JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Arttırıcı RNA'lar (eRNA'lar), aktif arttırıcılardan üretilen kodlamayan RNA'lardır. eRNA fonksiyonlarını incelemek için en uygun yaklaşım, doğal kromatin bölgelerindeki seviyelerini manipüle etmektir. Burada, ilgilenilen eRNA'ların ekspresyonunu indüklemek için CRISPR-dCas9 ile kaynaşmış transkripsiyonel aktivatörler kullanarak eRNA çalışmaları için sağlam bir sistem sunuyoruz.

Özet

Arttırıcılar, memeli genomu boyunca dağılmış çok önemli genomik elementlerdir ve dokuya özgü gen ekspresyon programlarını belirler. Artan kanıtlar, güçlendiricilerin yalnızca transkripsiyon faktörleri (TF'ler) için DNA bağlanma motifleri sağlamakla kalmayıp, aynı zamanda eRNA'lar olarak adlandırılan kodlamayan RNA'lar da ürettiğini göstermiştir. Çalışmalar, eRNA transkriptlerinin hem fizyolojide hem de hastalıkta gen regülasyonunda önemli roller oynayabileceğini göstermiştir. eRNA'ların işlevini araştırmak için yaygın olarak kullanılan yöntemler, eRNA'ların yıkılması veya arttırıcı transkripsiyonun kimyasal inhibisyonu yoluyla "işlev kaybı" yaklaşımlarıyla sınırlıdır. eRNA'ların genellikle aşırı eksprese edildiği insan kanseri gibi spesifik hastalık durumlarını taklit etmek için eRNA'ların "işlev kazanımı" çalışmalarını yürütmek için sağlam bir yöntem yoktur. Burada, dCas9 aracılı Sinerjik Aktivasyon Aracıları (SAM) sistemini uygulayarak rollerinin işlevsel olarak sorgulanması için eRNA'ları hassas ve sağlam bir şekilde aktive etmek için bir yöntem sunuyoruz. eRNA'ların seçiminden, gRNA'ların tasarımından eRNA aktivasyonunun RT-qPCR ile doğrulanmasına kadar eRNA aktivasyonunun tüm iş akışını sunuyoruz. Bu yöntem, belirli bir eRNA'nın gen regülasyonu ve hastalık gelişimindeki rollerini incelemek için benzersiz bir yaklaşımı temsil eder. Ek olarak, bu sistem, belirli bir hastalık bağlamında fenotip süren eRNA hedeflerini belirlemek için tarafsız CRISPR taraması için kullanılabilir.

Giriş

İnsan genomu, düzenleyici elementlerin bir takımyıldızınıiçerir 1,2,3. Bunlar arasında, arttırıcılar en kritik kategorilerden biri olarak ortaya çıkmaktadır 4,5,6. Arttırıcılar, gelişimin düzenlenmesinde önemli roller oynarlar ve hücre kimliğini belirlemek için mekansal-zamansal gen ekspresyon programları oluşturmaktan sorumludurlar 5,6,7. Geleneksel olarak, arttırıcılar yalnızca transkripsiyon faktörleri (TF'ler) için bağlanma motifleri sağlayan ve daha sonra hedef gen ekspresyonunu kontrol eden DNA elemanları olarak kabul edilir 6,8. Bununla birlikte, bir dizi çalışma, birçok aktif geliştiricinin, kodlamayan güçlendirici RNA'ları (yani eRNA'lar) da kopyaladığını bulmuştur4,9,10.

eRNA transkripsiyon seviyesinin, bir arttırıcının aktivitesi ile ilişkili olduğu bulundu 4,10. Aktif arttırıcılar daha fazla eRNA transkripti üretir ve H3K27ac ve H3K4me1 9,11,12 gibi aktif transkripsiyonla ilişkili daha yüksek seviyelerde epigenom belirteçleri gösterir. Bazı çalışmalar, eRNA transkriptlerinin hedef genlerintranskripsiyonel aktivasyonunda önemli roller oynayabileceğini göstermiştir 10,12. İnsan kanserlerinde 13,14,15,16 çok sayıda eRNA'nın deregüle edildiği tespit edildi ve bunların çoğu yüksek kanser tipi özgüllüğü ve klinik önemi sergiledi. Bu bulgular, tümör oluşumunu yönlendirebilen/teşvik edebilen eRNA'ların aydınlatılmasının terapötik müdahale için yeni hedefler sunabileceğine dair fırsatlar sunmaktadır13,15.

eRNA fonksiyonlarını incelemek için mevcut yöntemler neredeyse tamamen küçük girişim RNA'ları (siRNA), kısa firkete RNA'ları (shRNA'lar) veya antisens oligonükleotidler (kilitli nükleik asitlerin (LNA'lar) araştırmada yaygın olarak kullanılan tip olduğu ASO'lar) kullanan knockdown stratejilerine dayanmaktadır)10,12,17. Bununla birlikte, kanser gibi insan hastalıkları, bitişik normal dokularına kıyasla ağırlıklı olarak eRNA'ların aşırı ekspresyonunu gösterir15 ve fonksiyonel çalışmalar için hastalıkla ilgili ekspresyon modellerini taklit etmek için eRNA'ları "aşırı eksprese etmek" için araçlar gerektirir. Bunu başarmak için, plazmid bazlı bir ektopik aşırı ekspresyon sistemi optimal değildir, çünkü eRNA'ların kesin transkripsiyon başlangıç ve sonlandırma bölgeleri büyük ölçüde belirsizliğini korumaktadır. Ek olarak, bir plazmit ekspresyon sistemi, eRNA'ların konumunu değiştirerek işlevlerinde potansiyel artefaktlara neden olabilir18. Burada, CRISPR/dCas9-Sinerjik Aktivasyon Aracıları Sistemine (SAM) dayanan, üretimlerinin doğal genomik lokusunda (yani yerinde) "aşırı ekspresyonlarını" zorlayarak eRNA'ların işlevsel karakterizasyonunu kolaylaştırmak için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

