Динамическое измерение и визуализация капилляров, артериол и перицитов в сердце мыши

Резюме

Здесь представлен протокол для изучения коронарной микроциркуляции в живой ткани сердца мурина путем ex vivo мониторинга артериального давления перфузии и потока, который поддерживает давление, а также сосудистых компонентов дерева, включая капиллярные кровати и перициты, как перегородка артерии канюлизируется и под давлением.

Аннотация

Коронарный артериальный тон наряду с открытием или закрытием капилляров в значительной степени определяют приток крови к кардиомиоцитам при постоянном перфузионом давлении. Однако трудно контролировать динамические изменения коронарных артериол и капилляров во всем сердце, в первую очередь из-за его движения и нон-стоп избиения. Здесь мы описываем метод, который позволяет контролировать скорость артериальной перфузии, давление и диаметр изменений артериол и капилляров в мыши правой желудочковой папиллярных мышц. Мышь перегородки артерии cannulated и проникнуты при постоянном потоке или давления с другими динамически измеряется. После перфузии с флуоресцентно помечены лектин (например, Alexa Fluor-488 или -633 помечены Пшеница-Герм Агглютинин, WGA), артериолы и капилляры (и другие сосуды) в правом желудочка папиллярной мышцы и перегородки могут быть легко изображены. Изменения диаметра сосуда могут быть измерены при наличии или отсутствии сокращений сердца. Когда генетически закодированные флуоресцентные белки были выражены, конкретные особенности могут быть проверены. Для примеров перициты визуализировались в сердцах мышей, которые выражали NG2-DsRed. Этот метод предоставил полезную платформу для изучения физиологических функций капиллярных перицитов в сердце. Он также подходит для изучения влияния реагентов на кровоток в сердце путем измерения диаметра сосудов/капилляров и артериального светимого давления одновременно. Этот препарат, в сочетании с современной системой оптической визуализации, позволяет изучать кровоток и его контроль на клеточном и молекулярном уровне в сердце в почти физиологических условиях.

Введение

Соответствующая регулировка коронарного давления обеспечивает достаточное кровоснабжение сердца для удовлетворения его метаболических потребностей^1. Тем не менее, только недавно стало ясно, как коронарное давление регулируется в сердце, несмотря на обширные исследования, которые были проведены in vivo и in vitro в течение последних десятилетий. Одной из причин является трудность в создании физиологической рабочей модели для таких исследований из-за постоянного бия сердца. Несмотря на это, были созданы различные методы для наблюдения коронарных микросудов в живых тканях или животных, но ни один из этих методов не смогли достичь постоянного / стабильного фокуса и измерения давления, потока и микрососудистого диаметра в то же^{время 2,3}. Прямая визуализация коронарных артериальных микро-сосудов в бьющееся^{сердце была введена десятилетия назад 4},³, но диаметр измерений в малых сосудах была сложной и специфические функции многих специализированных типов клеток, связанных с микроциркуляции в равной степени досадно. Даже стробоскопический метод и плавающая объективная система не могли предоставить вышеупомяую информацию^{одновременно 5.} Тем не менее, значительный объем ценной информации был получен с использованием вышеупомянутых технологий, которые помогли нам понять больше о регулировании коронарного кровотока⁶. Метод, который мы описываем в этой статье, поможет исследовать и детально понять, как компоненты коронарных артерий, артериол и микроваскулярно по-разному реагируют на стимуляцию и метаболические потребности.

Рабочая модель, которую мы создали для проведения этих исследований, была построена на предыдущей работе Westerhof et al.². После канюляции перегородки сердца мыши, физиологический солевой раствор был использован для окутыния этой артерии, чтобы сохранить миоциты и другие компоненты сердечной ткани питается. Артериальное давление перфузии, течение и диаметр сосудов отслеживались среди других физиологических функций с использованием соответствующих флуоресцентных индикаторов. Этот метод позволяет нам впервые визуализировать коронарную микрососудикулярную кровать под физиологическим давлением в живой ткани и изучить клеточные механизмы, лежащие в основе регуляции микроциркуляции.

протокол

Все уход за животными был в соответствии с руководящими принципами Университета штата Мэриленд Балтимор и Институциональный комитет по уходу за животными и использованию утвержденных протоколов.

1. Подготовка решений

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте решения заранее. В экспериментах используются два типа основных растворов: (1) физиологические солевые растворы (PSS) для суперфузации ванн и (2) растворы Тирода для перфузации люмена. Непрерывное восходящее с CO₂ необходимо для поддержания рН PSS. Раствор HEPES-буферного тирода используется в люмене вместо PSS, чтобы избежать пузырьков, ичух, ичух, испакухт сосуды, так как пузырьки^{повесят эндотелиальные клетки 7} и затрудняя поток.

