA и 1x ингибитор протеазы. LB3: 10 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,5 мМ EGTA, 0,1% Na-дезоксихолат, 0,5% N-лауроилсаркозин и 1x ингибитор протеазы. Добавьте 1х ингибитор протеазы в буфер перед экспериментом.
    2. Добавьте 1 мл буфера LB1 в клеточные гранулы, хорошо пипетируйте, вращайте при 4 °C в течение 10 минут и вращайте при 2 000 x g в течение 5 минут при 4 °C. Слейте надосадочную жидкость, добавьте 1 мл буфера LB2, вращайте при 4 °C в течение 10 минут и вращайте при 2 000 x g в течение 5 минут при 4 °C. Слейте надосадочную жидкость и удалите излишки буфера LB2. Добавьте 300 мкл буфера LB3.
    3. Озвучьте и фрагментируйте хроматиновую ДНК до среднего размера ~200-400.о. с помощью соответствующей ультразвуковой системы. После обработки ультразвуком добавьте 30 мкл 10% Triton-X 100 и хорошо перемешайте. Проверьте правильное время ультразвука, если используется новая клеточная линия.
    4. Центрифуга при давлении 14 000 x g для удаления гранул. Перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку и добавьте 630 мкл LB3 и 70 мкл 10% Triton X-100 в общий объем 1 мл. Добавьте 2 мкг антитела Cas9 в надосадочную жидкость и вращайте при 4 °C в течение ночи.
  3. Захват иммунокомплексов и обратная сшивка
    1. Приготовьте буфер RIPA (50 мМ HEPES pH 7,6, 1 мМ ЭДТА, 0,7% Na-дезоксихолат, 1% NP-40, 0,5 М LiCl) и элюирующий буфер (1% SDS и 0,1 М NaHCO3).
    2. Промойте Protein G dynabeads с 1% BSA в PBS 3 раза и буфером LB3 один раз.
    3. Добавьте в образец 30 мкл динаб протеина G и инкубируйте при 4 °C в течение 4 ч.
    4. Промойте шарики-иммуно-комплекс в 500 мкл буфера RIPA 6х. Не допускайте пересыхания бусин.
    5. Однократно промойте шарики-иммунокомплекс с ТЭ буфером; Удалите буфер.
    6. Добавить 200 мкл элюирующего буфера в гранулы-иммунокомплекс и вихрь; затем поместите его в регулируемый по температуре шейкер с подогревом, установленный на 65 °C и 600 об/мин, встряхивая в течение 6-16 часов для обратного сшивания.
  4. Экстракция ДНК
    1. Извлеките трубочки из шейкера, кратковременно закрутите бусины и поставьте их на магнитную подставку. Перенесите 200 мкл надосадочной жидкости в свежую пробирку и добавьте 200 мкл TE-буфера.
    2. Добавьте в пробирку 1 мкл РНКазы А (1 мг/мл) и инкубируйте при 37 °C в течение 1 ч.
    3. Через 1 ч инкубации добавьте в образец 2 мкл протеиназы К (20 мг/мл) и инкубируйте его при 65 °C в течение 2 ч.
    4. Кратковременно центрифугируйте и добавьте 400 мкл смеси фенол-хлороформ и изоамилового спирта. Хорошо перемешайте, затем центрифугируйте в течение 5 минут при 10 000 x g.
    5. Переместите 400 мкл верхнего слоя в пробирку объемом 1,7 мл, содержащую 16 мкл 5 М NaCl и 1 мкл гликогена (20 мкг/мкл), и хорошо перемешайте.
    6. Добавьте 800 мкл 100% этанола и оставьте на ночь при температуре -20 °C.
    7. На следующее утро центрифугируйте пробирки при температуре 4 °C при 14 000 x g в течение 15 минут.
    8. Удалите надосадочную жидкость и промойте гранулу 1 мл 70% этанола. Вращайте при 14 000 x g в течение 10 минут.
    9. Удалите этанол, сухие гранулы на воздухе и повторно суспендируйте в 50 мкл TE (10 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 1 мМ ЭДТА).
  5. Проведите ChIP-qPCR для изучения набора комплекса SAM в сайт нацеливания с помощью пары праймеров-энхансеров, нацеленных на ядро. Используйте пару праймеров, нацеленную на нерелевантную область, в качестве отрицательного контроля.

10. Анализ роста клеток и другие функциональные тесты на сверхактивацию эРНК

  1. Трипсинизируйте клеточные линии SAM, экспрессирующие нецелевые гРНК или гРНК, нацеленные на эРНК, и нацельтесь на ~3000 клеток на лунку в 96-луночном планшете.
  2. Измерьте рост клеток с помощью тепловизора живых клеток или других методов (например, подсчет клеток или анализ водорастворимой соли тетразолия-1).
  3. Используйте полумаксимальную ингибиторную концентрацию (IC50) для проверки клеточных реакций на специфические противораковые препараты в клетках с гиперэкспрессией NET1e SAM15 или без нее.
    Примечание: Результаты анализов роста клеток и тестов на чувствительность к лекарствам клеток рака молочной железы представлены после сверхэкспрессии эРНК, транскрибируемой рядом с геном NET1 , которая была обозначена как NET1e15. Другие анализы могут проводиться на клеточном или организменном уровнях в зависимости от потребностей каждого конкретного проекта.

