마우스 심장의 모세혈관, 동맥 및 페리사이클의 동적 측정 및 이미징

요약

여기에 제시된 것은 혈관 동맥이 수납 및 가압되기 때문에, 모세관 침대 및 백혈구를 포함하는 혈관 나무 구성 요소뿐만 아니라 압력을 유지하는 동맥 관류 압력 및 흐름의 전 생체 모니터링에 의해 살아있는 뮤린 심장 조직에서 관상 동맥 미세 순환을 연구하는 프로토콜이다.

초록

관상 동맥 톤은 모세 혈관의 개폐와 함께 주로 일정한 관류 압력에서 심근세포로의 혈류를 결정합니다. 그러나, 관상 동맥과 전체 심혼에 있는 모세 혈관의 동적 변경을 감시하기 어렵습니다, 주로 그것의 운동 및 논스톱 치기 때문에. 여기에서 우리는 마우스 오른쪽 심실 유두 근육에 동맥 관류 속도, 압력 및 모세 혈관의 직경 변화의 모니터링을 가능하게하는 방법을 설명합니다. 마우스 중격 동맥은 다른 동적으로 측정된 일정한 흐름 또는 압력에서 수중 및 퍼플레이션됩니다. 형광으로 표시된 렉틴(예: 알렉사 플루어-488 또는 -633개의 밀-세균 아글루티닌, WGA)을 배설한 후, 오른쪽 심실 포세혈관 근육과 중격의 동맥 및 모세혈관(및 기타 혈관)을 용이하게 이미지화할 수 있다. 혈관 직경 의 변화는 심장 수축의 존재 또는 부재에서 측정 될 수있다. 유전적으로 인코딩된 형광 단백질이 발현되었을 때, 특정 특징은 모니터링될 수 있었습니다. 예를 들어, pericytesNG2-DsRed를 표현 마우스 심혼에 시각화되었습니다. 이 방법은 심장에 있는 모세관 pericytes의 생리적 기능을 연구하는 유용한 플랫폼을 제공했습니다. 또한 혈관/모세관 직경과 동맥 발광 압력을 동시에 측정하여 심장의 혈류에 대한 시약의 효과를 연구하는 데 적합합니다. 이 준비는 최첨단 광학 이미징 시스템과 결합되어 거의 생리적 조건하에서 심장의 세포 및 분자 수준에서 혈류량과 제어를 연구할 수 있습니다.

서문

적절한 관상 동맥 압력 -유동 조절은 신진 대사 요구를 충족하기 위해 심장에 충분한 혈액 공급을 보장^1. 그러나, 그것은 단지 최근에 관상 동맥 압력 흐름은 지난 수십 년 동안 생체 내 및 체외에서 수행 된 광범위한 연구에도 불구하고, 심장에서 동적으로 조절되는 방법을 분명하게되고있다. 그 이유 중 하나는 심장의 지속적인 박동으로 인해 이러한 연구를 위한 생리적 작업 모델을 확립하는 데 어려움이 있기 때문입니다. 에 관계없이, 살아있는 조직 또는 동물에서 관상 동맥 마이크로 선박의 관찰을 위해 다양한 방법이 확립되었지만, 이러한 방법 중 어느 것도 동시에 압력, 유량 및 미세 혈관 직경의 일정한 / 안정적인 초점 과 측정을 달성 할 수 없었다^2,3. 박동 심혼에 관상 동맥 마이크로 혈관의 직접적인 시각화는 수십 년 전^4,3,그러나 작은 선박의 직경 측정이 도전적이었고 마이크로 순환과 관련된 많은 특수 세포 유형의 특정 기능이 균등하게 골치 아픈 것이었습니다. 스트로보스코픽 방법과 부동 목표 시스템조차도 위의 정보를 동시에 제공할 수 없다^5. 그럼에도 불구하고, 관상 동맥^혈류6의 조절에 관하여 더 많은 것을 이해하는 것을 도운 전술한 기술을 사용하여 귀중한 정보의 상당량이 얻어졌습니다. 이 논문에서 설명하는 방법은 관상 동맥, 동맥 및 미세 혈관의 구성 요소가 자극 및 대사 요구에 다르게 반응하는 방법을 자세히 조사하고 이해하는 데 도움이 됩니다.

