دينامية القياس والتصوير من الشعيرات الدموية، والشريين، و Pericytes في قلب الماوس

Summary

هنا هو بروتوكول لدراسة الأوعية الدقيقة التاجية في أنسجة القلب المورين الحية عن طريق مراقبة الجسم الحي السابق لضغط الأوعية الدموية وتدفق الشرايين التي تحافظ على الضغط ، وكذلك مكونات شجرة الأوعية الدموية بما في ذلك أسرة الشعيرات الدموية و pericytes ، كما يتم رص الشريان الحاجز وضغط.

Abstract

نبرة الشريان التاجي جنبا إلى جنب مع فتح أو إغلاق الشعيرات الدموية إلى حد كبير تحديد تدفق الدم إلى عضلة القلب في ضغط ضخ مستمر. ومع ذلك ، من الصعب مراقبة التغيرات الديناميكية في الشرايين التاجية والشعيرات الدموية في القلب كله ، ويرجع ذلك في المقام الأول إلى حركته وضربه دون توقف. هنا وصفنا طريقة تمكن من رصد معدل الضخ الشرياني والضغط والتغيرات في قطر الشرايين والشعيرات الدموية في عضلات البطين الأيمن الماوس. يتم قذف الشريان الحاجز الماوس و pered في تدفق مستمر أو الضغط مع غيرها يقاس بشكل حيوي. بعد التسريب مع الليكتين المسمى الفلورسنت (على سبيل المثال، اليكسا فلور-488 أو -633 المسمى القمح الجرثوم Agglutinin، WGA)، والشريول والشعيرات الدموية (وغيرها من السفن) في عضلة البطين الحق وصفح يمكن بسهولة صورة. ويمكن بعد ذلك قياس التغيرات في قطر السفينة في وجود أو عدم وجود تقلصات القلب. وعندما يتم التعبير عن البروتينات الفلورية المشفرة وراثياً، يمكن رصد سمات محددة. على سبيل المثال، تم تصور pericytes في قلوب الماوس التي أعرب عن NG2-DsRed. وقد وفرت هذه الطريقة منصة مفيدة لدراسة الوظائف الفسيولوجية من بيريايري بيريكيت في القلب. كما أنها مناسبة لدراسة تأثير الكواشف على تدفق الدم في القلب عن طريق قياس قطر الأوعية الدموية / الشعيرات الدموية وضغط الشريان اللمعان في وقت واحد. هذا الإعداد، جنبا إلى جنب مع أحدث نظام التصوير البصري، يسمح للمرء أن دراسة تدفق الدم ورقابة على المستوى الخلوي والجزيئي في القلب في ظل ظروف شبه فسيولوجية.

Introduction

المناسبة تنظيم ضغط الشريان التاجي تدفق يضمن إمدادات كافية من الدم إلى القلب لتلبية مطالبها الأيضية¹. ومع ذلك، إلا أنه أصبح من الواضح كيف يتم تنظيم تدفق الضغط التاجي بشكل حيوي في القلب، على الرغم من الدراسات المستفيضة التي أجريت في الجسم الحي وفي المختبر على مدى العقود الماضية. أحد الأسباب هو صعوبة في إنشاء نموذج عمل الفسيولوجية لمثل هذه الدراسات بسبب النبض المستمر للقلب. بغض النظر عن ذلك، تم وضع مجموعة متنوعة من الطرق لمراقبة الأوعية الدقيقة التاجية في الأنسجة الحية أو الحيوانات، ولكن أيا من هذه الأساليب كانت قادرة على تحقيق التركيز ثابت / مستقر وقياسات الضغط والتدفق وقطر الأوعية الدموية الدقيقة في نفس الوقت^2،3. تم تقديم التصور المباشر لأوعية الشرايين التاجية الدقيقة في القلب النابض منذ عقود^4،3، ولكن قياسات القطر في الأوعية الصغيرة كانت صعبة وكانت الوظائف المحددة للعديد من أنواع الخلايا المتخصصة المرتبطة بالدوران المجهري أمرًا صعبًا بنفس القدر. حتى طريقة stroboscopic ونظام الهدف العائمة لا يمكن أن توفر المعلومات المذكورة أعلاه في وقت واحد^5. ومع ذلك، تم الحصول على كمية كبيرة من المعلومات القيمة باستخدام التكنولوجيات المذكورة أعلاه، والتي ساعدتنا على فهم المزيد حول تنظيم تدفق الدم التاجي⁶. الطريقة التي نقدمها في هذه الورقة سوف تساعد على التحقيق في المرء وفهم بالتفصيل كيف مكونات الشرايين التاجية, الشرايين وvavasculature تستجيب بشكل مختلف للتحفيز والمطالب الأيضية.

