Medição dinâmica e imagem de capilares, arterioles e pericias em coração de rato

Resumo

Apresentado aqui é um protocolo para estudar a microcirculação coronária no tecido cardíaco murino vivo por ex vivo monitoramento da pressão e fluxo de perfusão arterial que mantém a pressão, bem como componentes de árvores vasculares, incluindo os leitos capilares e pericitos, já que a artéria septal é canulada e pressurizada.

Resumo

O tom arterial coronário, juntamente com a abertura ou fechamento dos capilares, determinam em grande parte o fluxo sanguíneo para cardiomiócitos com pressão constante de perfusão. No entanto, é difícil monitorar as mudanças dinâmicas das artérias coronárias e dos capilares em todo o coração, principalmente devido ao seu movimento e espancamento sem parar. Aqui descrevemos um método que permite o monitoramento da taxa de perfusão arterial, pressão e as alterações de diâmetro das artérias e capilares nos músculos papilares ventriculares do mouse direito. A artéria septal do rato é cânulada e perfundida em um fluxo ou pressão constante com a outra medida dinamicamente. Após a perfusão com uma lectina fluorescente (por exemplo, Alexa Fluor-488 ou -633 rotulada de Agglutinina-Germe de trigo, WGA), as arterioles e capilares (e outros vasos) no músculo papilar e septo papirlículo do ventrículo direito podem ser prontamente imagens. As alterações do diâmetro do vaso poderiam então ser medidas na presença ou ausência de contrações cardíacas. Quando proteínas fluorescentes geneticamente codificadas foram expressas, características específicas poderiam ser monitoradas. Por exemplo, pericítos foram visualizados em corações de camundongos que expressavam NG2-DsRed. Este método forneceu uma plataforma útil para estudar as funções fisiológicas dos pericítos capilares no coração. Também é adequado para estudar o efeito dos reagentes no fluxo sanguíneo no coração, medindo o diâmetro vascular/capilar e a pressão luminal arterial simultaneamente. Esta preparação, combinada com um sistema de imagem óptica de última geração, permite estudar o fluxo sanguíneo e seu controle a nível celular e molecular no coração em condições quase fisiológicas.

Introdução

A regulação adequada do fluxo de pressão coronariana garante o suprimento sanguíneo suficiente ao coração para atender às suas demandas metabólicas¹. No entanto, só recentemente ficou claro como o fluxo de pressão coronária é dinamicamente regulado no coração, apesar de extensos estudos que têm sido realizados in vivo e in vitro nas últimas décadas. Uma das razões é a dificuldade em estabelecer um modelo de trabalho fisiológico para tais estudos devido à constante batida do coração. Independentemente disso, uma variedade de métodos foram estabelecidos para a observação dos micro-vasos coronários em tecidos ou animais vivos, mas nenhum desses métodos foi capaz de alcançar foco constante/estável e as medidas da pressão, fluxo e diâmetro microvascular ao mesmo tempo^2,3. A visualização direta de micropescos arteriais coronárias no coração pulsante foi introduzida décadas atrás^4,3, mas as medidas de diâmetro em pequenos vasos foram desafiadoras e as funções específicas dos muitos tipos de células especializadas associadas à microcirculação foram igualmente vexato. Mesmo o método estromacópico e o sistema objetivo flutuante não puderam fornecer as informações acima simultaneamente⁵. No entanto, uma quantidade significativa de informações valiosas foi obtida utilizando-se as tecnologias acima mencionadas, que nos ajudaram a entender mais sobre a regulação do fluxo sanguíneo coronário⁶. O método que estamos descrevendo neste artigo ajudará a investigar e entender detalhadamente como os componentes das artérias coronárias, das artérias e da microvasculatura respondem de forma diferente às estimulações e demandas metabólicas.

O modelo de trabalho que estabelecemos para prosseguir esses estudos foi construído sobre o trabalho anterior de Westerhof et al.². Após a cannulação da artéria septal do coração do camundongo, a solução fisiológica salina foi usada para perfundir essa artéria para manter os miócitos e outros componentes do tecido cardíaco nutridos. A pressão arterial de perfusão, o fluxo e o diâmetro vascular foram monitorados entre outras funções fisiológicas utilizando indicadores fluorescentes adequados. Este método nos permite visualizar o leito microvascular coronariano sob pressão fisiológica no tecido vivo e estudar os mecanismos celulares subjacentes à regulação da microcirculação pela primeira vez.

Protocolo

Todos os cuidados com animais estavam de acordo com as diretrizes da Universidade de Maryland Baltimore e o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais aprovou protocolos.

1. Preparação das soluções

NOTA: Prepare as soluções com antecedência. Dois tipos de soluções básicas são utilizadas nos experimentos: (1) soluções fisiológicas de soro fisiológico (PSS) para superfusato de banho e (2) soluções de Tyrode para o perfusato de lúmen. O borbulhamento contínuo com CO₂ é necessário para manter o pH do PSS. A solução de Tyrode tamponada pelo HEPES é usada no lúmen em vez de PSS para evitar que bolhas entrem nos vasos, uma vez que as bolhas danificariam as células endoteliais⁷ e ocluiriam o fluxo.

1. Solução PSS: Veja a fórmula e a composição da solução PSS na Tabela 1. Faça 10 L de Ca²⁺-free e sem glicose solução de estoque PSS e armazene a temperatura ambiente. 1 h antes de qualquer procedimento, tire 1 L da solução de estoque e bolha com 5% de CO₂ (74% N₂ e 21% O₂) para manter o pH da solução em ~7,4. Adicione 1,8 g de glicose e 1,8 mL CaCl₂ (1 M de estoque)⁸.
   NOTA: Adicione Ca^{2+ somente depois} de borbulhar quando o pH estiver ~7.4, caso contrário, Ca²⁺ será precipitado.
2. Solução de Tyrode: Veja a fórmula e a composição da solução do Tyrode na Tabela 1. Filtre a solução (0,22 μm) e armazenada a 4 °C para uso futuro⁹.
3. Solução de Tyrode com BDM (monoxime 2,3-Butanedione): Adicionar BDM como um inibidor reversível de miofilação para evitar a contração dos miócitos¹⁰. Pese 600 mg BDM e adicione a 200 mL da solução de Tyrode. Mexa a solução com BDM até que esteja completamente dissolvida. Não é necessária mais filtragem.
4. Armazene a solução do Tyrode contendo BDM a 4 °C para uso futuro.

2. Preparação da câmara

1. Cubra a câmara de dissecação e a câmara experimental com antecedência com polidimetilasiloxano (PDMS) seguindo as instruções fornecidas pelo fabricante.
2. Encha a câmara de dissecação com a solução do Tyrode contendo BDM.
3. Ligue o refrigerador 1h antes do procedimento. Coloque a temperatura em 4 °C.

3. Preparação da cânula

1. Ligue o puxador de micropipette. Selecione as configurações de acordo com as instruções do fabricante.
2. Tome um tubo de vidro borossilicato limpo (o diâmetro externo e interno dos tubos de vidro utilizados foi de 1,2 mm e 0,69 mm, respectivamente).
3. Insira um tubo de vidro nos grampos ranhurados de um puxador de pipeta Sutter com um filamento de aquecimento de platina em forma de U.
4. Ative o puxador para produzir duas cânulas, cada uma com uma ponta fina longa.
5. Corte a ponta de cada cânula usando um belo par de tesouras sob um microscópio dissecando para fazer o diâmetro final da ponta em torno de 100 a 150 μm.
6. Coloque o polimento da ponta da cânula cortada para contornar ligeiramente as bordas afiadas.
7. Dobre a cânula ao longo do eixo usando um fio de platina (aquecido com controle fino) posicionado na lateral do eixo aproximadamente 2 mm da ponta. O ângulo da curva na cânula deve ser de cerca de 45°.
8. Insira a extremidade aberta da cânula no suporte da câmara de miógrafo de pressão e aperte a montagem. Conecte uma seringa de 5 mL preenchida com a solução de Tyrode para o outro lado do encaixe. Conecte a cânula a um micromanipulador montado na câmara (ver Figura 1 e Figura 2).
9. Encha a cânula com a solução de Tyrode usando a seringa (5 mL), lavando-a, o tubo e o conector das bolhas de ar.
10. Antes do procedimento de canulação, meça a pressão de perfusão dentro da cânula sobre uma determinada faixa de fluxo (50 a 300 μL/min, Figura 3). Faça isso somente quando uma nova cânula é usada.
    NOTA: A pressão de perfusão dentro da cânula é proporcional ao fluxo e é linear(Figura 3).

4. Extração do coração do rato

1. Coloque um rato C57BL/6 (sexo, 8-16 semanas de idade) na caixa de anestesia que está conectada aos tanques de isoflurane e oxigênio.
2. Ligue o tanque de oxigênio e inicie o fluxo de isoflurane. Espere ~5 min até que o mouse esteja totalmente anestesiado.
3. Após a anestesia ser estabelecida, tire o rato da caixa de anestesia e injete heparina IP (na cavidade peritoneal, 360 unidades, 0,5 mL/rato) para evitar a formação de coágulos sanguíneos na vasculatura. Em seguida, coloque o rato de volta na caixa de anestesia.
4. 10 minutos após a injeção da heparina, mova o mouse para a cama aquecida em uma posição supina e estabilize suas patas usando fita de rotulagem. Mantenha o rato sob anestesia completa com isoflurano usando um cone de nariz.
5. Levante a pele abdominal do camundongo acima do diafragma com fórceps e use uma tesoura cirúrgica para cortar e expor o diafragma.
6. Corte o diafragma e o esterno. Abra o peito.
7. Dissecar o coração para fora da cavidade torácica, cortando o mais próximo possível da parede torácica dorsal.
8. Coloque o coração na solução de Tyrode gelada contendo 30 mM BDM.
9. Limpe o coração para remover os tecidos conjuntivos, como o pulmão.
10. Transfira o coração para a câmara de dissecação pré-refrigerada cheia de solução de Tyrode contendo BDM de 30 mM.

5. Preparação e cannulação da artéria septal

1. Ligue a bomba de servo. Ajuste a bomba de servo para o modo "fluxo". Deixe-o funcionar em alta velocidade até que a tubulação esteja cheia com a solução do Tyrode que será usada para perfundir o lúmen vascular. Certifique-se de que não há bolhas na tubulação. Em seguida, abaixe a velocidade.
2. Coloque o coração no PDMS, evitando qualquer dano na área do meio do coração.
3. Remova a ária direita e esquerda. Abra o ventrículo direito e remova a parede livre ventricular direita usando um microscópio dissecando.
4. Exponha e identifique a artéria septal. Coloque uma linha de nylon (30 μm de diâmetro) sob a artéria septal e amarre um nó solto para uso futuro.
   NOTA: A artéria septal pode ser facilmente identificada usando um microscópio dissecando. A artéria septal é uma artéria importante no septo originário da artéria coronária direita na maioria dos casos.
5. Remova a parede livre ventricular esquerda usando uma tesoura fina.
6. Transfira a preparação do músculo papilar para a câmara experimental na qual a cânula foi posicionada. A câmara está cheia com a solução de Tyrode contendo BDM. A parte inferior desta câmara é revestida com uma fina (~2 mm) camada de PDMS.
7. Ajuste a posição da cânula (usando o micromanipulador) para permitir a cannulação da artéria septal. Aperte o nó.
8. Fixar o músculo papilar usando pequenos pinos no chão da câmara para que o objetivo do microscópio tenha uma visão clara da vasculatura. Preste atenção ao ângulo e à posição da cânula e certifique-se de que a ponta da cânula esteja paralela à parede arterial.
9. Teste aculação expulsando gradualmente a solução da seringa através da cânula. Se todos os elementos funcionarem corretamente, o sangue residual no músculo papilar sairá do tecido no início deste processo e apenas a solução de Tyrode será vista mais tarde.