이러한 연구를 추진하기 위해 우리가 설립한 작업 모델은 Westerhof 외^2의이전 작품에 내장되었습니다. 마우스 심장의 중격 동맥의 캐넌트에 이어, 생리식염수 용액은 심근세포와 심장 조직의 다른 성분을 영양화하기 위해 동맥을 인퓨전하는 데 사용되었습니다. 동맥 관류 압력, 유동 및 혈관 직경은 적절한 형광 지표를 사용하여 다른 생리적 기능 중에서 모니터링되었다. 이 방법을 사용하면 살아있는 조직에서 생리적 압력하에서 관상 동맥 미세 혈관 침대를 시각화하고 처음으로 미세 순환 조절의 기본 세포 메커니즘을 연구 할 수 있습니다.

프로토콜

모든 동물 관리는 메릴랜드 볼티모어 대학과 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인 프로토콜의 지침에 따라했다.

1. 솔루션 준비

참고: 솔루션을 미리 준비합니다. 두 가지 유형의 기본 솔루션이 실험에 사용됩니다: (1) 목욕 상복부에 대한 생리식염수 용액(PSS)과 (2) 루멘 난투에 대한 타이로드의 솔루션. PSS의 pH를 유지하기 위해서는 CO_2를 사용하여 연속 버블링이 필요합니다. HEPES 버퍼티로드의 용액은 기포가 내피 세포^7을 손상시키고 흐름을 폐색하기 때문에 PSS 대신 루멘에서 사용됩니다.

1. PSS 솔루션: 표 1에서PSS 솔루션의 수식 및 구성을 참조하십시오. Ca²⁺-무료 및 포도당 없는 PSS 재고 솔루션의 10 L을 만들고 실온에서 보관하십시오. 1h 는 어떤 절차 전에, 5% CO₂ (74% N 2 및 21% O_2)로 스톡 용액의 1 L을 꺼내용 용액의 pH를 ~7.4로 유지한다. 포도당 1.8g과 1.8mL CaCl₂ (1M 스톡)^8을추가하십시오.
   참고: pH가 ~7.4일 때만 부글부글 질한 후에만 Ca^2+를 추가하면 Ca^2+가 침전됩니다.
2. Tyrode의 솔루션: 표 1에서Tyrode 솔루션의 수식 및 구성을 참조하십시오. 용액(0.22 μm)을 걸이면 향후 사용^9를위해 4°C에 저장된다.
3. BDM (2,3-부탄네디온 단음법)을 가진 Tyrode의 용액: 근구 세포의 수축을 방지하기 위해 가역적 인 myofilament 억제제로 BDM을^{추가합니다(10)} 무게 600 mg BDM 과 에 추가 200 Tyrode의 솔루션의 mL. 완전히 용해될 때까지 BDM으로 솔루션을 저어줍니다. 더 이상 여과가 필요하지 않습니다.
4. BDM을 포함하는 Tyrode의 용액을 4°C에 저장하여 향후 사용을 위해 사용합니다.

2. 챔버 준비

1. 제조업체가 제공한 지침에 따라 폴리디메틸실록산(PDMS)으로 해부 챔버와 실험 챔버를 미리 코팅합니다.
2. BDM이 포함된 Tyrode의 용액으로 해부 챔버를 채웁니다.
3. 시술 전에 냉각기 1h를 켭니다. 온도를 4°C로 설정합니다.

3. 캐뉼라 준비

1. 마이크로파이펫 풀러를 켭니다. 제조업체의 지침에 따라 설정을 선택합니다.
2. 깨끗한 borosilicate 유리 튜브를 가져 가라 (사용되는 유리 튜브의 외부 및 내경은 각각 1.2mm와 0.69 mm이었다).
3. U자형 플래티넘 가열 필라멘트가 있는 Sutter 파이펫 풀러의 홈 클램프에 유리 튜브를 삽입합니다.
4. 풀러를 활성화하여 긴 얇은 팁으로 각각 두 개의 캐뉼러를 생성합니다.
5. 각 캐뉼라의 끝을 해부 현미경으로 미세한 한 쌍의 가위를 사용하여 팁의 최종 직경을 100~ 150 μm 정도만 자른다.
6. 발사는 날카로운 가장자리를 약간 둥글게 절단 캐뉼라의 끝을 연마.
7. 끝에서 약 2mm 떨어진 샤프트 측면에 위치한 플래티넘 와이어(미세 제어로 가열)를 사용하여 샤프트를 따라 캐뉼라를 구부립니다. 캐뉼라의 굽힘의 각도는 약 45 °여야합니다.
8. 압력 근사 챔버의 홀더에 캐뉼라의 열린 끝을 삽입하고 피팅을 조입니다. 티로드의 솔루션으로 채워진 5mL 주사기를 피팅의 반대편에 연결합니다. 챔버에 장착된 미세 조작기에 캐뉼라를 연결합니다(그림 1 및 도 2참조).
9. 주사기(5mL)를 사용하여 티로드의 용액으로 캐뉼라를 채우고, 그것을 플러시하고, 기포의 튜브 와 커넥터를 세척합니다.
10. 캐뉼레이션 절차 전에, 주어진 흐름 범위(50 내지 300 μL/min, 그림 3)에걸쳐 캐뉼라 내부의 관류 압력을 측정합니다. 새 캐뉼라를 사용할 때만 그렇게 하십시오.
    참고: 캐뉼라 내부의 관류 압력은 흐름에 비례하며 선형장착(도 3).

4. 마우스 심장 추출

1. 이소플루란과 산소의 탱크에 연결된 마취 상자에 C57BL/6 마우스(성관계, 8-16주 이전)를 넣습니다.
2. 산소 탱크를 켜고 이소플루란의 흐름을 시작합니다. 마우스가 완전히 마취 될 때까지 ~ 5 분 기다립니다.
3. 마취가 확립된 후, 마취 상자에서 마우스를 꺼내 헤파린 IP(복막 구멍, 360단위, 0.5mL/마우스)를 주입하여 혈관에서 혈전 형성을 피하십시오. 그런 다음 마우스를 마취 상자에 다시 넣습니다.
4. 헤파린을 주입한 후 10분 후, 마우스를 supine 자세로 가열된 침대로 옮기고 라벨링 테이프를 사용하여 발을 안정시합니다. 코 콘을 사용하여 이소플루란으로 마우스를 가득 차게 하십시오.
5. 마우스의 복부 피부를 집게로 다이어프램 위에 들어 올리고 수술 용 가위를 사용하여 다이어프램을 자르고 노출시합니다.
6. 다이어프램과 흉골을 잘라냅니다. 가슴을 엽니다.
7. 흉부 구멍에서 심장을 해부하고 등쪽 흉부 벽에 가능한 한 가깝게 절단합니다.
8. 30mM BDM이 들어 있는 얼음차가운 Tyrode의 용액에 하트를 넣습니다.
9. 폐와 같은 결합 조직을 제거하기 위해 심장을 청소하십시오.
10. 30mM BDM이 들어있는 Tyrode의 용액으로 채워진 미리 차가운 해부 챔버로 심장을 옮춥니다.

5. 중격 동맥의 준비 및 캐누레이션

1. 서보 펌프를 켭니다. 서보 펌프를 "흐름" 모드로 설정합니다. 튜브가 혈관 루멘을 견딜 수있는 Tyrode의 솔루션으로 채워질 때까지 고속으로 실행하십시오. 튜브에 거품이 없는지 확인하십시오. 그런 다음 속도를 낮춥춥습니다.
2. 심장을 PDMS에 고정하여 심장의 중간 부위에 손상을 피하십시오.
3. 오른쪽과 왼쪽 아리아를 모두 제거합니다. 오른쪽 심실을 열고 해부 현미경을 사용하여 오른쪽 심실 무료 벽을 제거합니다.
4. 중격 동맥을 노출하고 식별합니다. 격막 동맥 아래에 나일론 실(직경 30μm)을 놓고 향후 사용을 위해 느슨한 매듭을 묶습니다.
   참고: 중격 동맥은 해부 현미경을 사용하여 쉽게 식별 할 수 있습니다. 중격 동맥은 대부분의 경우 오른쪽 관상 동맥에서 유래 중격에 주요 동맥입니다.
5. 미세 한 가위를 사용하여 왼쪽 심실 무료 벽을 제거합니다.
6. 캐뉼라가 배치된 실험 챔버로 유두 근육 제제를 옮김. 챔버는 BDM을 포함하는 Tyrode의 솔루션으로 채워져 있습니다. 이 챔버의 바닥은 PDMS의 얇은 (~2mm) 층으로 코팅됩니다.
7. 캐뉼라의 위치를 조정 (마이크로 조작기를 사용하여) 중격 동맥의 캐뉼레이션을 가능하게. 매듭을 조입니다.
8. 현미경 목표가 혈관의 명확한 보기를 가지고 있도록 챔버 바닥에 작은 핀을 사용하여 유두 근육을 확보. 캐뉼라의 각도와 위치에 주의를 기울이고 캐뉼라 끝이 동맥 벽에 평행하게 되어 있는지 확인하십시오.
9. 주사기에서 캐뉼라를 통해 용액을 점진적으로 추방하여 캐뉼레이션을 테스트합니다. 모든 요소가 제대로 작동하는 경우, 유두 근육의 잔류 혈액은이 과정의 시작 부분에 조직을 종료하고 티로드의 용액은 나중에 볼 수 있습니다.