SAM sistemi başlangıçta melanom hücrelerinde BRAF inhibitörü direnci ile ilişkili kodlayan genleri ve uzun intergenik kodlamayan RNA'ları (lincRNA'lar) aktive etmek için geliştirilmiştir19. Diğer CRISPR aktivasyon (CRISPRa) teknolojilerinden farklı olarak, SAM sistemi, hedef bölgelerin sağlam transkripsiyonel aktivasyonunu sağlamak için transkripsiyon aktivatörlerinin bir kombinasyonundan oluşur. Bu aktivatörler şunları içerir: VP64 (yani, dCas9-VP64) ile kaynaşmış enzimatik olarak ölü bir Cas9 (dCas9); iki MS2 RNA aptameri ve bir MS2-p65-HSF1 füzyon aktivatör proteini içeren bir kılavuz RNA. gRNA'daki MS2 aptamerlerinin varlığı, MS2-p65-HSF1 füzyon proteinini dCas9/gRNA bağlanma bölgelerinin yakınına alabilir. Bunlar arasında VP64, genel transkripsiyon faktörlerini20,21,22 işe alarak gen transkripsiyonunu güçlü bir şekilde aktive ettiği gösterilen herpes simpleks VP16 transkripsiyonel aktivatör alanının tasarlanmış bir tetrameridir. MS2-p65-HSF1 füzyon proteini üç bölümden oluşur. İlk kısım olan MS2-N55K, daha güçlü bir afiniteye23 sahip olan MS2 bağlayıcı proteinin mutant bir formudur; bu füzyon proteininin diğer iki kısmı, her ikisi de güçlü transaktivasyon alanlarına sahip olan ve sağlam transkripsiyon programlarını indükleyebilen transkripsiyon faktörleri olan p65 ve ısı şok faktörü 1'in (HSF1) transaktivasyon alanıdır24,25. Bu nedenle, SAM sistemi esasen belirlenmiş kodlama genlerinin ve lincRNA'ların transkripsiyonunu aktive etmek için oldukça güçlü bir aktivatör kompleksi yarattı19.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu protokolün tüm iş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir.

1. Arttırıcı RNA (eRNA) seçimi

  1. Kromatin immünopresipitasyon dizileme (ChIP-Seq) verilerinin, yani histon modifikasyonlarının (örneğin, H3K4me1 ve H3K27ac) veya transkripsiyon koaktivatörlerinin (örneğin, p300) bağlayıcı zirvelerini kullanarak varsayılan bir arttırıcı ilgi bölgesini tanımlayın.
  2. ChIP-Seq zirvesini RNA-seq sinyalleriyle (örneğin, toplam RNA-seq veya Global Run-On Sequencing (GRO-Seq) gibi yeni ortaya çıkan RNA-seq'den keserek ilgilenilen eRNA'yı tanımlayın.
    NOT: gRNA'ları tasarlamak için seçilen bölge genellikle TF'lerin veya koaktivatörlerin (örneğin, p300) net ChIP-seq zirveleri gösterdiği "güçlendirici çekirdek" bölgesi ile sınırlı olmalıdır (Şekil 2A). dCas9 ve füzyon koaktivatörleri, koaktivatörlerin doğal bağlanmasını taklit etmek için bu bölgeye bir gRNA tarafından alınacaktır (Şekil 2A). Gen Ekspresyonunun Kapak Analizi (CAGE)4 veya GRO-cap26 gibi spesifik veri kümeleri mevcutsa, bunlar zıt yönlerekopyalanan eRNA'ların iki transkripsiyon başlangıç bölgesi arasındaki bölge olan "güçlendirici çekirdeği" kesin olarak belirlemek için kullanılabilir 4,10,26.

2. gRNA tasarımı

  1. Hedefleme dışı düşük potansiyele (http://crispor.tefor.net/) sahip gRNA'ları seçmek için CRISPOR27 gibi yaygın CRISPR gRNA tasarım araçlarını kullanın.
    NOT: Benchling28 veya CHOPCHOP29 gibi diğer araçlar da gRNA tasarımı için ek seçenekler olarak kullanılabilir.
  2. Geliştirici çekirdek DNA dizisini CRISPOR web sitesindeki Adım 1 sütununa yapıştırın, ardından Adım 2 sütununda ilgili genomu (örneğin, insan) seçmek için açılır düğmeyi tıklayın. Protospacer Bitişik Motif (PAM) dizisini Adım 3 sütununda "NGG" olarak ayarlamak için açılır düğmeyi tıklayın ve ardından 20 bp uzunluğunda kılavuz dizileri oluşturmak için "Gönder" düğmesini tıklayın.
  3. CRISPOR aracında en yüksek özgüllük puanlarına, yani düşük hedef dışı potansiyele sahip kılavuzları seçin, ardından sırasıyla 5' ucuna "CACCG" ve 3' ucuna "C" ekleyin.
    NOT: En yüksek özgüllük puanına sahip kılavuzları seçin (CRISPOR'da >85 tercih edilir).
  4. Ticari kaynaklardan her bir duyu ve antisens dizisi için oligonükleotidler sipariş edin.
    NOT: CRISPR/Cas9 gRNA tasarımı ile ilgili ek talimatlar diğer çalışmalardabulunabilir 30,31. Adım 2.2'deki çıkıntılar, gRNA'yı BsmBI kısıtlama enzimini kullanan SAM gRNA omurgası (Addgene #61427) ile uyumlu hale getirecektir.