1. PsS решение: Смотрите формулу и состав решения PSS в таблице 1. Сделайте 10 Л Ca^{2 "бесплатно}и без глюкозы PSS фондовый раствор и хранить при комнатной температуре. 1 ч перед любой процедурой, вынюхив 1 л раствора акций и пузырь с 5% CO₂ (74% N₂ и 21% O₂), чтобы сохранить рН раствора на 7,4 евро. Добавьте 1,8 г глюкозы и 1,8 мл CaCl₂ (1 млн бульона)^8.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Добавить Ca^{2 "только} после восходящей, когда рН составляет 7,4, в противном случае, Ca^2" будет осаждаться.
2. Решение Tyrode: Смотрите формулу и состав раствора Tyrode в таблице 1. Фильтровать раствор (0,22 мкм) и хранить при 4 градусах цельсия для использования в будущем⁹.
3. Раствор Тирода с BDM (2,3-Butanedione моноксим): Добавить BDM как обратимый ингибитор миофилямента, чтобы предотвратить сокращение миоцитов¹⁰. Взвесить 600 мг БДМ и добавить в 200 мл раствора Тирода. Перемешать раствор с помощью BDM, пока он полностью не растворился. Дальнейшей фильтрации не требуется.
4. Храните раствор Tyrode, содержащий BDM, при 4 градусах Цельсия для использования в будущем.

2. Подготовка камеры

1. Пальто как вскрывая камеру и экспериментальную камеру заранее с polydimethylsiloxane (PDMS) следуя инструкциям, предоставленным производителем.
2. Заполните вскрытую камеру раствором Тирода, содержащим BDM.
3. Включите охладитель за 1 ч до процедуры. Установите температуру на уровне 4 градусов по Цельсию.

3. Каннула подготовки

1. Включите шкив микропайпта. Выберите настройки в соответствии с инструкциями производителя.
2. Возьмите чистую борозиликатную стеклянную трубку (внешний и внутренний диаметр используемых стеклянных трубок составил 1,2 мм и 0,69 мм соответственно).
3. Вставьте стеклянную трубку в рифленые зажимы шкив Саттер пипетки с U-образной платины нагрева нить.
4. Активируйте шкив, чтобы произвести два канюле, каждый с длинным тонким кончиком.
5. Вырезать кончик каждой канюли с помощью тонкой пары ножниц под рассечением микроскопа, чтобы сделать окончательный диаметр кончика около 100 до 150 мкм.
6. Огонь полировать кончик вырезать канюлю слегка вокруг острых краев.
7. Согните канюлю вдоль вала с помощью платиновой проволоки (нагретой с тонкой контролем), расположенной на стороне вала примерно в 2 мм от кончика. Угол изгиба в канюле должен быть около 45 градусов.
8. Вставьте открытый конец канюлы в держатель камеры миографа давления и затяните фитинг. Подключите шприц 5 мл, наполненный раствором Tyrode, к другой стороне фитинга. Подключите канюлю к микроманипулятору, установленному на камере (см. рисунок 1 и рисунок 2).
9. Заполните канюлю раствором Тирода с помощью шприца (5 мл), промывка его, трубки и разъем пузырьков воздуха.
10. Перед процедурой канюляции измерьте давление перфузии внутри канюли в пределах данного диапазона потока (50-300 МКЛ/мин, рисунок 3). Делайте это только при использовании новой канюлы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Давление перфузии внутри канюли пропорционально потоку и линейно установлено(рисунок 3).

4. Извлечение мыши сердца

1. Поместите мышь C57BL/6 (пол, 8-16 недель) в анестезию, которая соединена с резервуарами изофлурана и кислорода.
2. Включите кислородный баллон и запустите поток изофлюрана. Подождите 5 минут, пока мышь полностью не будет анестезирован.
3. После того, как анестезия установлена, возьмите мышь из анестезии окно и вводить гепарин IP (в брюшной полости, 360 единиц, 0,5 мл / мышь), чтобы избежать образования тромба в сосудах. Затем положите мышь обратно в анестезию поле.
4. Через 10 минут после введения гепарина перемести мышь на нагретую кровать в положении на спине и стабилизуйте ее лапы с помощью ленты для маркировки. Держите мышь под полной анестезией с изофлюраном с помощью носового конуса.
5. Поднимите брюшную кожу мыши над диафрагмой с помощью типсов и использовать хирургические ножницы, чтобы сократить и разоблачить диафрагму.
6. Вырезать диафрагму и грудину. Открой грудь.
7. Рассекаете сердце из грудной полости, разрезая как можно ближе к спинной грудной стенке.
8. Поместите сердце в ледяной раствор Тирода, содержащий 30 мМ БДМ.
9. Очистите сердце, чтобы удалить соединительные ткани, такие как легкие.
10. Перенесите сердце в предварительно охлажденную вскрытую камеру, наполненную раствором Тирода, содержащим 30 мМ БДМ.