6. 준비의 안정화

1. 슈퍼퓨전 용액을 제공하는 연동 펌프를 켭니다. 그런 다음 3-4 mL /분의 속도로 사전 가스 PSS로 목욕 준비를 지속적으로 압도합니다.
2. 슈퍼퓨전 용액의 온도 컨트롤러를 켭니다. 욕조의 온도를 ~35-37°C로 조정합니다.
3. 서보 펌프에 캐뉼라를 연결합니다. 압력 서보 컨트롤러에 표시되는 압력을 읽어보십시오.
4. 흐름과 압력을 모니터링합니다. 유동(μL/min) 및 동맥 관류 압력(mm Hg)은 디지털화되어 관련소프트웨어(그림 2)를사용하여 기록된다.
5. 흐름을 조정하여 압력을 ~10mmHg로 설정하고 ~10분 동안 실행합니다.
6. 동맥의 압력을 만들기 위해 발광 용액의 흐름을 증가 ~ 60 mmHg. 캐뉼라의 압력 강하를 빼서 동맥 자체의 최종 관류 압력을얻는다(도 3).
   참고: 압력 서보 컨트롤러의 "압력" 모드를 선택하면 이러한 실험에 대해 발광 압력이 ~60mmHg로 설정됩니다. 그런 다음 흐름의 변화를 모니터링합니다.
7. 유량 및/또는 압력 수준을 모니터링하여 샘플이 ~30-60분 동안 안정화하도록 합니다. 동맥 압력의 점진적인 증가는 일반적으로 수분 후에 관류의 시작 부분에서 관찰됩니다. 새로운 정상 상태는 약 30 분(그림 4)에서자체적으로 확립됩니다.
8. 관류 압력이 안정화된 후(일정한 흐름에서) 실험을 시작합니다.

7. 형광 태그밀-세균 아글루티닌 (WGA)으로 준비를 로드

1. 100μg의 WGA를 티로드 솔루션 5mL에 추가하여 알렉사 플루오르-488을 포함하는 Tyrode의 솔루션을 준비하십시오.
2. 퍼퓨전을 일반 Tyrode의 용액에서 형광 태그WGA를 포함하는 것으로 조심스럽게 전환합니다. 거품이 도입되지 않도록 난파를 조심스럽게 전환하는 것이 중요합니다.
3. WGA 관류의 ~30분 후 또는 WGA 용액이 다 소진되려고 할 때, 퍼서스래스를 다시 일반 티로드의 용액으로 변경합니다.

8. 동맥과 모세 혈관의 공초점 이미징

1. Nipkow 디스크 공초점 현미경 시스템을 켭니다.
2. 현미경을 사용하여 송신광 모드에서 저전력 목표(4x)를 사용하여 중격 동맥을 찾습니다.
   참고: 세막 동맥은 캐뉼라의 위치를 따라 위치할 수 있습니다.
3. 회전 디스크 공초점으로 공초점 이미징을 시작하고 488 nm 흥분 레이저, 40배 목표 배율 및 레이저 강도 및 샘플링 속도 조정(이미지 당 10 ~500ms)을 선택합니다.
4. 공초점 현미경에 대한 상부 및 하단 이미징 위치를 설정하여 이미징 범위를 정의하고 z 스택 이미징의 매개 변수를 입력합니다.
5. 사용 중인 시스템에 권장되는 단계 크기를 설정하거나 원하는 대로 단계 크기를 설정합니다.
6. z 스택 설정 및/또는 타임시리즈 설정을 선택합니다.
7. 새 이미지를 저장하도록 새 폴더를 선택하거나 설정합니다.
8. "실행"을클릭하여 향후 분석을 위한 이미징 녹화를 시작합니다(그림5).

9. 예예 혈관 확장제 실험: 핀산틸리닐 유도 혈관 확장(비디오 1).

