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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Gli RNA enhancer (eRNA) sono RNA non codificanti prodotti da enhancer attivi. Un approccio ottimale per studiare le funzioni degli eRNA consiste nel manipolare i loro livelli nelle regioni native della cromatina. Qui introduciamo un robusto sistema per lo studio degli eRNA utilizzando attivatori trascrizionali fusi con CRISPR-dCas9 per indurre l'espressione di eRNA di interesse.

Abstract

Gli enhancer sono elementi genomici fondamentali sparsi nel genoma dei mammiferi e dettano i programmi di espressione genica tessuto-specifici. Prove crescenti hanno dimostrato che gli enhancer non solo forniscono motivi di legame del DNA per i fattori di trascrizione (TF), ma generano anche RNA non codificanti che vengono indicati come eRNA. Gli studi hanno dimostrato che i trascritti di eRNA possono svolgere un ruolo significativo nella regolazione genica sia in fisiologia che in malattia. I metodi comunemente usati per studiare la funzione degli eRNA sono limitati ad approcci di "perdita di funzione" mediante knockdown degli eRNA o mediante inibizione chimica della trascrizione dell'enhancer. Non esiste un metodo robusto per condurre studi di "guadagno di funzione" degli eRNA per imitare condizioni patologiche specifiche come il cancro umano, dove gli eRNA sono spesso sovraespressi. Qui, introduciamo un metodo per attivare in modo preciso e robusto gli eRNA per l'interrogazione funzionale dei loro ruoli applicando il sistema di mediatori di attivazione sinergica (SAM) mediato da dCas9. Presentiamo l'intero flusso di lavoro dell'attivazione degli eRNA, dalla selezione degli eRNA, alla progettazione dei gRNA fino alla validazione dell'attivazione degli eRNA mediante RT-qPCR. Questo metodo rappresenta un approccio unico per studiare i ruoli di un particolare eRNA nella regolazione genica e nello sviluppo della malattia. Inoltre, questo sistema può essere impiegato per lo screening CRISPR imparziale per identificare bersagli di eRNA che guidano il fenotipo nel contesto di una malattia specifica.

Introduzione

Il genoma umano contiene una costellazione di elementi regolatori 1,2,3. Tra questi, gli enhancer emergono come una delle categorie più critiche 4,5,6. Gli enhancer svolgono un ruolo essenziale nella regolazione dello sviluppo e sono responsabili della generazione di programmi di espressione genica spazio-temporale per determinare l'identità cellulare 5,6,7. Convenzionalmente, gli enhancer sono considerati solo come elementi del DNA che forniscono motivi di legame per i fattori di trascrizione (TF), che quindi controllano l'espressione genica bersaglio 6,8. Tuttavia, una serie di studi ha scoperto che molti enhancer attivi trascrivono anche RNA enhancer non codificanti (cioè eRNA)4,9,10.

È stato riscontrato che il livello di trascrizione dell'eRNA è correlato con l'attività di un potenziatore 4,10. Gli enhancer attivi producono più trascritti di eRNA e mostrano livelli più elevati di marcatori epigenomici associati alla trascrizione attiva, come H3K27ac e H3K4me1 9,11,12. Alcuni studi hanno dimostrato che i trascritti di eRNA possono svolgere un ruolo importante nell'attivazione trascrizionale dei geni bersaglio10,12. È stato identificato un gran numero di eRNA deregolati nei tumori umani 13,14,15,16, molti dei quali hanno mostrato un'elevata specificità del tipo di cancro e rilevanza clinica. Questi risultati offrono opportunità che la delucidazione degli eRNA che possono guidare/promuovere la tumorigenesi può offrire nuovi bersagli per l'intervento terapeutico13,15.