Результаты

На рисунке 1 показан общий рабочий процесс этого протокола. Мы сосредоточились на репрезентативной эРНК, NET1e15, которая сверхэкспрессируется при раке молочной железы, для активации и изучения биологической роли которой в регуляции эк?...

Обсуждение

На основании полученных данных мы пришли к выводу, что система SAM подходит для изучения роли эРНК в регуляции клеточных фенотипов, например, роста клеток или лекарственной устойчивости. Тем не менее, тщательное проектирование гРНК требуется для надежной активации эРН...

Раскрытие информации

Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Института профилактики и исследований рака Техаса.

Благодарности

Эта работа поддерживается грантами W.L (Институт профилактики и исследований рака Техаса, CPRIT RR160083 и RP180734; NCI K22CA204468; NIGMS R21GM132778; Премия UT Stars Award Техасского университета; и фонд Уэлча AU-2000-20190330) и постдокторская стипендия в J.L (UTHealth Innovation for Cancer Prevention Research Training Program Post-doctoral Fellowship, CPRIT RP160015). Мы признаем первоначальную публикацию15 , из которой были взяты некоторые из наших текущих фигур (с изменениями), которая соответствует лицензии Creative Commons (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
BlasticidinGoldbioB-800-100
BsmBI restriction enzymeNew England BioLabs Inc.R0580S
Cas9 mAbActive Motif61757Lot: 10216001
Deoxynucleotide (dNTP) Solution MixNew England BioLabs Inc.N0447S
Dulbecco’s Modified Eagle MediumCorning10-013-CM
Dynabeads Protein GThermo Fisher Scientific65002
EDTAThermo Fisher ScientificBP118-500
EGTASigmaE3889
Fetal Bovine SerumGenDEPOTF0900-050
GlycogenThermo Fisher Scientific10814010
Hepes-KOHThermo Fisher ScientificBP310-100
Hexadimethrine BromideSigmaH9268
Hygromycin BGoldbioH-270-25
IGEPAL CA630SigmaD6750
IncuCyte live-cell imagerEssen BioScienceIncuCyte S3 Live-Cell Analysis System
lenti_dCAS-VP64_BlastAddgene61425
lenti_gRNA(MS2)_zeo backboneAddgene61427
lenti_MS2-p65-HSF1_HygroAddgene61426
LiCLSigmaL9650
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668-500
NaClSigmaS3014
Na-DeoxycholateSigmaD6750
NaHCO3Thermo Fisher ScientificBP328-500
N-lauroylsarcosineSigma97-78-9
Opti-MEM Reduced Serum MediumThermo Fisher Scientific31985070
PES syringe filterBASIX13-1001-07
Protease Inhibitor Cocktail TabletRoche Diagnostic11836145001
pSpCas9(BB)-2A-PuroAddgene62988
Q5 High-Fidelity DNA PolymeraseNew England BioLabs Inc.M0491S
Q5 Reaction BufferNew England BioLabs Inc.B9027S
Quick-DNA MiniprepZYMO ResearchD3025
Quick-RNA MiniprepZYMO ResearchR1054
Restriction enzyme bufferNew England BioLabs Inc.B7203S
RT-qPCR Detection SystemThermo Fisher ScientificQuant Studio3
SDSThermo Fisher ScientificBP359-500
SonicatorQsonicaQ800R2
Sso Advanced Universal SYBR Green SupermixBio-Rad Laboratories1725274
Stbl3 competent cellThermo Fisher ScientificC7373-03
Superscript IV reverse transcriptThermo Fisher Scientific719000
Surveyor Mutation Detection KitsIntegrated DNA Technologies706020
T4 DNA LigaseNew England BioLabs Inc.M0202S
T4 DNA Ligase Reaction BufferNew England BioLabs Inc.B0202S
TE bufferThermo Fisher Scientific46009CM
Thermal cyclerBio-Rad LaboratoriesT100
ThermomixerSigma5384000020
ZeocinThermo Fisher Scientificant-zn-1p