5. Подготовка и канюляция перегородки

1. Включите сервопривод. Установите сервопривод в режим «потока». Пусть он работает на высокой скорости, пока трубки заполнены раствором Тирода, который будет использоваться для окаймливания сосудистого люмена. Убедитесь, что в трубе нет пузырьков. Затем снизить скорость.
2. Прикрепите сердце к PDMS, избегая каких-либо повреждений средней области сердца.
3. Удалите как правую, так и левую атрию. Разрежьте правый желудочек и удалите правый желудочковую свободную стену с помощью рассеченного микроскопа.
4. Разоблачить и определить перегородку артерии. Поместите нейлоновую нить (диаметр 30 мкм) под перегородку и завяжуте свободный узел для использования в будущем.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перегородка артерии можно легко определить с помощью рассечения микроскопа. Перегородка является основной артерией на перегородке, происходящих из правой коронарной артерии в большинстве случаев.
5. Удалите левый желудочковой свободной стенки с помощью тонких ножниц.
6. Перенесите подготовку папиллярных мышц в экспериментальную камеру, в которой была расположена канюля. Камера заполнена раствором Тирода, содержащим BDM. Нижняя часть этой камеры покрыта тонким слоем PDMS.
7. Отрегулируйте положение канюли (с помощью микроманипулятора), чтобы канюляция перегородки артерии. Затяните узел.
8. Безопасные папиллярной мышцы с помощью небольших булавки в камеру пола, так что микроскоп цель имеет четкое представление о сосудах. Обратите внимание на угол и положение канюли и убедитесь, что кончик канюли параллелен с артериальной стенкой.
9. Испытание канюляции путем постепенного изгнания раствора из шприца через канюлю. Если все элементы функционируют должным образом, остаточная кровь в папиллярной мышце выйдет из ткани в начале этого процесса, и только раствор Тирода будет виден позже.

6. Стабилизация подготовки

1. Включите перистальтический насос, который обеспечит решение суперфузии. Затем постоянно переливять препарат в ванну с предварительно газированной PSS со скоростью 3-4 мл/мин.
2. Включите контроллер температуры для решения суперфузии. Отрегулируйте температуру суперфусата ванны до 35-37 градусов по Цельсию.
3. Подключите канюлю к сервоприводу. Прочитайте давление, отображаемое на контроллере сервоприводов давления.
4. Мониторинг потока и давления. Поток (йл/мин) и артериальное давление перфузии (мм рт. ст.) оцифровывается с помощью дигитайзера и регистрируется с помощью связанного программного обеспечения(рисунок 2).
5. Отрегулируйте поток, чтобы установить давление 10 мм рт. ст. и дайте ему работать в течение 10 мин.
6. Увеличьте поток светимого раствора, чтобы сделать давление артерии 60 мм рт. ст. Получить окончательное давление перфузии артериола себя, вычитая падение давления канюли (Рисунок 3).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если выбран режим «давления» на контроллере сервопривода давления, для этих экспериментов устанавливается светимое давление 60 мм рт. ст. Затем следите за изменением потока.
7. Пусть образец стабилизируется в течение 30-60 мин, отслеживая уровень потока и/или давления. Постепенное повышение артериального давления обычно наблюдается в начале перфузии после каннуляции. Новое стабильное состояние будет получить установить сам по себе примерно в 30 мин (Рисунок 4).
8. Инициировать эксперимент после стабилизации перфузионого давления (при постоянном потоке).

7. Загрузка препарата флуоресцентно помеченным агглютинином пшеницы-зародыша (WGA)

1. Подготовь решение Tyrode, содержащее Alexa-Fluor-488, спрягало WGA, добавив 100 мкг спряженной WGA в 5 мл раствора Тирода.
2. Тщательно переключите перфусат с нормального раствора Тирода на раствор, содержащий флуоресцентно помеченный WGA. Важно тщательно переключить перфусировать так, чтобы пузырьки не были введены.
3. После 30 мин перфузии WGA или когда решение WGA вот-вот конализуется, измените перфузат обратно в нормальное решение Tyrode.

8. Конфокальные изображения артериол и капилляров

1. Включите систему конфокального микроскопа диска Nipkow.
2. Используйте микроскоп, чтобы найти перегородку артерии с помощью низкой мощности цели (4x) в режиме передаваемого света.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Септальная артерия может быть расположена, следуя положению канюли.
3. Начните конфокаленную визуализацию с конфокального вращающегося диска и выберите 488 нм возбуждающей лазер, 40-х объективное увеличение и отрегулируйте интенсивность лазера и скорость отбора проб (10 - 500 мс на изображение).
4. Настройка верхних и нижних позиций изображений для конфокального микроскопа для определения диапазона изображений и введите параметры для изображения z-stack.
5. Установите размер шага, как это рекомендовано для используемой системы, или установите размер шага по желанию.
6. Выберите настройки z-stack и/или настройки тайм-ряда.
7. Выберите или установите новую папку для хранения нового изображения.
8. Нажмите "Run", чтобы начать запись изображений для будущего анализа (рисунок 5).

9. Пример вазодилататорного эксперимента: вазодилатация, вызванная пинацидилатом (Видео 1).

1. Приготовьте раствор пинацидных запасов (100 мМ в DMSO) и хранится при 4 градусах Цельсия.
2. Приготовьте 10 мл раствора Tyrode. Добавьте 10 мкл раствора пинасидила, чтобы сделать окончательную концентрацию пинацида 100 МКМ.
3. Изображение папиллярной мышцы при низком увеличении (4x цель), чтобы включить перегородки артерии и ветви артериолы.
4. Переключитесь светящимся раствором на пинацид, содержащий раствор.

10. Пример экспериментов по контролю кровотока: вазоконструктор-индуцированное артериальное давление перфузии увеличивается при постоянном потоке(рисунок 6)

1. Подготовка эндотелина-1 (ET-1) фондовый раствор (10 МКМ) и хранится при -20 градусов по Цельсию.
2. Приготовьте 10 мл раствора Tyrode. Добавьте 10 мкл биржевого раствора ET-1 (10 МКМ), чтобы сделать окончательную концентрацию ET-1 10 nM.
3. Запись светимого давления с постоянным потоком и изображение сосолярной мышцы.
4. Переключитесь на раствор ET-1, содержащий раствор.

11. Пример изображения капилляров с перицитами(рисунок 7)

1. Пожертвуй трансгенной мышью NG2DsRedBAC, как описано в разделе 4 этого протокола.
2. Извлеките сердце, cannulate перегородки артерии и загрузить образец с Alexa-Fluor-488 конъюгированных WGA следующие протоколы 5-7.
3. Изображение папиллярной мышцы на 488 нм и 560 нм возбуждения, и 510-525 нм, 575-625 нм выбросов с использованием конфокальных. Давление артериола будет около 40 мм рт. ст.

Результаты

Когда флуоресцентный сосудистый маркер пронизывался в сосудистом люмене (здесь WGA спрягается с Alexa Fluor-488), можно визуализировать целые сосудистые деревья, как показано на рисунке 5 (Левая панель) с помощью высокоскоростного конфокального микроскопа. Дальнейшее увеличен?...

Обсуждение

В настоящей работе мы внедрили удивительно простой, но очень практичный метод ex vivo для изучения коронарной микроциркуляции сердца в физиологических условиях. Этот метод был изменен из механических исследований с использованием^{крыс 2}. Сложным дополнением была технология ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M CaCl2 solution	MilliporeSigma, USA	21115
1 M MgCl2 solution	MilliporeSigma, USA	M1028
AxoScope software	Molecular Devices, San Jose, CA, USA
Chiller/water incubator	FisherScientific, USA	Isotemp 3016S
Confocal	Nikon Instruments, USA	A1R
Custom glass tubing	Drummond Scientific Company	9-000-3301
Digidata 1322A	Molecular Devices, San Jose, CA, USA
Dissecting microscope	Olympus, Japan	SZX12
Endothelin-1	MilliporeSigma, USA	E7764
Forceps	Fine Scientific Tools	11295-51
Heparin Sodium Salt	Sigma-Aldrich, USA	H3393
Inline solution Heater	Warner Istruments, Hamden, CT, USA	SH-27B
Isoflurane	VETone, Idaho, USA	502017
Micropipette puller	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97
Micropipette/cannula holder	Warner Istruments, Hamden, CT, USA	64-0981
NG2DsRedBAC transgenic mouse	The Jackson Laboratory	#008241
Nylon thread for tying blood vessels	Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA	THR-G
PDMS (polydimethylsiloxane)	SYLGARD, Germantown, WI, USA	184 SIL ELAST KIT
Peristaltic pump	Gilson, Middleton, WI, USA	minipuls 3
Pressure Servo Controller	Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA	PS-200-S
Scissors	Fine Scientific Tools, Foster City, CA, USA	15000-10
Servo Pump	Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA	PS-200-P
Temperature controller	Warner Instruments, Hamden, CT, USA	TC-324B
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA USA	W11261