Gli attuali metodi per studiare le funzioni degli eRNA si basano quasi esclusivamente su strategie di knockdown che utilizzano piccoli RNA di interferenza (siRNA), RNA a forcina corta (shRNA) o oligonucleotidi antisenso (ASO, di cui gli acidi nucleici bloccati (LNA) sono il tipo comunemente usato nella ricerca)10,12,17. Tuttavia, le malattie umane come il cancro mostrano prevalentemente una sovraespressione di eRNA rispetto al loro tessuto normale adiacente15, richiedendo strumenti per "sovraesprimere" gli eRNA per imitare i loro modelli di espressione rilevanti per la malattia per gli studi funzionali. Per raggiungere questo obiettivo, un sistema di sovraespressione ectopica basato su plasmidi non è ottimale perché i siti esatti di inizio e terminazione della trascrizione degli eRNA rimangono in gran parte poco chiari. Inoltre, un sistema di espressione plasmidico può alterare la posizione degli eRNA, causando potenziali artefatti delle loro funzioni18. Qui forniamo un protocollo dettagliato per facilitare la caratterizzazione funzionale degli eRNA rafforzando la loro "sovraespressione" nel locus genomico nativo della loro produzione (cioè in situ), che si basa sul sistema CRISPR/dCas9-Synergistic Activation Mediators System (SAM).

Il sistema SAM è stato inizialmente sviluppato per attivare geni codificanti e lunghi RNA intergenici non codificanti (lincRNA) associati alla resistenza agli inibitori di BRAF nelle cellule di melanoma19. A differenza di altre tecnologie di attivazione CRISPR (CRISPRa), il sistema SAM è costituito da una combinazione di attivatori di trascrizione per conferire una robusta attivazione trascrizionale delle regioni bersaglio. Questi attivatori includono: un Cas9 enzimaticamente morto (dCas9) fuso con VP64 (cioè dCas9-VP64); un RNA guida contenente due aptameri di RNA MS2 e una proteina attivatrice della fusione MS2-p65-HSF1. La presenza degli aptameri MS2 nel gRNA può reclutare la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 in prossimità dei siti di legame dCas9/gRNA. Tra questi, VP64 è un tetramero ingegnerizzato del dominio attivatore trascrizionale VP16 dell'herpes simplex, che ha dimostrato di attivare fortemente la trascrizione genica reclutando fattori di trascrizione generali 20,21,22. La proteina di fusione MS2-p65-HSF1 è composta da tre parti. La prima parte, MS2-N55K, è una forma mutante della proteina legante MS2 che ha un'affinità più forte23; le altre due parti di questa proteina di fusione sono il dominio di transattivazione di p65 e il fattore di shock termico 1 (HSF1), entrambi fattori di trascrizione che possiedono forti domini di transattivazione e possono indurre robusti programmi di trascrizione24,25. Pertanto, il sistema SAM ha essenzialmente creato un complesso attivatore altamente potente per attivare la trascrizione di geni codificanti designati e lincRNA19.

Protocollo

L'intero flusso di lavoro di questo protocollo è illustrato nella Figura 1.

1. Selezione dell'RNA potenziatore (eRNA)

  1. Identificare una presunta regione di interesse dell'enhancer utilizzando i picchi di legame dei dati di sequenziamento dell'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP-Seq), cioè delle modificazioni istoniche (ad esempio, H3K4me1 e H3K27ac) o dei coattivatori della trascrizione (ad esempio, p300).
  2. Identificare l'eRNA di interesse intersecando il picco ChIP-Seq con i segnali RNA-seq (ad esempio, dall'RNA-seq totale o dall'RNA-seq nascente come il Global Run-On Sequencing (GRO-Seq).
    NOTA: La regione scelta per la progettazione dei gRNA dovrebbe essere solitamente limitata alla regione del "nucleo dell'enhancer", dove i TF o i coattivatori (ad esempio, p300) hanno mostrato chiari picchi di ChIP-seq (Figura 2A). Il dCas9 e i suoi coattivatori di fusione saranno reclutati da un gRNA in questa regione per imitare il legame nativo dei coattivatori (Figura 2A). Se sono disponibili set di dati specifici come Cap Analysis of Gene Expression (CAGE)4 o GRO-cap26, possono essere utilizzati per determinare con precisione il "nucleo enhancer", la regione tra due siti di inizio trascrizione degli eRNA trascritti in direzioni opposte 4,10,26.

2. Progettazione del gRNA

  1. Utilizza i comuni strumenti di progettazione di gRNA CRISPR come CRISPOR27 per selezionare gRNA con basso potenziale di off targeting (http://crispor.tefor.net/).
    NOTA: Altri strumenti come Benchling28 o CHOPCHOP29 possono essere utilizzati come opzioni aggiuntive per la progettazione del gRNA.
  2. Incolla la sequenza del DNA del nucleo dell'enhancer nella colonna Passaggio 1 del sito Web CRISPOR, quindi fai clic sul pulsante a discesa per scegliere il genoma corrispondente (ad esempio, umano) nella colonna Passaggio 2 . Fare clic sul pulsante a discesa per impostare la sequenza Protospacer Adjacent Motif (PAM) come "NGG" nella colonna Passaggio 3 , quindi fare clic sul pulsante "Invia" per generare sequenze guida con una lunghezza di 20 bp.
  3. Scegli le guide con i punteggi di specificità più alti nello strumento CRISPOR, ovvero un basso potenziale fuori bersaglio, quindi aggiungi "CACCG" all'estremità 5' e "C" all'estremità 3', rispettivamente.
    NOTA: Selezionare le guide con i punteggi di specificità più alti (è preferibile >85 in CRISPOR).
  4. Ordina oligonucleotidi per ogni sequenza senso e antisenso da fonti commerciali.
    NOTA: Ulteriori istruzioni sulla progettazione del gRNA CRISPR/Cas9 possono essere trovate in altri studi30,31. Le sporgenze nel passaggio 2.2 renderanno il gRNA compatibile con la spina dorsale del gRNA SAM (Addgene #61427), che utilizza l'enzima di restrizione BsmBI.

3. Clonare i gRNA in un costrutto lentivirale

  1. Per ricuocere gli oligo miscelare 1 μL di ciascun oligo accoppiato a 100 μM, 1 μL di tampone di legatura T4 10x, 0,5 μL di DNA Ligasi T4 (400.000 unità/mL) e 6,5 μL di H2O per raggiungere un volume totale di 10 μL. Incubare a 37 °C per 30 min, quindi 95 °C per 5 min, e rampa fino a 25 °C a 5 °C/min. Diluire a 100 μl utilizzando H2O.
  2. Digerire la spina dorsale del gRNA mescolando 2 μL di tampone dell'enzima di restrizione (RE) 10x, 300 ng di lenti_gRNA(MS2)_zeo plasmide della spina dorsale (Addgene #61427) in 1 μL, 1 μL di enzima BsmBI e 16 μL di H2O per raggiungere un volume totale di 20 μL. Incubare a 55 °C per 15 min.
  3. Miscelare i componenti della legatura con 20 μL di prodotto di digestione aggiungendo 2,5 μL di tampone di legatura T4 10x, 1 μL di prodotto di ricottura diluito e 1,5 μL di DNA ligasi T4 (400.000 unità/mL) in un sistema da 25 μL. Incubare a temperatura ambiente per 30 min.
  4. Trasformare 2 μl della miscela di legatura della fase 3.3 in cellule di E.coli competenti Stbl3. Impiattarli su una piastra di ampicillina LB-agar e incubare per una notte a 37 °C.
  5. Raccogli e inocula una singola colonia di batteri ed estrai il plasmide. Invialo per il sequenziamento Sanger per confermare che la sequenza di gRNA è inserita correttamente.
    NOTA: Le sequenze per i primer e i gRNA sono disponibili nella Tabella supplementare 1. Si consiglia di utilizzare le cellule di E.coli Stbl3 chimicamente competenti perché hanno una maggiore resa in DNA plasmidico e una maggiore stabilità plasmidica quando generano plasmidi lentivirali inclini all'instabilità32.

4. Test di efficienza del gRNA

NOTA: Sebbene possa non essere necessario per ogni gRNA, si raccomanda ai ricercatori di esaminare la qualità del gRNA eseguendo il saggio Surveyor (cioè il test di scissione del mismatch) per rilevare indel o mutazioni che possono essere generate in modo efficiente solo da gRNA di buona qualità33,34. Altri metodi come il Tracking of Indels by Decomposition (TIDE) possono essere utilizzati anche per determinare l'efficienza del gRNA30,35. La nucleasi surveyor è un membro di una famiglia di endonucleasi specifiche per il mismatch che possono tagliare il DNA a doppio filamento con mismatch (Figura 3A). La qualità dei gRNA può essere rivelata dall'efficacia della produzione di specie di DNA più piccole. In pratica, l'efficacia del taglio del surveyor può anche essere influenzata dall'efficienza di trasfezione dei gRNA e del Cas9.

  1. Trasfetta il gRNA insieme al plasmide pSpCas9(BB)-2A-Puro (Addgene #62988) che esprime la proteina Cas9 in cellule 293T utilizzando un reagente di trasfezione a base di lipidi. Utilizzare 1,2 μg/mL per ogni plasmide per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti. Continuare a coltivare le cellule per 3 giorni dopo la trasfezione. Raccogli ed estrai il DNA genomico secondo il protocollo del produttore36.
  2. Utilizzare la reazione a catena della polimerasi (PCR) per amplificare la regione dell'enhancer mirata dal DNA genomico. Utilizzare le condizioni PCR mostrate nella Tabella supplementare 2. Utilizzare i primer nella Tabella supplementare 1 per un esempio di potenziatore, NET1e. Denaturare i prodotti della PCR incubandoli a 95 °C per 10 minuti e riibridarli scendendo da 95 °C a 25 °C alla velocità di -0,3 °C/s per consentire al DNA a filamento singolo (ssDNA) con e senza indels o mutazioni indotte da gRNA di ricottura l'uno con l'altro.
  3. Digerire il DNA ibridato dalla nucleasi Surveyor (Figura 3A) seguendo il protocollo del produttore37. Miscelare 400 ng di DNA ibridato dalla fase 4.2, 1 μL di nucleasi Surveyor, 1 μL di enhancer Surveyor e 5 μL di 0,15 M MgCl2 in un sistema da 50 μL. Incubare a 42 °C per 60 min. Analizza il DNA su un gel di agarosio. Utilizzare il controllo negativo, come le cellule con solo Cas9 ma senza gRNA mirati, nel saggio e nell'elettroforesi su gel (Figura 3B).

5. Generazione di lentivirus

  1. Aggiungere psPAX2, pMD2.G e un plasmide bersaglio (ad es. lenti_dCas9-VP64_Blast, Addgene #61425; o lenti_MS2-p65-HSF1_Hygro, Addgene #61426) al rapporto di 3 μg : 1 μg : 4 μg in una provetta in polipropilene da 1,5 mL. Mescolarli con 500 μl di Opti-MEM e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
  2. In una provetta separata, mettere 10 μl del reagente di trasfezione a base lipidica in 500 μl di Opti-MEM e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
  3. Combinare i prodotti dei passaggi 5.1 e 5.2 e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
  4. Piastra le cellule 293T un giorno prima della trasfezione e lasciale raggiungere una confluenza di ~30% in una piastra di 10 cm al momento della trasfezione. Aggiungere 4 mL di terreno normale (DMEM con il 10% di FBS), quindi aggiungere il complesso dal passaggio 5.3 goccia per goccia alle cellule. Aggiungere DMEM con il 10% di FBS per ottenere il volume finale fino a 6 mL. Incubare per una notte in un incubatore cellulare a 37 °C con CO2 al 5%.
  5. Il giorno successivo, cambiare il terreno a 10 mL di nuovo DMEM con il 10% di FBS. Raccogliere il terreno 24 ore dopo il cambio del terreno. Utilizzare un filtro per siringa (ad es. 0,45 μm) per filtrare il terreno contenente il virus, quindi procedere alla fase 6 o conservare il virus a -80 °C.
    NOTA: Le operazioni con lentivirus richiedono un armadio di livello II di Biosicurezza. È necessario prestare attenzione per gestire in sicurezza gli esperimenti associati al virus; E se un contenitore è a contatto diretto con il mezzo virale, deve essere sbiancato per più di 20 minuti prima di essere smaltito come rischio biologico.

6. Coltura cellulare

  1. Mantenere le cellule in un incubatore per colture cellulari di CO2 a 37 °C con il 5% di CO2.
  2. Coltura di cellule MCF7 e 293T in terreno DMEM (Modified Eagle Medium) di Dulbecco con il 10% di FBS.
  3. Far crescere le cellule in piastre da 10 cm e dividerle in un rapporto da 1:3 a 1:5 quando sono confluenti.

7. Infezione cellulare e selezione

  1. Seminare le cellule bersaglio (ad es. MCF7) in una miscela di terreno virale contenente 0,5 mL di lenti_dCas9-VP64_Blast (Addgene #61425) e 0,5 mL di lenti_MS2-p65-HSF1_Hygro (Addgene #61426). Aggiungere 8 μg/mL di esaadimetrina bromuro per aumentare l'efficienza dell'infezione. Utilizzare un pozzetto di cellule non infette come controllo negativo per esaminare l'efficacia della selezione degli antibiotici.
    NOTA: La quantità di terreno virale è consigliata come segue: 6 ml di terreno virale per una piastra da 10 cm, 1 ml per un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e 0,5 ml per un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti.
  2. A 24 ore dall'infezione, aggiungere alle cellule un terreno fresco contenente blasticidina (5 μg/mL per le cellule MCF7) e igromicina (200 μg/mL per le cellule MCF7).
  3. Mantenere le cellule nel terreno di selezione antibiotica fino a quando le cellule di controllo negativo non muoiono.
    NOTA: Il tempo può variare affinché le diverse linee cellulari diventino stabili. Per MCF7, di solito ci vogliono 5-7 giorni perché le cellule non infette si estinguano completamente. Prima degli esperimenti, è necessario testare una curva di uccisione utilizzando una gamma di concentrazioni di antibiotici per una nuova linea cellulare. È accettabile utilizzare una miscela cellulare per i passaggi successivi, ma un'alternativa è quella di scegliere colonie unicellulari omogenee in termini di espressione delle due proteine effettrici. La linea stabile ottenuta è indicata come linea parentale effettrice SAM (ad esempio, linea effettrice SAM MCF7) in questo articolo. Si raccomanda di utilizzare una linea cellulare parentale SAM-effettrice condivisa per l'infezione da parte di diversi gRNA mirati o non mirati, soprattutto se i loro effetti saranno confrontati.
  4. Utilizzare il western blotting per determinare se le cellule esprimono stabilmente le due proteine effettrici (un esempio è mostrato nella Figura 4A). Utilizzare la trascrizione inversa degli RNA totali seguita da PCR quantitativa (RT-qPCR) come metodo alternativo per esaminare i livelli di espressione dei due mRNA (dCas9-VP64 e MS2-p65-HSF1, Figura 4B).
    NOTA: I primer per l'esame dei livelli di mRNA dei due effettori dCas9 sono disponibili nella Tabella supplementare 1.
  5. Generare lentivirus di gRNA costruiti nel passaggio 3.5 e infettare la linea cellulare SAM stabile che esprime doppiamente dCas9-VP64 e MS2-p65-HSF1 con un singolo lentivirus a gRNA. Aggiungere Zeocin (100 μg/mL per le cellule MCF7) al terreno 24 ore dopo la trasduzione virale del gRNA. Generare un controllo negativo che esprime gRNA non bersaglio (NT-gRNA) nella linea cellulare SAM parentale.
    NOTA: Assicurarsi che il farmaco di selezione sia specifico per il costrutto di interesse.

8. Estrazione dell'RNA e RT-PCR quantitativa per esaminare i livelli di eRNA

  1. Estrarre gli RNA totali da linee cellulari SAM che esprimono NT-gRNA o gRNA mirati utilizzando un kit di estrazione dell'RNA38 o un altro metodo basato sul cloroformio fenolico. Utilizzare cellule con confluenza ~80% in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti per l'estrazione dell'RNA.
    NOTA: Non è stata osservata alcuna differenza significativa nella nostra pratica per la rilevazione di eRNA quando gli RNA vengono estratti da colonne di legame commerciali o da reagenti fenolo cloroformio.
  2. Ricavare DNA complementare (cDNA) dall'RNA purificato mediante reazione di trascrizione inversa con esamero casuale, seguendo il protocollo39 del produttore. Condizioni d'uso nella Tabella supplementare 2.
    NOTA: Poiché la maggior parte degli eRNA sono 1,2,4,9,10 non poliadenilati, l'esamero casuale viene utilizzato di routine per la generazione di cDNA.
  3. Progettare primer per la misurazione di eRNA target RT-qPCR utilizzando uno strumento di progettazione di primer affidabile (ad esempio, Primer 3). Testare la linearità di amplificazione delle coppie di primer esaminando se i primer amplificheranno linearmente i cDNA diluiti seriali e mostreranno le differenze previste nel ciclo qPCR. Condizioni d'uso nella Tabella supplementare 2.
    NOTA: I primer per la RT-qPCR dovrebbero mirare alla regione altamente trascritta nell'RNA-seq nascente e il test di linearità dei primer dovrebbe includere un'ampia gamma di diluizioni di cDNA per garantire che vengano testati tutti i livelli di eRNA possibilmente riscontrabili. Un esempio di test di linearità è mostrato nella Figura 5A.
  4. Eseguire la RT-qPCR e analizzare i livelli di espressione dell'eRNA nelle cellule di controllo (linea cellulare SAM con NT-gRNA) e nella linea cellulare SAM con gRNA mirati all'eRNA (ad esempio, NET1e gRNA#1) (ad esempio, Figura 6A). I primer per l'RNA NET1e sono mostrati nella Tabella supplementare 1. Condizioni d'uso nella Tabella supplementare 2.  

9. dCas9 ChIP e qPCR

NOTA: Questo passaggio è un esperimento opzionale per convalidare il legame del complesso dCas9/SAM-gRNA all'enhancer target da parte di specifici gRNA. Sebbene sia incoraggiato che gli utenti eseguano questo passaggio, non è necessario testare ogni singolo gRNA. Fare riferimento a un esempio mostrato nella Figura 5B. Fare riferimento ai primer elencati nella Tabella supplementare 1.

  1. Celle di reticolazione
    1. Rimuovere il terreno dalle cellule e aggiungere l'1% di formaldeide disciolta in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Lasciare agire per 10 min.
    2. Aggiungere 2,5 M di glicina a 1:20 di volume per spegnere la reticolazione e lavare le cellule due volte con PBS ghiacciato. Aggiungere 700 μl di PBS ghiacciato e raschiare le cellule in una provetta da 1,5 mL.
    3. Centrifugare a 2.000 x g per 5 minuti a 4 °C. Procedere al passaggio 9.2 o congelare a scatto e conservare a -80 °C.
  2. Sonicare
    1. Crea nuovi tamponi LB1, LB2 e LB3. LB1: 50 mM Hepes-KOH (pH 7,5), 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glicerolo, 0,5% NP-40, 0,25% Triton-X 100 e 1x inibitore della proteasi. LB2: 10 mM di Tris-HCl (pH 8,0), 200 mM di NaCl, 1 mM di EDTA, 0,5 mM di EGTA e 1x inibitore della proteasi. LB3: 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 0,1% Na-desossicolato, 0,5% N-lauroilsarcosina e 1x inibitore della proteasi. Integrare 1x inibitore della proteasi appena al tampone prima dell'esperimento.
    2. Aggiungere 1 mL di tampone LB1 ai pellet cellulari, pipettare bene, ruotare a 4 °C per 10 minuti e centrifugare a 2.000 x g per 5 minuti a 4 °C. Versare il surnatante, aggiungere 1 mL di tampone LB2, ruotare a 4 °C per 10 minuti e centrifugare a 2.000 x g per 5 minuti a 4 °C. Versare il surnatante e rimuovere l'eccesso del tampone LB2. Aggiungere 300 μl di tampone LB3.
    3. Sonicare e frammentare il DNA della cromatina a una dimensione media di ~200-400 bp utilizzando un sistema di sonicazione adeguato. Dopo la sonicazione, aggiungere 30 μL di Triton-X 100 al 10% e mescolare bene. Testare il tempo di sonicazione corretto se viene utilizzata una nuova linea cellulare.
    4. Centrifugare a 14.000 x g per rimuovere il pellet. Trasferire il surnatante nella nuova provetta e aggiungere 630 μL di LB3 e 70 μL di Triton X-100 al 10% per un volume totale di 1 mL. Aggiungere 2 μg di anticorpo Cas9 al surnatante e ruotare a 4 °C durante la notte.
  3. Cattura di immunocomplessi e reticolazione inversa
    1. Preparare il tampone RIPA (50 mM HEPES pH 7,6, 1 mM EDTA, 0,7% Na-desossicolato, 1% NP-40, 0,5 M LiCl) e il tampone di eluizione (1% SDS e 0,1 M NaHCO3).
    2. Lavare le dynabeads Protein G con l'1% di BSA in PBS 3 volte e tampone LB3 una volta.
    3. Aggiungere 30 μl di proteine G dynabeads al campione e incubare a 4 °C per 4 ore.
    4. Lavare il complesso immuno-microsfere in 500 μL di tampone RIPA 6x. Non lasciare che le perline si secchino.
    5. Lavare una volta il complesso immuno-perline con tampone TE; Rimuovere il buffer.
    6. Aggiungere 200 μL di tampone di eluizione all'immunocomplesso delle microsfere e al vortice; quindi metterlo in uno shaker riscaldato a temperatura regolabile impostato a 65 °C con 600 giri/min agitando per 6-16 ore per invertire la reticolazione.
  4. Estrazione del DNA
    1. Togliete i tubi dallo shaker, fate girare brevemente le perline e mettetele su un supporto magnetico. Trasferire 200 μl di surnatante in una provetta nuova e aggiungere 200 μl di tampone TE.
    2. Aggiungere 1 μL di RNasi A (1 mg/mL) alla provetta e incubare a 37 °C per 1 ora.
    3. Dopo 1 ora di incubazione, aggiungere 2 μL di proteinasi K (20 mg/mL) al campione e incubarlo a 65 °C per 2 ore.
    4. Centrifugare brevemente e aggiungere 400 μl di miscela di fenolo-cloroformio-alcol isoamilico. Mescolare bene, quindi centrifugare per 5 minuti a 10.000 x g.
    5. Spostare 400 μl dello strato superiore in una provetta da 1,7 mL contenente 16 μl di NaCl 5 M e 1 μl di glicogeno (20 μg/μl) e mescolare bene.
    6. Aggiungere 800 μL di etanolo al 100% e lasciare agire per una notte a -20 °C.
    7. La mattina successiva, centrifugare le provette a 4 °C a 14.000 x g per 15 minuti.
    8. Rimuovere il surnatante e lavare il pellet con 1 mL di etanolo al 70%. Centrifugare a 14.000 x g per 10 min.
    9. Rimuovere l'etanolo, essiccare il pellet all'aria e risospendere in 50 μL di TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA).
  5. Eseguire ChIP-qPCR per esaminare il reclutamento del complesso SAM nel sito di targeting mediante una coppia di primer di targeting del core enhancer. Utilizzare una coppia di primer che prende di mira una regione irrilevante come controllo negativo.

10. Saggio di crescita cellulare e altri test funzionali di iperattivazione dell'eRNA

  1. Tripsinizzare le linee cellulari SAM che esprimono il gRNA non bersaglio o i gRNA mirati all'eRNA e piastra ~3.000 cellule per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti.
  2. Misurare la crescita cellulare utilizzando un imager di cellule vive o altri metodi (ad esempio, conteggio delle cellule o saggio del sale-1 di tetrazolio solubile in acqua).
  3. Utilizzare la concentrazione inibitoria semi-massima (IC50) per testare le risposte cellulari a specifici farmaci antitumorali in cellule con o senza sovraespressione di NET1e da parte di SAM15.
    NOTA: I risultati dei saggi di crescita cellulare e dei test di sensibilità ai farmaci delle cellule di cancro al seno sono presentati dopo la sovraespressione di un eRNA trascritto adiacente al gene NET1 , che è stato indicato come NET1e15. Altri saggi possono essere condotti a livello cellulare o dell'organismo in base alle esigenze di ogni specifico progetto.

Risultati

Nella Figura 1 viene illustrato il flusso di lavoro complessivo di questo protocollo. La nostra attenzione si è concentrata su un eRNA rappresentativo, NET1e15, che è sovraespresso nel cancro al seno, per il quale il sistema SAM è stato utilizzato per attivare e studiare il suo ruolo biologico nella regolazione dell'espressione genica, della proliferazione cellulare e della risposta ai farmaci antitumorali. Per questo enha...