Ссылки

  1. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  2. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
  3. Kundaje, A., et al. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  4. Andersson, R., et al. An atlas of active enhancers across human cell types and tissues. Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).
  5. Heinz, S., Romanoski, C. E., Benner, C., Glass, C. K. The selection and function of cell type-specific enhancers. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (3), 144-154 (2015).
  6. Ong, C. T., Corces, V. G. Enhancer function: new insights into the regulation of tissue-specific gene expression. Nature Reviews Genetics. 12 (4), 283-293 (2011).
  7. Hnisz, D., et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell. 155 (4), 934-947 (2013).
  8. Grossman, S. R., et al. Systematic dissection of genomic features determining transcription factor binding and enhancer function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1291-1300 (2017).
  9. Kim, T. K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465 (7295), 182-187 (2010).
  10. Li, W., Notani, D., Rosenfeld, M. G. Enhancers as non-coding RNA transcription units: recent insights and future perspectives. Nature Reviews Genetics. 17 (4), 207-223 (2016).
  11. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  12. Li, W., et al. Functional roles of enhancer RNAs for oestrogen-dependent transcriptional activation. Nature. 498 (7455), 516-520 (2013).
  13. Lee, J. H., Xiong, F., Li, W. Enhancer RNAs in cancer: regulation, mechanisms and therapeutic potential. RNA Biology. , 1-10 (2020).
  14. Sur, I., Taipale, J. The role of enhancers in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (8), 483-493 (2016).
  15. Zhang, Z., et al. Transcriptional landscape and clinical utility of enhancer RNAs for eRNA-targeted therapy in cancer. Nature Communications. 10 (1), 4562 (2019).
  16. Chen, H., et al. A Pan-Cancer Analysis of Enhancer Expression in Nearly 9000 Patient Samples. Cell. 173 (2), 386-399 (2018).
  17. Kopp, F., Mendell, J. T. Functional Classification and Experimental Dissection of Long Noncoding RNAs. Cell. 172 (3), 393-407 (2018).
  18. Lubelsky, Y., Ulitsky, I. Sequences enriched in Alu repeats drive nuclear localization of long RNAs in human cells. Nature. 555 (7694), 107-111 (2018).
  19. Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
  20. Beerli, R. R., Segal, D. J., Dreier, B., Barbas, C. R. Toward controlling gene expression at will: specific regulation of the erbB-2/HER-2 promoter by using polydactyl zinc finger proteins constructed from modular building blocks. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (25), 14628-14633 (1995).
  21. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  22. Hirai, H., Tani, T., Kikyo, N. Structure and functions of powerful transactivators: VP16, MyoD and FoxA. International Journal of Developmental Biology. 54 (11-12), 1589-1596 (2010).
  23. Lim, F., Spingola, M., Peabody, D. S. Altering the RNA binding specificity of a translational repressor. Journal of Biological Chemistry. 269 (12), 9006-9010 (1994).
  24. Schmitz, M. L., Baeuerle, P. A. The p65 subunit is responsible for the strong transcription activating potential of NF-kappa B. EMBO Journal. 10 (12), 3805-3817 (1991).
  25. Vihervaara, A., Sistonen, L. HSF1 at a glance. Journal of Cell Science. 127, 261-266 (2014).
  26. Core, L. J., et al. Analysis of nascent RNA identifies a unified architecture of initiation regions at mammalian promoters and enhancers. Nature Genetics. 46 (12), 1311-1320 (2014).
  27. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
  28. . Benchling [Biology Software] Available from: https://benchling.com (2020)
  29. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
  30. Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nature Biotechnology. , (2020).
  31. Nageshwaran, S., et al. CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems. Journal of Visualized Experiments. (140), e57998 (2018).
  32. Al-Allaf, F. A., Tolmachov, O. E., Zambetti, L. P., Tchetchelnitski, V., Mehmet, H. Remarkable stability of an instability-prone lentiviral vector plasmid in Escherichia coli Stbl3. 3 Biotech. 3 (1), 61-70 (2013).
  33. Qiu, P., et al. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
  34. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  35. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
  36. Quick-DNA Miniprep Kit. ZYMO Available from: https://files.zymoresearch.com/protocols/_d3024_d3025_quick-dna_miniprep_kit.pdf (2020)
  37. SURVEYOR Mutation Detection Kit. IDT Available from: https://sfvideo.blob.core.windows.net/sitefinity/docs/default-source/user-guide-manual/surveyor-kit-for-gel-electrophoresis-user-guide.pdf?sfvrsn=a9123407_6 (2020)
  38. Quick-RNA Miniprep Kit. ZYMO Available from: https://files.zymoresearch.com/protocols/_r1054_r1055_quick_rna_miniprep_kit.pdf (2020)
  39. SuperScript IV Reverse Transcriptase Product Manual. Thermo Fisher Scientific Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/SSIV_Reverse_Transcriptase_UG.pdf (2020)
  40. Ounzain, S., et al. Functional importance of cardiac enhancer associated noncoding RNAs in heart development and disease. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 76, 55-70 (2014).
  41. McCleland, M. L., et al. CCAT1 is an enhancer-templated RNA that predicts BET sensitivity in colorectal cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 639-652 (2016).
  42. Miao, Y., et al. Enhancer-associated long non-coding RNA LEENE regulates endothelial nitric oxide synthase and endothelial function. Nature Communications. 9 (1), 292 (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

ERNADCas9CRISPR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены