מדידה והדמיה דינמיות של נימים, עורקים ופריציטים בלב העכבר

Summary

מוצג כאן הוא פרוטוקול לחקור את microcirculation כלילית ברקמת לב מורין חי על ידי ניטור ex vivo של לחץ זלוף העורקים וזרימה השומרת על הלחץ, כמו גם רכיבי עץ כלי דם כולל מיטות נימי pericytes, כמו עורק הספל הוא משומר ולחץ.

Abstract

טון עורקי כלילית יחד עם פתיחה או סגירה של נימים במידה רבה לקבוע את זרימת הדם cardiomyocytes בלחץ זלוף מתמיד. עם זאת, קשה לעקוב אחר השינויים הדינמיים של העורקים הכליליים ונימים בלב כולו, בעיקר בשל התנועה שלה פועם ללא הפסקה. כאן אנו מתארים שיטה המאפשרת ניטור של קצב זלוף העורקים, לחץ ושינויים בקוטר של העורקים ונימים בשרירי הפפילרי הימניים של העכבר. עורק מחיצת העכבר הוא cannulated ו perfused בזרימה מתמדת או לחץ עם האחר נמדד באופן דינמי. לאחר זלוף עם לקטין שכותרתו פלואורסצנטית (למשל, אלקסה פלואור-488 או -633 שכותרתו חיטה-נבט Agglutinin, WGA), העורקים ונימים (וכלי דם אחרים) בשריר פפילרי החדר הימני מחיצה יכול להיות בתמונה בקלות. לאחר מכן ניתן למדוד את השינויים בקוטר כלי השיט בנוכחות או בהיעדר התכווצויות לב. כאשר חלבונים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית באו לידי ביטוי, ניתן היה לפקח על תכונות ספציפיות. לדוגמה, פריטיטים הוצגו בלבבות עכברים שהביעו NG2-DsRed. שיטה זו סיפקה פלטפורמה שימושית כדי ללמוד את הפונקציות הפיזיולוגיות של pericytes נימי בלב. הוא מתאים גם לחקר ההשפעה של ריאגנטים על זרימת הדם בלב על ידי מדידת קוטר כלי הדם / נימי ואת הלחץ הזוהר העורקי בו זמנית. הכנה זו, בשילוב עם מערכת הדמיה אופטית מתקדמת, מאפשרת לחקור את זרימת הדם ואת שליטתה ברמה התאית והמולקולרית בלב בתנאים כמעט פיזיולוגיים.

Introduction

תקנה מתאימה לזרימת לחץ כלילית מבטיחה אספקת דם מספקת ללב כדי לענות על דרישותיו המטבוליות¹. עם זאת, רק לאחרונה התברר כיצד זרימת הלחץ הכלילי מוסדר באופן דינמי בלב, למרות מחקרים מקיפים שבוצעו ב vivo ו במבחנה בעשורים האחרונים. אחת הסיבות לכך היא הקושי להקים מודל עבודה פיזיולוגי למחקרים כאלה עקב פעימות הלב המתמידות. ללא קשר, הוקמו מגוון שיטות לתצפית על כלי הדם הכליליים ברקמות או בבעלי חיים חיים, אך אף אחת משיטות אלה לא הצליחה להשיג מיקוד קבוע /יציב ומדידות הלחץ, הזרימה וקוטר המיקרו-וסקולרי בו זמנית^2,3. ההדמיה הישירה של כלי הדם העורקיים הכליליים בלב פועם הוצגה לפני עשרות שנים^4,3, אבל מדידות הקוטר בכלי קטן היה מאתגר ואת הפונקציות הספציפיות של סוגי תאים מיוחדים רבים הקשורים microcirculation היה מרגיז באותה מידה. אפילו השיטה סטרובוסקופית ומערכת אובייקטיבית צפה לא יכול לספק את המידע לעיל בו זמנית⁵. עם זאת, כמות משמעותית של מידע בעל ערך הושגה באמצעות הטכנולוגיות הנ"ל, אשר עזרו לנו להבין יותר על הרגולציה של זרימת דם כלילית⁶. השיטה שאנו מתארים במאמר זה תסייע לאחת לחקור ולהבין בפירוט כיצד רכיבים של עורקים כליליים, העורקים והמיקרו-וסקולטורה מגיבים באופן שונה לגירויים ולדרישות מטבוליות.

מודל העבודה שהקמנו כדי להמשיך במחקרים אלה נבנה על העבודה הקודמת של ווסטרהוף ואח^'2. בעקבות קנולציה של עורק המחיצה של לב העכבר, תמיסת מלח פיזיולוגית שימשה כדי להחדיר את העורק כדי לשמור על myocytes ורכיבים אחרים של רקמת הלב ניזונו. לחץ הזלוף העורקי, הזרימה וקוטר כלי הדם היו במעקב בין פונקציות פיזיולוגיות אחרות באמצעות אינדיקטורים פלואורסצנטיים מתאימים. שיטה זו מאפשרת לנו לדמיין את מיטת המיקרו-כלילית תחת לחץ פיזיולוגי ברקמה חיה וללמוד לראשונה את המנגנונים התאיים שבבסיס ויסות המיקרו-סירקולציה.

Protocol

כל הטיפול בבעלי חיים היה בהתאם להנחיות של אוניברסיטת מרילנד בולטימור והוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים אישרה פרוטוקולים.

1. הכנת הפתרונות

הערה: הכינו פתרונות מראש. שני סוגים של פתרונות בסיסיים משמשים בניסויים: (1) פתרונות מלוחים פיזיולוגיים (PSS) עבור superfusate אמבטיה ו (2) הפתרונות של טירודה עבור לומן perfusate. מבעבע מתמשך עם CO 2 יש_צורך לשמור על ה- pH של PSS. הפתרון של Tyrode HEPES-אגירה משמש לומן במקום PSS כדי למנוע בועות הולך לתוך כלי, שכן בועות יפגעו בתאי האנדותל⁷ ולחסן את הזרימה.

1. פתרון PSS: ראה את הנוסחה וההרכב של פתרון PSS בטבלה 1. הפוך 10 L של Ca^{2 +}ללא גלוקוז PSS מלאי פתרון ולאחסן בטמפרטורת החדר. 1 שעה לפני כל הליך, להוציא 1 L של פתרון המניה בועה עם 5% CO₂ (74% N₂ ו 21% O₂) כדי לשמור על ה- pH של הפתרון ב ~ 7.4. הוסף 1.8 גרם גלוקוז ו 1.8 מ"ל CaCl₂ (1 M מלאי)⁸.
   הערה: הוסף Ca²⁺ רק לאחר מבעבע כאשר pH הוא ~ 7.4, אחרת, Ca^{2 +} יהיה זירז.
2. הפתרון של Tyrode: ראה את הנוסחה וההרכב של הפתרון של Tyrode בטבלה 1. לסנן את הפתרון (0.22 מיקרומטר) ומאוחסן ב 4 °C (69 °F) לשימוש עתידי⁹.
3. הפתרון של Tyrode עם BDM (2,3-בוטנדיונה monoxime): להוסיף BDM כמעכב myofilament הפיך כדי למנוע התכווצות של myocytes¹⁰. לשקול 600 מ"ג BDM ולהוסיף 200 מ"ל של הפתרון של Tyrode. מערבבים את הפתרון עם BDM עד שהוא מומס לחלוטין. אין צורך בסינון נוסף.
4. אחסן את הפתרון של Tyrode המכיל BDM ב 4 °C (60 °F) לשימוש עתידי.

2. הכנה קאמרית

1. מעיל הן תא ניתוח תא ניסיוני מראש עם polydimethylsiloxane (PDMS) בעקבות ההוראות שסופקו על ידי היצרן.
2. מלאו את תא הניתוק בתמיסה של Tyrode המכילה BDM.
3. הפעל את הצ'ילר 1 שעה לפני ההליך. הגדר את הטמפרטורה ב 4 מעלות צלזיוס.

3. הכנת קנולה

1. הפעל את פולר המיקרופיפט. בחר את ההגדרות בהתאם להוראות היצרן.
2. קח צינור זכוכית בורוסיליקט נקי (הקוטר החיצוני והפנימי של צינורות הזכוכית המשמשים היה 1.2 מ"מ ו 0.69 מ"מ בהתאמה).
3. הכנס צינור זכוכית לתוך מלחציים מחורצים של פולטר סאטר פיפטה עם חוט חימום פלטינה בצורת U.
4. הפעל את המושך כדי לייצר שתי קנולה, כל אחד עם קצה דק ארוך.
5. חותכים את הקצה של כל קנולה באמצעות זוג דק של מספריים תחת מיקרוסקופ לנתח כדי להפוך את הקוטר הסופי של הקצה סביב 100 כדי 150 מיקרומטר.
6. אש ללטש את קצה הצינורית לחתוך מעט סביב הקצוות החדים.
7. לכופף את הצינורית לאורך הפיר באמצעות חוט פלטינה (מחומם עם שליטה עדינה) ממוקם בצד של הפיר כ 2 מ"מ מקצה. הזווית של העיקול בקנולה צריכה להיות סביב 45 מעלות.
8. הכנס את הקצה הפתוח של הצינורית למחזיק תא מיוגרף הלחץ והדק את המדידה. חבר מזרק 5 מ"ל מלא עם הפתרון של Tyrode לצד השני של המדידה. חברו את הצינורית למיקרו-מניפולטור המותקן בתא (ראו איור 1 ואיור 2).
9. ממלאים את הצינור בתמיסה של Tyrode באמצעות המזרק (5 מ"ל), שוטפים אותו, את הצינור ואת המחבר של בועות אוויר.
10. לפני פרוצדורת הצינור, מדדו את לחץ הזלוף בתוך הצינורית על פני טווח זרימה נתון (50 עד 300 μL/min, איור 3). עשה זאת רק כאשר נעשה שימוש בקנולה חדשה.
    הערה: לחץ הזלוף בתוך הצינורית פרופורציונלי לזרימה ומותאם ליניארי(איור 3).

4. חילוץ לב העכבר

1. שים עכבר C57BL/6 (או מין, 8-16 שבועות) בתיבת ההרדמה המחוברת למיכלי isoflurane וחמצן.
2. הפעל מיכל חמצן ולהתחיל את זרימת isoflurane. המתן ~ 5 דקות עד שהעכבר מורדם לחלוטין.
3. לאחר הרדמה הוקמה, להוציא את העכבר מתוך תיבת הרדמה ולהזריק הפרין IP (לתוך חלל הצפק, 360 יחידות, 0.5 מ"ל / עכבר) כדי למנוע היווצרות קריש דם בכלי הדם. ואז להחזיר את העכבר לתיבת ההרדמה.
4. 10 דקות לאחר הפרין כבר מוזרק, להזיז את העכבר למיטה מחוממת בתנוחה סופית לייצב את כפותיו באמצעות סרט תיוג. שמור את העכבר תחת הרדמה מלאה עם isoflurane באמצעות חרוט האף.
5. הרם את עור הבטן של העכבר מעל הסרעפת עם מלקחיים והשתמש במספריים כירורגיים כדי לחתוך ולחשוף את הסרעפת.
6. חותכים את הסרעפת ואת עצם החזה. פתח את החזה.
7. לנתח את הלב מתוך חלל בית החזה, חיתוך קרוב ככל האפשר לקיר בית החזה הגבי.
8. מניחים את הלב לתוך הפתרון של Tyrode קר כקרח המכיל 30 מ"מ BDM.
9. נקה את הלב כדי להסיר את רקמות החיבור כגון ריאות.
10. מעבירים את הלב לתא הניתוק המצונן מראש, המלא בתמיסה של טיירוד המכילה 30 מ"מ BDM.

5. הכנה וקנציה של עורק מחיצה

1. תדליק את משאבת הסרוו. הגדר את משאבת הסרוו למצב "זרימה". תן לו לרוץ במהירות גבוהה עד הצינור מלא עם הפתרון של Tyrode שישמש כדי לחלחל לומן כלי הדם. ודא שאין בועות בצינורות. אז תנמיך את המהירות.
2. הצמד את הלב אל PDMS, הימנעות כל נזק לאזור האמצעי של הלב.
3. הסר גם את האטריה הימנית וגם השמאלית. חותכים לפתוח את החדר הימני ולהסיר את הקיר הימני ללא חדרית באמצעות מיקרוסקופ מנתח.
4. לחשוף ולזהות את עורק המחיצה. מניחים חוט ניילון (קוטר 30 מיקרומטר) מתחת לעורק המחיצה וקושרים קשר רופף לשימוש עתידי.
   הערה: ניתן לזהות בקלות את עורק המחיצה באמצעות מיקרוסקופ מנתח. עורק המחיצה הוא עורק ראשי על מחיצה שמקורו בעורק הכלילי הנכון ברוב המקרים.
5. הסר את הקיר השמאלי ללא חדרים באמצעות מספריים עדינות.
6. מעבירים את הכנת שריר הפפילרי לתא הניסוי שבו הוצבה הצינורית. התא מלא בתמיסה של טיירוד המכילה BDM. החלק התחתון של תא זה מצופה בשכבה דקה (~ 2 מ"מ) של PDMS.
7. להתאים את המיקום של הצינורית (באמצעות micromanipulator) כדי לאפשר קנולציה של עורק המחיצה. הדק את הקשר.
8. לאבטח את שריר הפפילרי באמצעות סיכות קטנות לרצפת התא, כך המטרה מיקרוסקופ יש תצוגה ברורה של כלי הדם. שימו לב לזווית ולמיקום הצינורית והבטיחו שקצה הצינורית מקביל לקיר העורקים.
9. בדיקת קנולציה על ידי גירוש הדרגתי של הפתרון מהמזרק דרך הצינורית. אם כל האלמנטים לתפקד כראוי, שאריות דם בשריר הפפילרי ייצא הרקמה בתחילת תהליך זה ורק הפתרון של Tyrode ייראה מאוחר יותר.

6. ייצוב ההכנה

1. הפעל את המשאבה peristaltic שיספק את פתרון superfusion. ואז כל הזמן superfuse ההכנה באמבטיה עם PSS גזים מראש בקצב של 3-4 מ"ל / דקה.
2. הפעל את בקר הטמפרטורה עבור פתרון superfusion. להתאים את הטמפרטורה של superfusate האמבטיה ~ 35-37 מעלות צלזיוס.
3. חבר את הצינורית למשאבת הסרוו. קרא את הלחץ המוצג על בקר סרוו הלחץ.
4. לפקח על הזרימה והלחץ. הזרימה (μL/min) ולחץ זלוף העורקים (מ"מ ח"ג) הם דיגיטציה באמצעות דיגיטייזר ומתועדים באמצעות תוכנה משויכת (איור 2).
5. להתאים את הזרימה כדי להגדיר את הלחץ ~ 10 מ"מ ש"ג ולתת לו לרוץ במשך ~ 10 דקות.
6. להגביר את זרימת הפתרון הזוהר כדי להפוך את הלחץ של העורק ~ 60 מ"מ.ג. השג את לחץ הזלוף הסופי של העורק עצמו על ידי חיסור טיפת הלחץ של הצינורית (איור 3).
   הערה: אם מצב "לחץ" על בקר סרוו לחץ נבחר, הלחץ הזוהר מוגדר ~ 60 מ"מ ח"ג לניסויים אלה. לאחר מכן נטר את שינוי הזרימה.
7. תן לדגימה לייצב ~ 30-60 דקות על ידי ניטור רמות הזרימה ו / או הלחץ. עלייה הדרגתית של לחץ עורקי נצפתה בדרך כלל בתחילת זלוף לאחר קנולציה. מדינה יציבה חדשה תקום מעצמה ב-30 דקות(איור 4).
8. ליזום ניסוי לאחר לחץ זלוף מיוצב (בזרימה מתמדת).

7. טעינת ההכנה עם אגלוטינין נבט חיטה מתויג פלואורסצנטי (WGA)

1. הכן את הפתרון של Tyrode המכיל אלקסה-פלואור-488 מצומד WGA על ידי הוספת 100 מיקרוגרם של WGA מצומד לתוך 5 מ"ל של הפתרון של Tyrode.
2. בזהירות לעבור perfusate מן הפתרון של Tyrode נורמלי אחד המכיל WGA מתויג פלואורסצנטי. חשוב להחליף בזהירות את perfusate, כך בועות לא הציגו.
3. לאחר ~ 30 דקות של זלוף WGA או כאשר פתרון WGA עומד להיגמר, לשנות את perfusate בחזרה לפתרון הרגיל של Tyrode.

8. הדמיה קונפוקלית של עורקים ונימים

1. הפעל את מערכת המיקרוסקופ הקונפוקלית של דיסק Nipkow.
2. השתמש במיקרוסקופ כדי לאתר את עורק המחיצה באמצעות מטרת הספק נמוך (4x) במצב אור משודר.
   הערה: עורק Septal יכול להיות ממוקם על ידי ביצוע המיקום של הצינורית.
3. התחל הדמיה confocal עם confocal דיסק מסתובב ובחר לייזר עירור 488 ננומטר, הגדלה אובייקטיבית 40x ולהתאים את עוצמת הלייזר ואת קצב הדגימה (10 - 500 ms לתמונה).
4. הגדר עמדות דימות עליונות ותחתונות עבור המיקרוסקופ הקונפוקאלי כדי להגדיר את טווח ההדמיה והזן את הפרמטרים עבור הדמיית מחסנית z.
5. הגדר את גודל השלב כפי שהומלץ עבור המערכת הנמצאת בשימוש או הגדר את גודל השלב כרצונך.
6. בחר בהגדרות של הגדרת מחסנית z ו/או הגדרות סידרת הזמן.
7. בחר או הגדר תיקיה חדשה לאחסון התמונה החדשה.
8. לחץ על "הפעל" כדי להתחיל להקליט הדמיה לניתוח עתידי (איור 5).

9. ניסוי vasodilator לדוגמה: vasodilation הנגרמת על ידי פינצ'ידיל (וידאו 1).

1. הכן פתרון מלאי פינצ'ידיל (100 מ"מ ב- DMSO) ומאוחסן ב- 4 °C (60 °F).
2. הכן 10 מ"ל של הפתרון של Tyrode. הוסף 10 μL של פתרון מניית pinacidil כדי להפוך את הריכוז הסופי של pinacidil 100 μM.
3. תמונה שריר הפפילרי בהגדלה נמוכה (4x המטרה) כדי לכלול את עורק המחיצה ואת עורקי הענף.
4. החלף פתרון לומינלי לפינצ'ידיל המכיל פתרון.

10. ניסויים לדוגמה לבקרת זרימת דם: לחץ זלוף עורקי הנגרם על ידי vasoconstrictor עולה בזרימה מתמדת (איור 6)

1. הכינו פתרון מלאי אנדותלין-1 (ET-1) (10 מיקרומטר) ומאוחסנים ב-20°C(20°C).
2. הכן 10 מ"ל של הפתרון של Tyrode. הוסף 10 μL של פתרון מניית ET-1 (10 מיקרומטר) כדי להפוך את הריכוז הסופי של ET-1 10 nM.
3. להקליט את הלחץ הזוהר עם זרימה מתמדת תמונה שריר הפפילרי.
4. החלף פתרון לומינלי לפתרון המכיל ET-1.

11. תמונות לדוגמה של נימי עם פריצילים (איור 7)

1. להקריב עכבר מהונדס NG2DsRedBAC כמתואר בסעיף 4 של פרוטוקול זה.
2. לחלץ את הלב, cannulate את עורק המחיצה ולטעון את המדגם עם Alexa-Fluor-488 מצומד WGA בעקבות פרוטוקולים 5-7.
3. תמונה שריר הפפילרי ב 488 ננומטר ו 560 ננומטר עירור, ו 510-525 ננומטר, 575-625 ננומטר פליטה באמצעות confocal. לחץ העורקים יהיה סביב 40 מ"מ.ג.

תוצאות

כאשר סמן כלי דם פלואורסצנטי הוא perfused לומן כלי דם (כאן WGA מצומד עם Alexa Fluor-488), ניתן לדמיין עצי כלי דם שלמים כפי שמוצג באיור 5 (פאנל שמאלי) באמצעות מיקרוסקופ confocal במהירות גבוהה. הגדלה נוספת מאפשרת הדמיה של נימי בפירוט(איור 5, לוח ימני). מאז המערכת בלחץ תומך ניטור מת?...

Discussion

בעבודה הנוכחית, הצגנו שיטת אקס ויו פשוטה להפליא אך מעשית מאוד לחקר המיקרו-סירקולציה כלילית בלב בתנאים פיזיולוגיים. שיטה זו שונתה מחקירות מכניות באמצעות חולדות². התוספת המאתגרת הייתה טכנולוגיית ההדמיה במהירות גבוהה וברזולוציה אופטית גבוהה. לכן, הצלחנו לנצל את מערכות ההדמיה ה?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M CaCl2 solution	MilliporeSigma, USA	21115
1 M MgCl2 solution	MilliporeSigma, USA	M1028
AxoScope software	Molecular Devices, San Jose, CA, USA
Chiller/water incubator	FisherScientific, USA	Isotemp 3016S
Confocal	Nikon Instruments, USA	A1R
Custom glass tubing	Drummond Scientific Company	9-000-3301
Digidata 1322A	Molecular Devices, San Jose, CA, USA
Dissecting microscope	Olympus, Japan	SZX12
Endothelin-1	MilliporeSigma, USA	E7764
Forceps	Fine Scientific Tools	11295-51
Heparin Sodium Salt	Sigma-Aldrich, USA	H3393
Inline solution Heater	Warner Istruments, Hamden, CT, USA	SH-27B
Isoflurane	VETone, Idaho, USA	502017
Micropipette puller	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97
Micropipette/cannula holder	Warner Istruments, Hamden, CT, USA	64-0981
NG2DsRedBAC transgenic mouse	The Jackson Laboratory	#008241
Nylon thread for tying blood vessels	Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA	THR-G
PDMS (polydimethylsiloxane)	SYLGARD, Germantown, WI, USA	184 SIL ELAST KIT
Peristaltic pump	Gilson, Middleton, WI, USA	minipuls 3
Pressure Servo Controller	Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA	PS-200-S
Scissors	Fine Scientific Tools, Foster City, CA, USA	15000-10
Servo Pump	Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA	PS-200-P
Temperature controller	Warner Instruments, Hamden, CT, USA	TC-324B
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA USA	W11261