Discussione

Sulla base dei nostri dati, concludiamo che il sistema SAM è adatto per studiare il ruolo degli eRNA nella regolazione dei fenotipi cellulari, ad esempio la crescita cellulare o la resistenza ai farmaci. Tuttavia, è necessaria un'attenta progettazione del gRNA per una robusta attivazione dell'eRNA, per i seguenti motivi. Prima di tutto, il sito di inizio della trascrizione (TSS) dell'eRNA in ogni specifica linea/tipo di cellula rimane meno chiaramente annotato. A causa di ciò, le info...

Divulgazioni

Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del Cancer Prevention and Research Institute of Texas.

Riconoscimenti

Questo lavoro è supportato da sovvenzioni a W.L (Cancer Prevention and Research Institute of Texas, CPRIT RR160083 e RP180734; NCI K22CA204468; NIGMS R21GM132778; Il premio UT Stars dell'Università del Texas; e la Welch foundation AU-2000-20190330) e una borsa di studio post-dottorato a J.L (UTHealth Innovation for Cancer Prevention Research Training Program Post-doctoral Fellowship, CPRIT RP160015). Riconosciamo la pubblicazione originale15 da cui sono state adottate alcune delle nostre figure attuali (con modifiche), che segue la licenza Creative Commons (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
BlasticidinGoldbioB-800-100
BsmBI restriction enzymeNew England BioLabs Inc.R0580S
Cas9 mAbActive Motif61757Lot: 10216001
Deoxynucleotide (dNTP) Solution MixNew England BioLabs Inc.N0447S
Dulbecco’s Modified Eagle MediumCorning10-013-CM
Dynabeads Protein GThermo Fisher Scientific65002
EDTAThermo Fisher ScientificBP118-500
EGTASigmaE3889
Fetal Bovine SerumGenDEPOTF0900-050
GlycogenThermo Fisher Scientific10814010
Hepes-KOHThermo Fisher ScientificBP310-100
Hexadimethrine BromideSigmaH9268
Hygromycin BGoldbioH-270-25
IGEPAL CA630SigmaD6750
IncuCyte live-cell imagerEssen BioScienceIncuCyte S3 Live-Cell Analysis System
lenti_dCAS-VP64_BlastAddgene61425
lenti_gRNA(MS2)_zeo backboneAddgene61427
lenti_MS2-p65-HSF1_HygroAddgene61426
LiCLSigmaL9650
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668-500
NaClSigmaS3014
Na-DeoxycholateSigmaD6750
NaHCO3Thermo Fisher ScientificBP328-500
N-lauroylsarcosineSigma97-78-9
Opti-MEM Reduced Serum MediumThermo Fisher Scientific31985070
PES syringe filterBASIX13-1001-07
Protease Inhibitor Cocktail TabletRoche Diagnostic11836145001
pSpCas9(BB)-2A-PuroAddgene62988
Q5 High-Fidelity DNA PolymeraseNew England BioLabs Inc.M0491S
Q5 Reaction BufferNew England BioLabs Inc.B9027S
Quick-DNA MiniprepZYMO ResearchD3025
Quick-RNA MiniprepZYMO ResearchR1054
Restriction enzyme bufferNew England BioLabs Inc.B7203S
RT-qPCR Detection SystemThermo Fisher ScientificQuant Studio3
SDSThermo Fisher ScientificBP359-500
SonicatorQsonicaQ800R2
Sso Advanced Universal SYBR Green SupermixBio-Rad Laboratories1725274
Stbl3 competent cellThermo Fisher ScientificC7373-03
Superscript IV reverse transcriptThermo Fisher Scientific719000
Surveyor Mutation Detection KitsIntegrated DNA Technologies706020
T4 DNA LigaseNew England BioLabs Inc.M0202S
T4 DNA Ligase Reaction BufferNew England BioLabs Inc.B0202S
TE bufferThermo Fisher Scientific46009CM
Thermal cyclerBio-Rad LaboratoriesT100
ThermomixerSigma5384000020
ZeocinThermo Fisher Scientificant-zn-1p

Riferimenti

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