6. Estabilização da preparação

1. Ligue a bomba peristáltica que fornecerá a solução de superfusão. Em seguida, sobrefundir constantemente a preparação no banho com PSS pré-gaseado à taxa de 3-4 mL/min.
2. Ligue o controlador de temperatura para a solução de superfusão. Ajuste a temperatura do superfusado do banho para ~35-37 °C.
3. Conecte a cânula à bomba de servo. Leia a pressão exibida no controlador de servo de pressão.
4. Monitore o fluxo e a pressão. A pressão de fluxo (μL/min) e a perfusão arterial (mm Hg) é digitalizada por digitalização por digitalização e registrada por meio de um software associado(Figura 2).
5. Ajuste o fluxo para definir a pressão ~10 mmHg e deixe-a funcionar por ~10 min.
6. Aumente o fluxo da solução luminal para fazer a pressão da artéria ~60 mmHg. Obtenha a pressão final de perfusão da própria arteriola subtraindo a queda de pressão da cânula(Figura 3).
   NOTA: Se o modo "pressão" no controlador de servo de pressão for selecionado, a pressão luminal será definida ~60 mmHg para esses experimentos. Em seguida, monitore a mudança do fluxo.
7. Deixe a amostra estabilizar por ~30-60 min monitorando os níveis de fluxo e/ou pressão. Um aumento gradual da pressão arterial é normalmente observado no início da perfusão após a canulação. Um novo estado estável será estabelecido por si só em cerca de 30 min(Figura 4).
8. Inicie um experimento depois que a pressão de perfusão for estabilizada (em fluxo constante).

7. Carregando a preparação com aglutina de germe de trigo fluorescente (WGA)

1. Prepare a solução da Tyrode contendo WGA conjugada Alexa-Fluor-488 adicionando 100 μg de WGA conjugada em 5 mL da solução de Tyrode.
2. Alterne cuidadosamente o perfusato da solução normal de Tyrode para uma contendo WGA marcada fluorescentemente. É importante alternar cuidadosamente o perfusato para que não sejam introduzidas bolhas.
3. Depois de ~30 minutos de perfusão WGA ou quando a solução WGA está prestes a acabar, mude o perfusado de volta para a solução normal de Tyrode.

8. Imagem confocal de arterioles e capilares

1. Ligue o sistema de microscópio confocal do disco Nipkow.
2. Use o microscópio para localizar a artéria septal usando um objetivo de baixa potência (4x) no modo de luz transmitido.
   NOTA: A artéria septal pode ser localizada seguindo a posição da cânula.
3. Inicie a imagem confocal com o disco giratório confocal e escolha 488 nm laser de excitação, ampliação objetiva de 40x e ajuste a intensidade do laser e a taxa de amostragem (10 - 500 ms por imagem).
4. Configure posições de imagem superior e inferior para o microscópio confocal para definir a faixa de imagem e digite os parâmetros para a imagem de pilha z.
5. Defina o tamanho da etapa conforme recomendado para o sistema que está sendo usado ou defina o tamanho da etapa conforme desejado.
6. Escolha as configurações de pilha z e/ou as configurações da série de tempo.
7. Selecione ou defina uma nova pasta para armazenar a nova imagem.
8. Clique em "Executar" para começar a gravar imagens para análise futura(Figura 5).

9. Exemplo de experimento vasodilatador: vasodilatação induzida por pinácido (Vídeo 1).

1. Prepare a solução de estoque de pinácido (100 mM em DMSO) e armazenada a 4 °C.
2. Prepare 10 mL da solução de Tyrode. Adicione 10 μL de solução de estoque de pinácido para fazer a concentração final de pinácido 100 μM.
3. Imagem do músculo papilar em baixa ampliação (objetivo 4x) para incluir a artéria septal e as artérias do ramo.
4. Alterne a solução luminal para a solução contendo pinácido.