3. gRNA'ları lentiviral bir yapıya klonlayın

  1. Oligoları tavlamak için 100 μM'de her eşleştirilmiş oligodan 1 μL, 1 μL 10x T4 ligasyon tamponu, 0.5 μL T4 DNA Ligaz (400.000 birim / mL) ve 6.5 μL H2O karıştırın ve toplam 10 μL hacme ulaşın. 37 ° C'de 30 dakika, ardından 95 ° C'de 5 dakika inkübe edin, ve 5 °C/dk'da 25 °C'ye kadar rampa. H2O kullanarak 100 μL'ye seyreltin.
  2. 2 μL 10x restriksiyon enzimi (RE) Tamponu, 300 ng lenti_gRNA(MS2)_zeo omurga plazmidini (Addgene #61427) 1 μL, 1 μL BsmBI enzimi ve 16 μL H2O'da karıştırarak gRNA omurgasını sindirin ve toplam 20 μL hacme ulaşın. 55 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
  3. 25 μL'lik bir sisteme 2,5 μL 10x T4 ligasyon tamponu, 1 μL seyreltilmiş tavlama ürünü ve 1,5 μL T4 DNA ligaz (400.000 birim / mL) ekleyerek ligasyon bileşenlerini 20 μL sindirim ürünü ile karıştırın. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
  4. Adım 3.3'ten itibaren 2 μL'lik ligasyon karışımını Stbl3 yetkin E.coli hücrelerine dönüştürün. Onları bir ampisilin LB-agar plakasına koyun ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  5. Tek bir bakteri kolonisini seçin ve aşılayın ve plazmidi çıkarın. gRNA dizisinin doğru şekilde yerleştirildiğini doğrulamak için Sanger dizilimi için gönderin.
    NOT: Primerler ve gRNA'lar için diziler Ek Tablo 1'de mevcuttur. Stbl3 kimyasal olarak yetkin E.coli hücrelerinin burada kullanılması tavsiye edilir, çünkü kararsızlığa eğilimli lentivirüs plazmitleri üretirken daha yüksek plazmit DNA verimine ve daha yüksek plazmit stabilitesine sahiptirler32.

4. gRNA verimlilik testi

NOT: Her gRNA için gerekli olmasa da, araştırmacıların, yalnızca kaliteli gRNA'lar tarafından verimli bir şekilde üretilebilen indelleri veya mutasyonları tespit etmek için Surveyor testi (yani uyumsuzluk bölünme testi) yaparak gRNA'nın kalitesini incelemeleri önerilir33,34. GRNA verimliliğini belirlemek için Indellerin Ayrışma Yoluyla İzlenmesi (TIDE) gibi diğer yöntemler de kullanılabilir30,35. Surveyor nükleaz, uyumsuzluklarla çift sarmallı DNA'yı kesebilen, uyumsuzluğa özgü endonükleazlar ailesinin bir üyesidir (Şekil 3A). gRNA'ların kalitesi, daha küçük DNA türlerinin üretilmesinin etkinliği ile ortaya çıkarılabilir. Pratik olarak, sörveyör kesme etkinliği, gRNA'ların ve Cas9'un transfeksiyon verimliliğinden de etkilenebilir.

  1. Cas9 proteinini lipid bazlı bir transfeksiyon reaktifi kullanarak 293T hücrelerine eksprese eden pSpCas9(BB)-2A-Puro (Addgene # 62988) plazmidi ile birlikte gRNA'yı transfekte edin. 6 oyuklu bir plakada oyuk başına her plazmit için 1.2 μg / mL kullanın. Transfeksiyondan sonra 3 gün boyunca hücreleri kültürlemeye devam edin. Üreticinin protokolüne göre genomik DNA'yı hasat edin ve çıkarın36.
  2. Genomik DNA'dan hedeflenen arttırıcı bölgeyi amplifiye etmek için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kullanın. Ek Tablo 2'de gösterilen PCR koşullarını kullanın. Örnek bir geliştirici olan NET1e için Ek Tablo 1'deki astarları kullanın. PCR ürünlerini 95 °C'de 10 dakika inkübe ederek denatüre edin ve gRNA ile indüklenen indeller veya mutasyonlar olan ve olmayan tek sarmallı DNA'nın (ssDNA) -0,3 °C/s hızında 95 °C'den 25 °C'ye düşürerek yeniden hibritleştirin.
  3. Hibritleştirilmiş DNA'yı, üreticinin 37 protokolünü izleyerek Surveyor nükleaz (Şekil 3A) ile sindirin. 50 μL'lik bir sistemde 4.2. adımdan 400 ng hibritleştirilmiş DNA, 1 μL Surveyor nükleaz, 1 μL Surveyor arttırıcı ve 5 μL 0.15 M MgCl2'yi karıştırın. 42 °C'de 60 dakika inkübe edin. DNA'yı bir agaroz jeli üzerinde analiz edin. Tahlil ve jel elektroforezinde sadece Cas9'lu hücreler gibi ancak gRNA'ları hedeflemeyen negatif kontrol kullanın (Şekil 3B).