وقد بني نموذج العمل الذي أنشأناه لمتابعة هذه الدراسات على العمل السابق لWesterhof وآخرون^2. بعد تحبيب الشريان الحاجز لقلب الماوس ، تم استخدام محلول ملحي فسيولوجي لضخ هذا الشريان للحفاظ على myocytes ومكونات أخرى من أنسجة القلب مغذية. تم رصد ضغط الانسياب الشرياني والتدفق وقطر الأوعية الدموية من بين الوظائف الفسيولوجية الأخرى باستخدام مؤشرات الفلورسنت المناسبة. هذه الطريقة تمكننا من تصور سريري الأوعية الدموية التاجية تحت الضغط الفسيولوجي في الأنسجة الحية ودراسة الآليات الخلوية الكامنة تحت تنظيم دوران الأوعية الدقيقة للمرة الأولى.

Protocol

وكانت جميع أعمال العناية بالحيوان متفقة مع المبادئ التوجيهية لجامعة ماريلاند بالتيمور والبروتوكولات التي وافقت عليها اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها.

1- إعداد الحلول

ملاحظة: إعداد الحلول مقدماً. يتم استخدام نوعين من الحلول الأساسية في التجارب: (1) حلول ملحية فسيولوجية (PSS) للحمام فائقة و (2) حلول التيرود للتجويف. هناك حاجة إلى محتدماً مستمراً مع CO₂ للحفاظ على pH من PSS. يتم استخدام حل التيرود HEPES المخزن في التجويف بدلا من PSS لتجنب فقاعات الخوض في الأوعية، لأن فقاعات من شأنه أن يضر الخلايا البطانية⁷ وانسداد تدفق.

1. PSS الحل: انظر صيغة وتركيبة حل PSS في الجدول 1. جعل 10 لتر من كاليفورنيا^{2 +}خالية من الجلوكوز خالية من محلول الأسهم PSS وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. 1 ساعة قبل أي إجراء، تأخذ بها 1 L من حل الأسهم وفقاعات مع 5٪ CO₂ (74٪ N₂ و 21٪ O₂) للحفاظ على ح H من الحل في ~ 7.4. إضافة 1.8 غرام من الجلوكوز و 1.8 مل CaCl₂ (1 M)⁸.
   ملاحظة: أضف Ca²⁺ فقط بعد فقاعات عندما يكون الرقم الـ 7.4 ~ ، وإلا ، سيتم تعجيل Ca^2+.
2. حل التيرود: انظر صيغة وتكوين حل التيرود في الجدول 1. تصفية الحل (0.22 ميكرومتر) وتخزينها في 4 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل⁹.
3. حل التيرود مع BDM (2،3-Butanedione monoxime): إضافة BDM كمثبط myofilament عكسها لمنع تقلص myocytes¹⁰. تزن 600 ملغ BDM وإضافة إلى 200 مل من حل التيرود. اثارة الحل مع BDM حتى يتم حلها تماما. لا يلزم المزيد من الترشيح.
4. قم بتخزين حل التيرود الذي يحتوي على BDM عند 4 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.

2- إعداد الغرفة

1. معطف كل من غرفة تشريح وغرفة تجريبية في وقت مبكر مع polydimethylsiloxane (PDMS) اتباع التعليمات المقدمة من قبل الشركة المصنعة.
2. ملء غرفة تشريح مع حل التيرود التي تحتوي على BDM.
3. بدوره على المبرد 1 ساعة قبل الإجراء. تعيين درجة الحرارة عند 4 درجة مئوية.

3- تحضير كانولا

1. بدوره على سحب micropipette. حدد الإعدادات حسب إرشادات الشركة المصنعة.
2. اتخاذ أنبوب زجاجي بوروسيليكات نظيفة (القطر الخارجي والداخلي من الأنابيب الزجاجية المستخدمة كان 1.2 مم و 0.69 ملم على التوالي).
3. إدراج أنبوب زجاجي في المشابك مخدد من سحب ماصة سوتر مع خيوط التدفئة البلاتين على شكل حرف U.
4. قم بتنشيط الـ puller لإنتاج اثنين من الـ cannulae، كل منهما مع طرف رفيع طويل.
5. قطع غيض من كل كانولا باستخدام زوج غرامة من مقص تحت مجهر تشريح لجعل القطر النهائي للتلميح حول 100 إلى 150 ميكرومتر.
6. تلميع النار غيض من cannula قطع لجولة طفيفة حواف حادة.
7. ثني كانولا على طول رمح باستخدام سلك البلاتين (ساخنة مع التحكم الدقيق) المتمركزة على جانب رمح ما يقرب من 2 ملم من طرف. زاوية الانحناء في القنية يجب أن تكون حوالي 45 درجة.
8. إدراج الطرف المفتوح من القنية في حامل غرفة الضغط myograph وتشديد المناسب. قم بتوصيل حقنة 5 مل مملوءة بحل تيرود إلى الجانب الآخر من التركيب. ربط القنيولا إلى micromanipulator التي شنت على الغرفة (انظر الشكل 1 والشكل 2).
9. ملء كانولا مع حل تيرود باستخدام حقنة (5 مل), شطف عليه, أنابيب وموصل من فقاعات الهواء.
10. قبل إجراء الزبيب، وقياس ضغط القذف داخل القنية على مدى معين من تدفق (50 إلى 300 ميكرولتر / دقيقة، الشكل 3). القيام بذلك فقط عندما يتم استخدام cannula جديدة.
    ملاحظة: ضغط التسريب داخل القنية يتناسب مع التدفق وهو خطي مجهز(الشكل 3).

4. استخراج قلب الماوس

1. وضع الماوس C57BL/6 (أي الجنس، 8-16 أسابيع) في مربع التخدير الذي هو متصل إلى خزانات من الأيزوفلوران والأكسجين.
2. بدوره على خزان الأكسجين وبدء تدفق ايزوفلوران. انتظر ~5 دقيقة حتى يتم تخدير الماوس بالكامل.
3. بعد التخدير، واتخاذ الماوس من مربع التخدير وحقن الهيبارين IP (في تجويف البريتوني، 360 وحدة، 0.5 مل/ فأر) لتجنب تشكيل تجلط الدم في الأوعية الدموية. ثم وضع الماوس مرة أخرى في مربع التخدير.
4. 10 دقيقة بعد حقن الهيبارين، حرك الماوس إلى السرير الساخن في وضعية supine وتثبيت الكفوف باستخدام شريط الملصقات. إبقاء الماوس تحت التخدير الكامل مع ايزوفلوران باستخدام مخروط الأنف.
5. رفع جلد البطن من الماوس فوق الحجاب الحاجز مع ملقط واستخدام مقص الجراحية لقطع وفضح الحجاب الحاجز.
6. قطع الحجاب الحاجز والعظم. افتحي الصدر
7. تشريح القلب من تجويف الصدر، وقطع أقرب ما يمكن إلى جدار الصدر الظهري.
8. ضع القلب في محلول تيرود البارد الذي يحتوي على 30 mM BDM.
9. تنظيف القلب لإزالة الأنسجة الضامة مثل الرئة.
10. نقل القلب إلى غرفة تشريح ما قبل المبردة مليئة حل تيرود يحتوي على 30 M BDM.

5. إعداد وتكبيب الشريان الحاجز

1. تشغيل مضخة سيرفو. تعيين مضخة سيرفو إلى وضع "تدفق". السماح لها تشغيل بسرعة عالية حتى يتم تعبئة الأنابيب مع حل التيرود التي سيتم استخدامها لتجويف تجويف الأوعية الدموية. تأكد من عدم وجود فقاعات في الأنابيب. ثم خفض السرعة.
2. اُلصق القلب على نظام الـ PDMS، متجنبًا أي ضرر في المنطقة الوسطى من القلب.
3. إزالة كل من الأذين الأيمن والأيسر. قطع فتح البطين الأيمن وإزالة الجدار الأيمن خالية البطين باستخدام مجهر تشريح.
4. كشف وتحديد الشريان الحاجز. ضع خيط النايلون (قطرها 30 ميكرومتر) تحت الشريان الحاجز وربط عقدة فضفاضة للاستخدام في المستقبل.
   ملاحظة: يمكن التعرف على الشريان الحاجز بسهولة باستخدام مجهر تشريح. الشريان الحاجز هو شريان رئيسي على الحاجز الذي ينشأ من الشريان التاجي الأيمن في معظم الحالات.
5. إزالة الجدار الحر البطين الأيسر باستخدام مقص غرامة.
6. نقل إعداد العضلات الحليمية إلى غرفة تجريبية التي تم وضعها في القنية. تمتلئ الغرفة مع حل التيرود يحتوي على BDM. يتم طلاء الجزء السفلي من هذه الغرفة بطبقة رقيقة (~2 مم) من PDMS.
7. ضبط موقف القنية (باستخدام micromanipulator) لتمكين تحليب الشريان الحاجز. تشديد العقدة.
8. تأمين العضلات الحليمة باستخدام دبابيس صغيرة إلى أرضية الغرفة بحيث يكون الهدف المجهر لديه رؤية واضحة للأوعية الدموية. انتبه إلى زاوية وموضع القنية وتأكد من أن طرف القنيولا موازٍ للجدار الشرياني.
9. اختبار التكليج عن طريق طرد المحلول تدريجيا من الحقنة من خلال القنية. إذا كانت جميع العناصر تعمل بشكل صحيح، فإن الدم المتبقي في عضلة الحليمة يخرج من الأنسجة في بداية هذه العملية وسيتم رؤية محلول تيرود فقط في وقت لاحق.

6- استقرار الإعداد

1. بدوره على مضخة ال peristaltic التي من شأنها أن توفر حل الضخ الفائق. ثم تضخيم باستمرار إعداد في الحمام مع ما قبل الغاز PSS بمعدل 3-4 مل / دقيقة.
2. قم بتشغيل وحدة تحكم درجة الحرارة لمحلول الضخ الفائق. ضبط درجة حرارة الغمرة الحمام إلى ~ 35-37 درجة مئوية.
3. ربط القنية إلى مضخة سيرفو. قراءة الضغط المعروض على جهاز التحكم في الضغط.
4. مراقبة تدفق والضغط. يتم رقمنة التدفق (μL/min) وضغط الضخ الشرياني (مم زئبق) باستخدام جهاز الالتقاط الرقمي وتسجيله باستخدام برنامج مرتبط(الشكل 2).
5. ضبط تدفق لضبط الضغط ~ 10 مم زئبق والسماح لها تشغيل ل ~ 10 دقيقة.
6. زيادة تدفق حل الإنارة لجعل ضغط الشريان ~ 60 مم زئبق. الحصول على ضغط الضخ النهائي للشريان نفسه عن طريق طرح انخفاض ضغط القنية (الشكل 3).
   ملاحظة: إذا تم تحديد وضع "الضغط" على جهاز التحكم في الضغط، يتم تعيين الضغط المُلَيّ ~ 60 مم زئبق لهذه التجارب. ثم مراقبة تغيير تدفق.
7. السماح للنموذج الاستقرار ل~ 30-60 دقيقة من خلال مراقبة تدفق و / أو مستويات الضغط. عادة ما يتم ملاحظة زيادة تدريجية في ضغط الشرايين في بداية القذف بعد التابيب. وهناك حالة جديدة ثابتة الحصول على تأسيسها في حد ذاته في حوالي 30 دقيقة(الشكل 4).
8. بدء تجربة بعد استقرار ضغط الضخ (عند التدفق المستمر).

7. تحميل إعداد مع الفلورسنت الموسومة القمح الجرثومة agglutinin (WGA)

1. إعداد حل Tyrode يحتوي على اليكسا فلور-488 مترافق WGA بإضافة 100 ميكروغرام من WGA مترافق في 5 مل من حل تيرود.
2. بعناية تبديل perfusate من حل تيرود العادي إلى واحد يحتوي على الفلورسنت الموسومة WGA. من المهم أن التبديل بعناية perfusate بحيث لا يتم إدخال فقاعات.
3. بعد ~ 30 دقيقة من اغاء WGA أو عندما حل WGA على وشك أن ينفد ، وتغيير perfusate العودة إلى الحل تيرود العادي.

8. تصوير كونفوكال من الشرايين والشعيرات الدموية

1. بدوره على القرص Nipkow المجهر confocal النظام.
2. استخدم المجهر لتحديد موقع الشريان الحاجز باستخدام هدف منخفض الطاقة (4x) في وضع الضوء المنقول.
   ملاحظة: يمكن أن يكون موجودا الشريان الحاجز باتباع موقف من القنية.
3. بدء التصوير confocal مع غزل القرص confocal واختيار 488 نانومتر ليزر الإثارة، 40x التكبير الهدف وضبط كثافة الليزر ومعدل أخذ العينات (10 - 500 مللي ثانية لكل صورة).
4. قم بإعداد مواضع التصوير العلوية والسفلية للمجهر confocal لتحديد نطاق التصوير وإدخال المعلمات للتصوير المكدس z.
5. تعيين حجم الخطوة كما هو مستحسن للنظام الذي يتم استخدامه أو تعيين حجم الخطوة كما هو مطلوب.
6. اختر إعداد z-stack و/أو إعدادات السلسلة الزمنية.
7. حدد مجلداً جديداً أو قم بتعيينه لتخزين الصورة الجديدة.
8. انقر فوق "تشغيل" لبدء تسجيل التصوير للتحليل في المستقبل (الشكل 5).

9 - مثال تجربة توسع الأوعية: توسع الأوعية الناجم عن البينازيل (فيديو 1).

1. إعداد pinacidil حل الأسهم (100 mM في DMSO) وتخزينها في 4 درجة مئوية.
2. إعداد 10 مل من حل التيرود. إضافة 10 ميكرولتر من pinacidil حل الأسهم لجعل التركيز النهائي من pinacidil 100 μM.
3. صورة العضلات الحليمية في التكبير منخفضة (4x الهدف) لتشمل الشريان الحاجز والشريول فرع.
4. قم بتبديل الحل المُلّق إلى الحل الذي يحتوي على pinacidil.

10. مثال على تجارب السيطرة على تدفق الدم: vasoconstrictor الناجم عن زيادة ضغط الضخ الشرياني في تدفق مستمر (الشكل 6)

1. تحضير محلول الأسهم endothelin-1 (ET-1) (10 ميكرومتر) وتخزينه عند -20 درجة مئوية.
2. إعداد 10 مل من حل التيرود. أضف 10 ميكرولتر من محلول ET-1 (10 ميكرومتر) لجعل التركيز النهائي لـ ET-1 10 nM.
3. سجل الضغط اللممَر مع تدفق مستمر وصورة العضلات الحليمية.
4. قم بتبديل الحل المُلّق إلى حل إي تي-1 الذي يحتوي على.

11. مثال على صور شعرية مع بيريكيتس (الشكل 7)

1. التضحية بماوس NG2DsRedBAC المعدلة وراثيا كما هو موضح في القسم 4 من هذا البروتوكول.
2. استخراج القلب، cannulate الشريان الحاجز وتحميل العينة مع اليكسا فلور-488 مترافق WGA التالية البروتوكولات 5-7.
3. صورة العضلات الحليمية في 488 نانومتر و 560 نانومتر الإثارة، و510-525 نانومتر، 575-625 نانومتر الانبعاثات باستخدام confocal. ضغط الشريان سيكون حوالي 40 مم زئبق.

النتائج

عندما يتم غرس علامة الأوعية الدموية الفلورية في تجويف الأوعية الدموية (هنا WGA متقارنة مع اليكسا فلور-488)، فمن الممكن لتصور أشجار الأوعية الدموية بأكملها كما هو مبين في الشكل 5 (لوحة اليسار) باستخدام المجهر confocal عالية السرعة. مزيد من التكبير تمكن من تصوير الشعيرات الدموية بال...

Discussion

في العمل الحالي، قدمنا طريقة بسيطة بشكل ملحوظ ولكن عملية للغاية السابقين فيفو لدراسة دوران الأوعية الدقيقة التاجية في القلب في ظل ظروف فسيولوجية. تم تعديل هذه الطريقة من التحقيقات الميكانيكية باستخدام^{الفئران 2.} وكانت إضافة تحديا تكنولوجيا التصوير مع سرعة عالية ودقة بصرية عا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M CaCl2 solution	MilliporeSigma, USA	21115
1 M MgCl2 solution	MilliporeSigma, USA	M1028
AxoScope software	Molecular Devices, San Jose, CA, USA
Chiller/water incubator	FisherScientific, USA	Isotemp 3016S
Confocal	Nikon Instruments, USA	A1R
Custom glass tubing	Drummond Scientific Company	9-000-3301
Digidata 1322A	Molecular Devices, San Jose, CA, USA
Dissecting microscope	Olympus, Japan	SZX12
Endothelin-1	MilliporeSigma, USA	E7764
Forceps	Fine Scientific Tools	11295-51
Heparin Sodium Salt	Sigma-Aldrich, USA	H3393
Inline solution Heater	Warner Istruments, Hamden, CT, USA	SH-27B
Isoflurane	VETone, Idaho, USA	502017
Micropipette puller	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97
Micropipette/cannula holder	Warner Istruments, Hamden, CT, USA	64-0981
NG2DsRedBAC transgenic mouse	The Jackson Laboratory	#008241
Nylon thread for tying blood vessels	Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA	THR-G
PDMS (polydimethylsiloxane)	SYLGARD, Germantown, WI, USA	184 SIL ELAST KIT
Peristaltic pump	Gilson, Middleton, WI, USA	minipuls 3
Pressure Servo Controller	Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA	PS-200-S
Scissors	Fine Scientific Tools, Foster City, CA, USA	15000-10
Servo Pump	Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA	PS-200-P
Temperature controller	Warner Instruments, Hamden, CT, USA	TC-324B
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA USA	W11261