10. Exemplo de experimentos de controle de fluxo sanguíneo: aumento da pressão arterial induzida por vasoconstritor ao fluxo constante(Figura 6)

1. Prepare a solução de estoque endotelina-1 (ET-1) e armazenada a -20 °C.
2. Prepare 10 mL da solução de Tyrode. Adicione 10 μL de solução de estoque ET-1 (10 μM) para fazer a concentração final de ET-1 10 nM.
3. Regissão a pressão luminal com fluxo constante e imagem do músculo papilar.
4. Alterne a solução luminal para a solução contendo ET-1.

11. Exemplo de imagens capilares com pericílitos (Figura 7)

1. Sacrifique um rato transgênico NG2DsRedBAC, conforme descrito na seção 4 deste protocolo.
2. Extrair o coração, cannular a artéria septal e carregar a amostra com Alexa-Fluor-488 conjugada WGA seguindo os protocolos 5-7.
3. Imagem do músculo papilar a 488 nm e excitação de 560 nm, e 510-525 nm, 575-625 nm de emissão usando confocal. A pressão da arteriola será em torno de 40 mmHg.

Resultados

Quando um marcador vascular de fluorescência é perfumado em lúmen vascular (aqui WGA conjugado com Alexa Fluor-488), é possível visualizar árvores vasculares inteiras como mostrado na Figura 5 (painel esquerdo) usando microscópio confocal de alta velocidade. A ampliação adicional permite a imagem capilar em detalhes(Figura 5, Painel Direito). Uma vez que o sistema pressurizado suporta um monitoramento constante da pressão luminal, esta preparação pod...

Discussão

No presente trabalho, introduzimos um método ex vivo notavelmente simples, mas altamente prático, para estudar a microcirculação coronariana no coração em condições fisiológicas. Este método foi modificado a partir de investigações mecânicas utilizando ratos². A adição desafiadora foi a tecnologia de imagem com alta velocidade e alta resolução óptica. Nós, portanto, fomos capazes de aproveitar os sistemas avançados de imagem óptica que agora estão disponíveis comercialmente....

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M CaCl2 solution	MilliporeSigma, USA	21115
1 M MgCl2 solution	MilliporeSigma, USA	M1028
AxoScope software	Molecular Devices, San Jose, CA, USA
Chiller/water incubator	FisherScientific, USA	Isotemp 3016S
Confocal	Nikon Instruments, USA	A1R
Custom glass tubing	Drummond Scientific Company	9-000-3301
Digidata 1322A	Molecular Devices, San Jose, CA, USA
Dissecting microscope	Olympus, Japan	SZX12
Endothelin-1	MilliporeSigma, USA	E7764
Forceps	Fine Scientific Tools	11295-51
Heparin Sodium Salt	Sigma-Aldrich, USA	H3393
Inline solution Heater	Warner Istruments, Hamden, CT, USA	SH-27B
Isoflurane	VETone, Idaho, USA	502017
Micropipette puller	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97
Micropipette/cannula holder	Warner Istruments, Hamden, CT, USA	64-0981
NG2DsRedBAC transgenic mouse	The Jackson Laboratory	#008241
Nylon thread for tying blood vessels	Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA	THR-G
PDMS (polydimethylsiloxane)	SYLGARD, Germantown, WI, USA	184 SIL ELAST KIT
Peristaltic pump	Gilson, Middleton, WI, USA	minipuls 3
Pressure Servo Controller	Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA	PS-200-S
Scissors	Fine Scientific Tools, Foster City, CA, USA	15000-10
Servo Pump	Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA	PS-200-P
Temperature controller	Warner Instruments, Hamden, CT, USA	TC-324B
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA USA	W11261