5. Lentivirüs üretimi

  1. 1.5 mL'lik bir polipropilen tüpte 3 μg : 1 μg : 4 μg oranında psPAX2, pMD2.G ve bir hedef plazmit (örneğin, lenti_dCas9-VP64_Blast, Addgene # 61425; veya lenti_MS2-p65-HSF1_Hygro, Addgene # 61426) ekleyin. Bunları 500 μL Opti-MEM ile karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
  2. Ayrı bir tüpe, 500 μL Opti-MEM içine 10 μL lipid bazlı transfeksiyon reaktifi koyun ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
  3. Adım 5.1 ve 5.2'deki ürünleri birleştirin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
  4. Transfeksiyondan bir gün önce 293T hücrelerini plakalayın ve transfeksiyon sırasında 10 cm'lik bir tabakta ~% 30'luk bir birleşime ulaşmalarına izin verin. 4 mL normal ortam (% 10 FBS ile DMEM) ekleyin, ardından kompleksi 5.3 adımından hücrelere damla damla ekleyin. Son hacmi 6 mL'ye çıkarmak için %10 FBS ile DMEM ekleyin. % 5 CO2 ile 37 ° C'de bir hücre inkübatöründe gece boyunca inkübe edin.
  5. Ertesi gün, ortamı %10 FBS ile 10 mL yeni DMEM olarak değiştirin. Orta değişimden 24 saat sonra ortamı hasat edin. Virüs içeren ortamı filtrelemek için bir şırınga filtresi (örn. 0,45 μm) kullanın ve ardından 6. adıma geçin veya virüsü -80 °C'de saklayın.
    NOT: Lentivirus işlemleri için Biyogüvenlik Seviye II kabini gerekir. Virüsle ilişkili deneylerin güvenli bir şekilde ele alınması için dikkatli olunması gerekir; Ve herhangi bir kabın viral ortamla doğrudan teması varsa, biyolojik tehlike olarak atılmadan önce 20 dakikadan fazla ağartılması gerekir.

6. Hücre kültürü

  1. Hücreleri% 5 CO 2 ile 37 ° C'de bir CO2 hücre kültürü inkübatöründetutun.
  2. Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium (DMEM) ortamında MCF7 ve 293T hücrelerini %10 FBS ile kültürleyin.
  3. Hücreleri 10 cm'lik tabaklarda büyütün ve birleştiğinde 1:3 ila 1:5 oranında bölün.

7. Hücre enfeksiyonu ve seçimi

  1. Hedef hücreleri (ör., MCF7) doğrudan 0.5 mL lenti_dCas9-VP64_Blast (Addgene #61425) ve 0.5 mL lenti_MS2-p65-HSF1_Hygro (Addgene #61426) içeren viral ortam karışımına tohumlayın. Enfeksiyonun etkinliğini artırmak için 8 μg/mL Heksadimetrin bromür ekleyin. Antibiyotik seçiminin etkinliğini incelemek için negatif bir kontrol olarak enfekte olmamış hücrelerin bir kuyusunu kullanın.
    NOT: Viral ortam miktarı şu şekilde önerilir: 10 cm'lik bir tabak için 6 mL viral ortam, 6 oyuklu bir plakanın kuyusu için 1 mL ve 12 oyuklu bir plakanın kuyusu için 0.5 mL.
  2. Enfeksiyondan 24 saat sonra, hücrelere Blasticidin (MCF7 hücreleri için 5 μg / mL) ve Higromisin (MCF7 hücreleri için 200 μg / mL) içeren taze ortam ekleyin.
  3. Negatif kontrol hücreleri ölene kadar hücreleri antibiyotik seçim ortamında tutun.
    NOT: Farklı hücre hatlarının kararlı hale gelmesi için geçen süre değişebilir. MCF7 için, enfekte olmayan hücrelerin tamamen ölmesi genellikle 5-7 gün sürer. Deneylerden önce yeni bir hücre hattı için bir dizi antibiyotik konsantrasyonu kullanan bir öldürme eğrisi test edilmelidir. Sonraki adımlar için bir hücre karışımının kullanılması kabul edilebilir, ancak bir alternatif, iki efektör proteinin ekspresyonu açısından homojen olan tek hücreli kolonilerin seçilmesidir. Elde edilen kararlı çizgi, bu yazıda SAM-efektör ebeveyn çizgisi (örneğin, MCF7 SAM-efektör çizgisi) olarak adlandırılır. Farklı hedefleme veya hedefleme dışı gRNA'ların neden olduğu enfeksiyon için, özellikle etkileri karşılaştırılacaksa, paylaşılan bir SAM-efektör ebeveyn hücre hattının kullanılması önerilir.
  4. Hücrelerin iki efektör proteini kararlı bir şekilde ifade edip etmediğini belirlemek için western blotlama kullanın (Şekil 4A'da bir örnek gösterilmiştir). İki mRNA'nın ekspresyon seviyelerini incelemek için alternatif bir yöntem olarak toplam RNA'ların ters transkripsiyonunu ve ardından kantitatif PCR'yi (RT-qPCR) kullanın (dCas9-VP64 ve MS2-p65-HSF1, Şekil 4B).
    NOT: İki dCas9 efektörünün mRNA seviyelerini incelemek için primerler Ek Tablo 1'de mevcuttur.
  5. Adım 3.5'te oluşturulan gRNA'ların lentivirüsünü oluşturun ve dCas9-VP64 ve MS2-p65-HSF1'i çift olarak eksprese eden kararlı SAM hücre hattını bireysel gRNA lentivirüsü ile enfekte edin. gRNA viral transdüksiyonundan 24 saat sonra ortama Zeocin (MCF7 hücreleri için 100 μg/mL) ekleyin. Ebeveyn SAM hücre hattında hedeflenmeyen gRNA'yı (NT-gRNA) ifade eden negatif bir kontrol oluşturun.
    NOT: Seçilen ilacın ilgilenilen yapıya özgü olduğundan emin olun.