1. 핀산산실 스톡 용액(DMSO 100mM)을 준비하고 4°C에 보관하십시오.
2. 티로드의 솔루션 10mL를 준비합니다. 핀산틸 스톡 용액 10μL을 추가하여 핀산틸100 μM의 최종 농도를 확인합니다.
3. 중격 동맥및 분기 동맥을 포함하는 낮은 배율 (4 배 목표)에서 유두 근육을 이미지.
4. 발광 용액을 핀산탈틸 함유 솔루션으로 전환합니다.

10. 예용혈 조절 실험: 혈관 수축기 유도 동맥 관류 압력 증가 일정한 흐름(그림 6)

1. 내피-1(ET-1) 스톡 용액(10 μM)을 준비하고 -20°C에 보관한다.
2. 티로드의 솔루션 10mL를 준비합니다. ET-1 스톡 용액(10μM)의 10μL을 추가하여 ET-1 10 nM의 최종 농도를 확인합니다.
3. 일정한 흐름으로 발광 압력을 기록하고 유두 근육을 이미지합니다.
4. 발광 솔루션을 ET-1 함유 솔루션으로 전환합니다.

11. 회신구가 있는 모세관의 예 이미지(그림 7)

1. 이 프로토콜의 섹션 4에 설명된 대로 NG2DredBAC 형질 전환 마우스를 희생한다.
2. 심장을 추출하고, 중격 동맥을 캐너리및 프로토콜 5-7 다음 의정서 5-7 다음 알렉사 플루오르-488 컨쥬게이드 WGA로 샘플을로드합니다.
3. 공초점을 사용하여 488 nm 및 560 nm 암과 510-525 nm, 575-625 nm 방출에서 유두 근육을 이미지합니다. 동맥 압력은 약 40 mmHg가 될 것입니다.

결과

형광 혈관 마커가 혈관 루멘(여기 WGA가 알렉사 플루오르-488과 결합됨)에 침투하면 고속 공초점 현미경을 사용하여 도 5(왼쪽 패널)에 도시된 바와 같이 전체 혈관 나무를 시각화할 수 있다. 추가 배율은 모세관의 이미징을 자세하게 가능하게한다(도 5,오른쪽 패널). 가압 시스템은 발광 압의 지속적인 모니터링을 지원하기 때문에,이 준비는 동맥 압력과 ...

토론

본 연구에서는 생리적 조건 하에서 심장에서 관상 동맥 미세 순환을 연구하기 위해 매우 간단하면서도 매우 실용적인 전 생체 내 방법을 도입했습니다. 이 방법은 쥐^2를사용하여 기계적 조사에서 수정되었다. 도전적인 추가는 고속 및 고광학 해상도를 가진 이미징 기술이었습니다. 따라서 우리는 현재 상용화된 고급 광학 이미징 시스템을 활용할 수 있었습니다. 유두 근육의 기?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M CaCl2 solution	MilliporeSigma, USA	21115
1 M MgCl2 solution	MilliporeSigma, USA	M1028
AxoScope software	Molecular Devices, San Jose, CA, USA
Chiller/water incubator	FisherScientific, USA	Isotemp 3016S
Confocal	Nikon Instruments, USA	A1R
Custom glass tubing	Drummond Scientific Company	9-000-3301
Digidata 1322A	Molecular Devices, San Jose, CA, USA
Dissecting microscope	Olympus, Japan	SZX12
Endothelin-1	MilliporeSigma, USA	E7764
Forceps	Fine Scientific Tools	11295-51
Heparin Sodium Salt	Sigma-Aldrich, USA	H3393
Inline solution Heater	Warner Istruments, Hamden, CT, USA	SH-27B
Isoflurane	VETone, Idaho, USA	502017
Micropipette puller	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97
Micropipette/cannula holder	Warner Istruments, Hamden, CT, USA	64-0981
NG2DsRedBAC transgenic mouse	The Jackson Laboratory	#008241
Nylon thread for tying blood vessels	Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA	THR-G
PDMS (polydimethylsiloxane)	SYLGARD, Germantown, WI, USA	184 SIL ELAST KIT
Peristaltic pump	Gilson, Middleton, WI, USA	minipuls 3
Pressure Servo Controller	Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA	PS-200-S
Scissors	Fine Scientific Tools, Foster City, CA, USA	15000-10
Servo Pump	Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA	PS-200-P
Temperature controller	Warner Instruments, Hamden, CT, USA	TC-324B
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA USA	W11261