8. eRNA seviyelerini incelemek için RNA ekstraksiyonu ve kantitatif RT-PCR

  1. Bir RNA ekstraksiyon kiti38 veya başka bir fenol kloroform bazlı yöntem kullanarak NT-gRNA'yı eksprese eden veya gRNA'ları hedefleyen SAM hücre hatlarından toplam RNA'ları çıkarın. RNA ekstraksiyonu için altı oyuklu bir plakanın bir oyuğunda ~% 80 birleşme hücresi kullanın.
    NOT: RNA'lar ticari bağlama kolonları veya fenol kloroform reaktifleri ile ekstrakte edildiğinde eRNA tespiti için uygulamamızda önemli bir fark gözlenmemiştir.
  2. Üreticinin39 protokolünü izleyerek rastgele heksamer ile ters transkripsiyon reaksiyonu ile saflaştırılmış RNA'dan tamamlayıcı DNA (cDNA) yapın. Ek Tablo 2'deki kullanım koşulları.
    NOT: eRNA'ların çoğunluğu poliadenillenmemiş 1,2,4,9,10 olduğundan, cDNA üretimi için rutin olarak rastgele heksamer kullanılır.
  3. Saygın bir primer tasarım aracı (örneğin, Primer 3) kullanarak hedef eRNA'ları ölçen RT-qPCR için primerler tasarlayın. Primerlerin seri seyreltilmiş cDNA'ları doğrusal olarak amplifiye edip etmeyeceğini ve beklenen qPCR döngü farklılıklarını gösterip göstermeyeceğini inceleyerek primer çiftlerinin amplifikasyon doğrusallığını test edin.  Ek Tablo 2'deki kullanım koşulları.
    NOT: RT-qPCR için primerler, yeni ortaya çıkan RNA-seq'deki yüksek oranda kopyalanan bölgeyi hedeflemelidir ve primerlerin doğrusallık testi, muhtemelen karşılaşılabilir tüm eRNA seviyelerinin test edilmesini sağlamak için geniş bir cDNA seyreltme aralığı içermelidir. Doğrusallık testinin bir örneği Şekil 5A'da gösterilmiştir.
  4. RT-qPCR gerçekleştirin ve kontrol hücrelerinde (NT-gRNA ile SAM hücre hattı) ve eRNA hedefli gRNA'larla SAM hücre hattında (örn., NET1e gRNA#1) eRNA ekspresyon seviyelerini analiz edin (örn., Şekil 6A). NET1e RNA için primerler Ek Tablo 1'de gösterilmiştir. Ek Tablo 2'deki kullanım koşulları.  

9. dCas9 ChIP ve qPCR

NOT: Bu adım, dCas9/SAM-gRNA kompleksinin spesifik gRNA'lar tarafından hedef güçlendiriciye bağlanmasını doğrulamak için isteğe bağlı bir deneydir. Kullanıcıların bu adımı gerçekleştirmesi teşvik edilse de, her bir gRNA'yı test etmek gerekli değildir. Şekil 5B'de gösterilen bir örneğe bakın. Ek Tablo 1'de listelenen primerlere bakın.

  1. Çapraz bağlantı hücreleri
    1. Ortamı hücrelerden çıkarın ve fosfat tamponlu salin (PBS) içinde çözülmüş %1 formaldehit ekleyin. 10 dakika bekletin.
    2. Çapraz bağlanmayı söndürmek için 1:20 hacimde 2,5 M glisin ekleyin ve hücreleri buz gibi soğuk PBS ile iki kez yıkayın. 700 μL buz gibi soğuk PBS ekleyin ve hücreleri 1,5 mL'lik bir tüpe kazıyın.
    3. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 2.000 x g'da santrifüjleyin. Adım 9.2'ye geçin veya ani dondurun ve -80 °C'de saklayın.
  2. Sonikat
    1. Yeni LB1, LB2 ve LB3 tamponları yapın. LB1: 50 mM Hepes-KOH (pH 7.5), 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, %10 gliserol, %0.5 NP-40, %0.25 Triton-X 100 ve 1x Proteaz inhibitörü. LB2: 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA ve 1x Proteaz inhibitörü. LB3: 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA, %0.1 Na-Deoksikolat, %0.5 N-lauroilsarkozin ve 1x Proteaz inhibitörü. Deneyden önce 1x Proteaz inhibitörünü tampona taze olarak takviye edin.
    2. Hücre peletlerine 1 mL tampon LB1 ekleyin, iyice pipetleyin, 4 °C'de 10 dakika döndürün ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 2.000 x g'da döndürün. Süpernatanı dökün, 1 mL LB2 tamponu ekleyin, 4 ° C'de 10 dakika döndürün ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 2.000 x g'da döndürün. Süpernatanı dökün ve LB2 tamponunun fazlalığını çıkarın. 300 μL LB3 tamponu ekleyin.
    3. Uygun bir sonikatör sistemi kullanarak kromatin DNA'yı ortalama ~ 200-400 bp boyutuna sonikat ve parçalayın. Sonikasyondan sonra, 30 μL% 10 Triton-X 100 ekleyin ve iyice karıştırın. Yeni bir hücre hattı kullanılıyorsa uygun sonikasyon süresini test edin.
    4. Peleti çıkarmak için 14.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı yeni tüpe aktarın ve toplam 1 mL hacme 630 μL LB3 ve 70 μL% 10 Triton X-100 ekleyin. Süpernatanıma 2 μg Cas9 antikoru ekleyin ve gece boyunca 4 ° C'de döndürün.
  3. İmmüno-kompleks yakalama ve ters çapraz bağlama
    1. RIPA tamponu (50 mM HEPES pH 7.6, 1 mM EDTA, %0.7 Na-deoksikolat, %1 NP-40, 0.5 M LiCl) ve elüsyon tamponu (%1 SDS ve 0.1 M NaHCO3) hazırlayın.
    2. Protein G dynabeads'i PBS'de %1 BSA ile 3 kez ve LB3 tamponunda bir kez yıkayın.
    3. Numuneye 30 μL Protein G dynabeads ekleyin ve 4 °C'de 4 saat inkübe edin.
    4. Boncuk immüno-kompleksini 500 μL RIPA tamponu 6x içinde yıkayın. Boncukların kurumasına izin vermeyin.
    5. Boncuk-immüno-kompleksi bir kez TE tamponu ile yıkayın; Arabelleği çıkarın.
    6. Boncuk immüno-kompleksine ve girdaba 200 μL elüsyon tamponu ekleyin; daha sonra, çapraz bağlantıyı tersine çevirmek için 6-16 saat çalkalayarak 600 rpm ile 65 °C'ye ayarlanmış, sıcaklığı ayarlanabilir ısıtmalı bir çalkalayıcıya koyun.
  4. DNA ekstraksiyonu
    1. Tüpleri çalkalayıcıdan çıkarın, boncukları kısa bir süre aşağı döndürün ve manyetik bir standa koyun. 200 μL süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve 200 μL TE tamponu ekleyin.
    2. Tüpe 1 μL RNase A (1 mg / mL) ekleyin ve 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
    3. 1 saatlik inkübasyondan sonra, numuneye 2 μL Proteinaz K (20 mg / mL) ekleyin ve 65 ° C'de 2 saat inkübe edin.
    4. Kısa bir süre santrifüjleyin ve 400 μL fenol-kloroform-izoamil alkol karışımı ekleyin. İyice karıştırın, ardından 10.000 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
    5. Üst tabakanın 400 μL'sini 16 μL 5 M NaCl ve 1 μL glikojen (20 μg/μL) içeren 1.7 mL'lik bir tüpe taşıyın ve iyice karıştırın.
    6. 800 μL %100 etanol ekleyin ve gece boyunca -20 °C'de bırakın.
    7. Ertesi sabah, tüpleri 4 °C'de 14.000 x g'da 15 dakika santrifüjleyin.
    8. Süpernatanı çıkarın ve peleti 1 mL %70 etanol ile yıkayın. 10 dakika boyunca 14.000 x g'da döndürün.
    9. Etanolü çıkarın, havayla kuruyan peleti çıkarın ve 50 μL TE'de (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA) yeniden süspanse edin.
  5. SAM kompleksinin bir çift geliştirici çekirdek hedefleme astarı ile hedefleme bölgesine alınmasını incelemek için ChIP-qPCR gerçekleştirin. Negatif kontrol olarak alakasız bir bölgeyi hedefleyen bir primer çifti kullanın.

10. Hücre büyüme deneyi ve eRNA aşırı aktivasyonunun diğer fonksiyonel testleri

  1. Hedeflemeyen gRNA'yı veya eRNA hedefli gRNA'ları eksprese eden SAM hücre hatlarını tripsinize edin ve 96 oyuklu bir plakada oyuk başına ~ 3.000 hücre plakalayın.
  2. Canlı hücre görüntüleyici veya diğer yöntemler (örneğin, hücre sayımı veya suda çözünür tetrazolyum tuzu-1 testi) kullanarak hücre büyümesini ölçün.
  3. SAM 15 ile NET1e aşırı ekspresyonu olan veya olmayan hücrelerde spesifik kanser ilaçlarına hücresel yanıtları test etmek için yarı maksimal inhibitör konsantrasyonu (IC50) kullanın.
    NOT: Meme kanseri hücrelerinin hücre büyüme deneylerinin ve ilaç duyarlılık testlerinin sonuçları, NET1e15 olarak adlandırılan NET1 genine bitişik olarak kopyalanan bir eRNA'nın aşırı ekspresyonundan sonra sunulur. Diğer tahliller, her bir spesifik projenin ihtiyacına bağlı olarak hücresel veya organizma seviyelerinde gerçekleştirilebilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Şekil 1, bu protokolün genel iş akışını göstermektedir. Odak noktamız, meme kanserinde aşırı eksprese edilen temsili bir eRNA olan NET1e15 idi ve bunun için SAM sistemi, gen ekspresyonu, hücre proliferasyonu ve kanser ilaç yanıtını düzenlemedeki biyolojik rolünü aktive etmek ve incelemek için kullanıldı. Bu NET1 arttırıcı için, kopyalanmış eRNA transkriptleri (Şekil...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Verilerimize dayanarak, SAM sisteminin, eRNA'ların hücre büyümesi veya ilaç direnci gibi hücresel fenotiplerin düzenlenmesindeki rolünü incelemek için uygun olduğu sonucuna varıyoruz. Bununla birlikte, aşağıdaki nedenlerden dolayı sağlam eRNA aktivasyonu için dikkatli bir gRNA tasarımı gereklidir. Her şeyden önce, her bir spesifik hücre hattındaki/tipindeki eRNA'nın transkripsiyon başlangıç bölgesi (TSS) daha az net bir şekilde açıklanır. Bu nedenle, epig...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Teksas Kanser Önleme ve Araştırma Enstitüsü'nün resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

Teşekkürler

Bu çalışma, WL (Teksas Kanser Önleme ve Araştırma Enstitüsü, CPRIT RR160083 ve RP180734; NCI K22CA204468; NIGMS R21GM132778; Texas Üniversitesi UT Yıldız Ödülü; ve Welch vakfı AU-2000-20190330) ve JL'ye doktora sonrası burs (UTHealth Innovation for Cancer Prevention Research Training Program Post-PhD Fellowship, CPRIT RP160015). Creative Commons lisansını (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) takip eden, mevcut figürlerimizden bazılarının (değişikliklerle) uyarlandığı orijinal tanıtım15'i kabul ediyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
BlasticidinGoldbioB-800-100
BsmBI restriction enzymeNew England BioLabs Inc.R0580S
Cas9 mAbActive Motif61757Lot: 10216001
Deoxynucleotide (dNTP) Solution MixNew England BioLabs Inc.N0447S
Dulbecco’s Modified Eagle MediumCorning10-013-CM
Dynabeads Protein GThermo Fisher Scientific65002
EDTAThermo Fisher ScientificBP118-500
EGTASigmaE3889
Fetal Bovine SerumGenDEPOTF0900-050
GlycogenThermo Fisher Scientific10814010
Hepes-KOHThermo Fisher ScientificBP310-100
Hexadimethrine BromideSigmaH9268
Hygromycin BGoldbioH-270-25
IGEPAL CA630SigmaD6750
IncuCyte live-cell imagerEssen BioScienceIncuCyte S3 Live-Cell Analysis System
lenti_dCAS-VP64_BlastAddgene61425
lenti_gRNA(MS2)_zeo backboneAddgene61427
lenti_MS2-p65-HSF1_HygroAddgene61426
LiCLSigmaL9650
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668-500
NaClSigmaS3014
Na-DeoxycholateSigmaD6750
NaHCO3Thermo Fisher ScientificBP328-500
N-lauroylsarcosineSigma97-78-9
Opti-MEM Reduced Serum MediumThermo Fisher Scientific31985070
PES syringe filterBASIX13-1001-07
Protease Inhibitor Cocktail TabletRoche Diagnostic11836145001
pSpCas9(BB)-2A-PuroAddgene62988
Q5 High-Fidelity DNA PolymeraseNew England BioLabs Inc.M0491S
Q5 Reaction BufferNew England BioLabs Inc.B9027S
Quick-DNA MiniprepZYMO ResearchD3025
Quick-RNA MiniprepZYMO ResearchR1054
Restriction enzyme bufferNew England BioLabs Inc.B7203S
RT-qPCR Detection SystemThermo Fisher ScientificQuant Studio3
SDSThermo Fisher ScientificBP359-500
SonicatorQsonicaQ800R2
Sso Advanced Universal SYBR Green SupermixBio-Rad Laboratories1725274
Stbl3 competent cellThermo Fisher ScientificC7373-03
Superscript IV reverse transcriptThermo Fisher Scientific719000
Surveyor Mutation Detection KitsIntegrated DNA Technologies706020
T4 DNA LigaseNew England BioLabs Inc.M0202S
T4 DNA Ligase Reaction BufferNew England BioLabs Inc.B0202S
TE bufferThermo Fisher Scientific46009CM
Thermal cyclerBio-Rad LaboratoriesT100
ThermomixerSigma5384000020
ZeocinThermo Fisher Scientificant-zn-1p

Referanslar

  1. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  2. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
  3. Kundaje, A., et al. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  4. Andersson, R., et al. An atlas of active enhancers across human cell types and tissues. Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).
  5. Heinz, S., Romanoski, C. E., Benner, C., Glass, C. K. The selection and function of cell type-specific enhancers. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (3), 144-154 (2015).
  6. Ong, C. T., Corces, V. G. Enhancer function: new insights into the regulation of tissue-specific gene expression. Nature Reviews Genetics. 12 (4), 283-293 (2011).
  7. Hnisz, D., et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell. 155 (4), 934-947 (2013).
  8. Grossman, S. R., et al. Systematic dissection of genomic features determining transcription factor binding and enhancer function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1291-1300 (2017).
  9. Kim, T. K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465 (7295), 182-187 (2010).
  10. Li, W., Notani, D., Rosenfeld, M. G. Enhancers as non-coding RNA transcription units: recent insights and future perspectives. Nature Reviews Genetics. 17 (4), 207-223 (2016).
  11. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  12. Li, W., et al. Functional roles of enhancer RNAs for oestrogen-dependent transcriptional activation. Nature. 498 (7455), 516-520 (2013).
  13. Lee, J. H., Xiong, F., Li, W. Enhancer RNAs in cancer: regulation, mechanisms and therapeutic potential. RNA Biology. , 1-10 (2020).
  14. Sur, I., Taipale, J. The role of enhancers in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (8), 483-493 (2016).
  15. Zhang, Z., et al. Transcriptional landscape and clinical utility of enhancer RNAs for eRNA-targeted therapy in cancer. Nature Communications. 10 (1), 4562(2019).
  16. Chen, H., et al. A Pan-Cancer Analysis of Enhancer Expression in Nearly 9000 Patient Samples. Cell. 173 (2), 386-399 (2018).
  17. Kopp, F., Mendell, J. T. Functional Classification and Experimental Dissection of Long Noncoding RNAs. Cell. 172 (3), 393-407 (2018).
  18. Lubelsky, Y., Ulitsky, I. Sequences enriched in Alu repeats drive nuclear localization of long RNAs in human cells. Nature. 555 (7694), 107-111 (2018).
  19. Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
  20. Beerli, R. R., Segal, D. J., Dreier, B., Barbas, C. R. Toward controlling gene expression at will: specific regulation of the erbB-2/HER-2 promoter by using polydactyl zinc finger proteins constructed from modular building blocks. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (25), 14628-14633 (1995).
  21. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  22. Hirai, H., Tani, T., Kikyo, N. Structure and functions of powerful transactivators: VP16, MyoD and FoxA. International Journal of Developmental Biology. 54 (11-12), 1589-1596 (2010).
  23. Lim, F., Spingola, M., Peabody, D. S. Altering the RNA binding specificity of a translational repressor. Journal of Biological Chemistry. 269 (12), 9006-9010 (1994).
  24. Schmitz, M. L., Baeuerle, P. A. The p65 subunit is responsible for the strong transcription activating potential of NF-kappa B. EMBO Journal. 10 (12), 3805-3817 (1991).
  25. Vihervaara, A., Sistonen, L. HSF1 at a glance. Journal of Cell Science. 127, Pt 2 261-266 (2014).
  26. Core, L. J., et al. Analysis of nascent RNA identifies a unified architecture of initiation regions at mammalian promoters and enhancers. Nature Genetics. 46 (12), 1311-1320 (2014).
  27. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148(2016).
  28. Benchling [Biology Software]. , Available from: https://benchling.com (2020).
  29. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
  30. Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nature Biotechnology. , (2020).
  31. Nageshwaran, S., et al. CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems. Journal of Visualized Experiments. (140), e57998(2018).
  32. Al-Allaf, F. A., Tolmachov, O. E., Zambetti, L. P., Tchetchelnitski, V., Mehmet, H. Remarkable stability of an instability-prone lentiviral vector plasmid in Escherichia coli Stbl3. 3 Biotech. 3 (1), 61-70 (2013).
  33. Qiu, P., et al. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
  34. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  35. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168(2014).
  36. Quick-DNA Miniprep Kit. ZYMO. , Available from: https://files.zymoresearch.com/protocols/_d3024_d3025_quick-dna_miniprep_kit.pdf (2020).
  37. SURVEYOR Mutation Detection Kit. IDT. , Available from: https://sfvideo.blob.core.windows.net/sitefinity/docs/default-source/user-guide-manual/surveyor-kit-for-gel-electrophoresis-user-guide.pdf?sfvrsn=a9123407_6 (2020).
  38. Quick-RNA Miniprep Kit. ZYMO. , Available from: https://files.zymoresearch.com/protocols/_r1054_r1055_quick_rna_miniprep_kit.pdf (2020).
  39. SuperScript IV Reverse Transcriptase Product Manual. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/SSIV_Reverse_Transcriptase_UG.pdf (2020).
  40. Ounzain, S., et al. Functional importance of cardiac enhancer associated noncoding RNAs in heart development and disease. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 76, 55-70 (2014).
  41. McCleland, M. L., et al. CCAT1 is an enhancer-templated RNA that predicts BET sensitivity in colorectal cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 639-652 (2016).
  42. Miao, Y., et al. Enhancer-associated long non-coding RNA LEENE regulates endothelial nitric oxide synthase and endothelial function. Nature Communications. 9 (1), 292(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Artt r c RNA larERNA larDCas9Sinerjistik Aktivasyon Arac SistemiGen Reg lasyonuDokuya zg EkspresyonFonksiyon Kazan m al malarCRISPR TaramasGen Ekspresyon ProgramlarRT qPCRFenotip Y nlendiren HedeflerFonksiyonel SorgulamaHastal k Geli imiTranskripsiyon Fakt rleri

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır