Mesure dynamique et imagerie des capillaires, artérioles et péricytes dans le cœur de souris

Résumé

Présenté ici est un protocole pour étudier la microcirculation coronaire dans le tissu cardiaque murin vivant par la surveillance ex vivo de la pression artérielle de perfusion et le flux qui maintient la pression, ainsi que les composants vasculaires de l’arbre, y compris les lits capillaires et péricytes, que l’artère septale est cannulée et pressurisée.

Résumé

Le tonus coronaire avec l’ouverture ou la fermeture des capillaires déterminent en grande partie le flux sanguin vers les cardiomyocytes à la pression constante de perfusion. Cependant, il est difficile de surveiller les changements dynamiques des artérioles coronaires et des capillaires dans tout le cœur, principalement en raison de son mouvement et de ses battements non-stop. Ici, nous décrivons une méthode qui permet de surveiller le taux de perfusion artérielle, la pression et les changements de diamètre des artérioles et capillaires dans les muscles papillaires ventriculaires droit de la souris. L’artère septale de la souris est cannulée et perfusée à un débit ou une pression constant avec l’autre mesurée dynamiquement. Après perfusion avec une lectine étiquetée fluorescente (p. ex., Alexa Fluor-488 ou -633 étiquetée Wheat-Germ Agglutinin, WGA), les artérioles et capillaires (et autres vaisseaux) du muscle papillaire et du septum du ventricule droit pouvaient être facilement imités. Les changements de diamètre du vaisseau pourraient alors être mesurés en présence ou en absence de contractions cardiaques. Lorsque des protéines fluorescentes génétiquement codées ont été exprimées, des caractéristiques spécifiques ont pu être surveillées. Par exemple, les péricytes ont été visualisés dans des cœurs de souris qui exprimaient NG2-DsRed. Cette méthode a fourni une plate-forme utile pour étudier les fonctions physiologiques des péricytes capillaires dans le cœur. Il convient également à l’étude de l’effet des réhésifs sur le flux sanguin dans le cœur en mesurant simultanément le diamètre vasculaire/capillaire et la pression luminaire artérielle. Cette préparation, combinée à un système d’imagerie optique à la fine pointe de la technologie, permet d’étudier le flux sanguin et son contrôle au niveau cellulaire et moléculaire dans le cœur dans des conditions quasi physiologiques.

Introduction

Une régulation appropriée du débit de pression coronaire assure un approvisionnement suffisant en sang au cœur pour répondre à ses exigences métaboliques¹. Cependant, il n’est devenu clair que récemment comment le flux de pression coronaire est dynamiquement régulé dans le cœur, malgré des études approfondies qui ont été effectuées in vivo et in vitro au cours des dernières décennies. L’une des raisons est la difficulté d’établir un modèle de travail physiologique pour de telles études en raison du battement constant du cœur. Quoi qu’il en soit, une variété de méthodes ont été établies pour l’observation des micro-vaisseaux coronaires dans les tissus vivants ou les animaux, mais aucune de ces méthodes n’a été en mesure d’atteindre une concentration constante / stable et les mesures de la pression, le débit et le diamètre microvasculaire en^{même temps 2,3}. La visualisation directe des micro-vaisseaux artériaux coronaires dans le cœur battant a été introduite il^{y a des décennies 4,3}, mais les mesures de diamètre dans les petits vaisseaux étaient difficiles et les fonctions spécifiques des nombreux types de cellules spécialisées associées à la microcirculation étaient tout aussi vexante. Même la méthode stroboscopique et le système d’objectif flottant ne pouvaient pas fournir les informations ci-dessus simultanément⁵. Néanmoins, une quantité importante d’informations précieuses a été obtenue en utilisant les technologies susmentionnées, qui nous ont aidés à mieux comprendre la régulation du flux sanguin coronaire⁶. La méthode que nous décrivons dans cet article aidera à étudier et à comprendre en détail comment les composants des artères coronaires, les artérioles et la microvasculature réagissent différemment aux stimulations et aux demandes métaboliques.

Le modèle de travail que nous avons établi pour poursuivre ces études a été construit sur les travaux antérieurs de Westerhof et coll.². Après cannulation de l’artère septale du coeur de souris, la solution saline physiologique a été employée pour parcourir cette artère pour maintenir les myocytes et d’autres composants du tissu cardiaque nourris. La pression artérielle de perfusion, le flux et le diamètre vasculaire ont été surveillés parmi d’autres fonctions physiologiques utilisant des indicateurs fluorescents appropriés. Cette méthode nous permet de visualiser le lit microvasculaire coronaire sous pression physiologique dans les tissus vivants et d’étudier pour la première fois les mécanismes cellulaires sous-jacents à la régulation de la microcirculation.

Protocole

Tous les soins aux animaux étaient conformes aux lignes directrices de l’Université du Maryland à Baltimore et le Comité institutionnelles de soins et d’utilisation des animaux a approuvé des protocoles.

1. Préparation des solutions

REMARQUE : Préparez des solutions à l’avance. Deux types de solutions de base sont utilisés dans les expériences : (1) les solutions salines physiologiques (PSS) pour le superfusate de bain et (2) les solutions tyrode pour le lumen perfusate. Un bouillonnement continu de CO₂ est nécessaire pour maintenir le pH du PSS. La solution tyrode tamponnée par HEPES est utilisée dans le lumen au lieu de PSS pour éviter que des bulles n’entrent dans les vaisseaux, puisque les bulles endommageraient les cellules endothéliales⁷ et occlusent le flux.

1. Solution PSS : Voir la formule et la composition de la solution PSS dans le tableau 1. Faire 10 L de Ca²⁺sans glucose et sans glucose PSS solution de stock et stocker à température ambiante. 1 h avant toute procédure, sortir 1 L de la solution stock et bulle avec 5% de CO₂ (74% N₂ et 21% O₂) pour garder le pH de solution à ~ 7,4. Ajouter 1,8 g de glucose et 1,8 mL de CaCl₂ (1 M de bouillon)⁸.
   REMARQUE : Ajoutez Ca^{2+ seulement} après avoir bouillonné lorsque le pH est ~7.4, sinon, Ca²⁺ sera précipité.
2. La solution de Tyrode : Voir la formule et la composition de la solution tyrode dans le tableau 1. Filtrer la solution (0,22 μm) et la stocker à 4 °C pour une utilisation future⁹.
3. Solution de Tyrode avec BDM (monoxime 2,3-Butanedione): Ajouter BDM comme inhibiteur réversible de myofilament pour empêcher la contraction des myocytes¹⁰. Pesez 600 mg BDM et ajoutez à 200 mL la solution de Tyrode. Remuer la solution avec BDM jusqu’à ce qu’elle soit complètement dissoute. Aucune autre filtration n’est requise.
4. Conservez la solution tyrode contenant du BDM à 4 °C pour une utilisation future.

2. Préparation de chambre

1. Enduire à l’avance la chambre de dissectation et la chambre expérimentale de polydimethylsiloxane (PDMS) selon les instructions fournies par le fabricant.
2. Remplissez la chambre de dissecting avec la solution tyrode contenant BDM.
3. Allumez le refroidisseur 1 h avant l’intervention. Réglez la température à 4 °C.

3. Préparation à la canule

1. Allumez le puller micropipette. Sélectionnez les paramètres selon les instructions du fabricant.
2. Prenez un tube de verre borosilicate propre (le diamètre extérieur et intérieur des tubes de verre utilisés était de 1,2 mm et 0,69 mm respectivement).
3. Insérez un tube de verre dans les pinces rainurées d’un puller pipette Sutter avec un filament chauffant en forme de U.
4. Activez le tireur pour produire deux canules, chacune avec une longue pointe mince.
5. Couper la pointe de chaque canule à l’aide d’une fine paire de ciseaux sous un microscope disséquant pour faire le diamètre final de la pointe autour de 100 à 150 μm.
6. Le feu polit la pointe de la canule coupée pour arrondir légèrement les bords tranchants.
7. Plier la canule le long de l’arbre à l’aide d’un fil de platine (chauffé avec un contrôle fin) placé sur le côté de l’arbre à environ 2 mm de la pointe. L’angle de la courbure dans la canule doit être d’environ 45°.
8. Insérez l’extrémité ouverte de la canule dans le support de la chambre myographique sous pression et serrez le raccord. Connectez une seringue de 5 mL remplie de la solution tyrode de l’autre côté du raccord. Connectez la canule à un micromanipulateur monté sur la chambre (voir figure 1 et figure 2).
9. Remplissez la canule de la solution tyrode à l’aide de la seringue (5 mL), en la rinçant, le tube et le connecteur des bulles d’air.
10. Avant la procédure de cannulation, mesurer la pression de perfusion à l’intérieur de la canule sur une plage donnée de débit (50 à 300 μL/min, figure 3). Ne le faites que lorsqu’une nouvelle canule est utilisée.
    REMARQUE : La pression de perfusion à l’intérieur de la canule est proportionnelle au débit et est linéaire (Figure 3).

4. Extraction du coeur de souris

1. Mettez une souris C57BL/6 (sexe, 8-16 semaines) dans la boîte d’anesthésie qui est reliée aux réservoirs d’isoflurane et d’oxygène.
2. Allumez le réservoir d’oxygène et commencez le flux d’isoflurane. Attendez ~5 min jusqu’à ce que la souris soit entièrement anesthésiée.
3. Une fois l’anesthésie établie, sortez la souris de la boîte d’anesthésie et injectez de l’héparine IP (dans la cavité péritonéale, 360 unités, 0,5 mL/souris) pour éviter la formation de caillots sanguins dans la vascularisation. Ensuite, remettre la souris dans la boîte d’anesthésie.
4. 10 min après l’injection de l’héparine, déplacez la souris vers le lit chauffé en position supinée et stabilisez ses pattes à l’aide de ruban adhésif. Gardez la souris sous anesthésie complète avec de l’isoflurane à l’aide d’un cône nasal.
5. Soulevez la peau abdominale de la souris au-dessus du diaphragme avec des forceps et utilisez des ciseaux chirurgicaux pour couper et exposer le diaphragme.
6. Couper le diaphragme et le sternum. Ouvrez la poitrine.
7. Disséquer le cœur de la cavité thoracique, en coupant le plus près possible de la paroi thoracique dorsale.
8. Placez le cœur dans la solution glacée tyrode contenant 30 mM BDM.
9. Nettoyez le cœur pour enlever les tissus conjonctifs tels que les poumons.
10. Transférer le cœur dans la chambre de dissecting pré-refroidie remplie de la solution de Tyrode contenant 30 mM BDM.

5. Préparation et cannulation de l’artère septale

1. Allumez la pompe servo. Réglez la pompe servo en mode « flow ». Laissez-le fonctionner à grande vitesse jusqu’à ce que le tube soit rempli de la solution tyrode qui sera utilisée pour imprèder le lumen vasculaire. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles dans le tube. Ensuite, baissez la vitesse.
2. Épinglez le cœur sur le PDMS, en évitant tout dommage à la zone centrale du cœur.
3. Retirez les airs droit et gauche. Coupez le ventricule droit et retirez le mur libre ventriculaire droit à l’aide d’un microscope disséquant.
4. Exposer et identifier l’artère septale. Placez un fil de nylon (30 μm de diamètre) sous l’artère septale et attachez un nœud lâche pour une utilisation future.
   REMARQUE : L’artère septale peut être facilement identifiée à l’aide d’un microscope disséquant. L’artère septale est une artère principale sur le septum provenant de l’artère coronaire droite dans la plupart des cas.
5. Retirer le mur libre ventriculaire gauche à l’aide de ciseaux fins.
6. Transférer la préparation musculaire papillaire dans la chambre expérimentale dans laquelle la canule a été positionnée. La chambre est remplie de la solution de Tyrode contenant BDM. Le fond de cette chambre est recouvert d’une fine couche (~2 mm) de PDMS.
7. Ajuster la position de la canule (à l’aide du micromanipulateur) pour permettre la cannulation de l’artère septale. Serrez le nœud.
8. Fixez le muscle papillaire à l’aide de petites broches au plancher de la chambre afin que l’objectif du microscope ait une vue claire de la vascularisation. Faites attention à l’angle et à la position de la canule et assurez-vous que la pointe de la canule est parallèle à la paroi artérielle.
9. Testez la cannulation en expulsant progressivement la solution de la seringue à travers la canule. Si tous les éléments fonctionnent correctement, le sang résiduel dans le muscle papillaire quittera le tissu au début de ce processus et seule la solution de Tyrode sera vue plus tard.

6. Stabilisation de la préparation

1. Allumez la pompe périssaliste qui fournira la solution de superfusion. Puis constamment surfucer la préparation dans le bain avec PSS pré-gazé à la vitesse de 3-4 mL/min.
2. Allumez le contrôleur de température pour la solution de superfusion. Réglez la température du superfusate de bain à ~35-37 °C.
3. Connectez la canule à la pompe servo. Lisez la pression affichée sur le contrôleur servo de pression.
4. Surveillez le débit et la pression. Le débit (μL/min) et la pression artérielle de perfusion (mm Hg) sont numérisés à l’aide d’un numériseur et enregistrés à l’aide d’un logiciel associé (figure 2).
5. Réglez le flux pour régler la pression ~ 10 mmHg et laissez-le fonctionner pendant ~ 10 min.
6. Augmenter le débit de la solution luminaire pour faire la pression de l’artère ~ 60 mmHg. Obtenez la pression finale de perfusion de l’artériole elle-même en soustrayant la baisse de pression de la canule (Figure 3).
   REMARQUE : Si le mode « pression » sur le contrôleur servo de pression est sélectionné, la pression luminale est réglée ~60 mmHg pour ces expériences. Ensuite, surveillez le changement du flux.
7. Laissez l’échantillon se stabiliser pendant ~30-60 min en surveillant le débit et/ou les niveaux de pression. Une augmentation progressive de la pression artérielle est normalement observée au début de la perfusion après cannulation. Un nouvel état stable sera établi par lui-même en environ 30 min (Figure 4).
8. Lancez une expérience après la stabilisation de la pression de perfusion (à débit constant).

7. Chargement de la préparation avec de l’agglutinine de blé-germe étiquetée fluorescente (WGA)

1. Préparez la solution de Tyrode contenant alexa-fluor-488 conjugué WGA en ajoutant 100 μg de WGA conjugué dans 5 mL de la solution de Tyrode.
2. Passez soigneusement du perfusate de la solution normale de Tyrode à une solution contenant wga étiquetée fluorescente. Il est important de changer soigneusement le perfusate afin qu’aucune bulle ne soit introduite.
3. Après ~30 min de perfusion WGA ou lorsque la solution WGA est sur le point de s’épuiser, changez le perfusate pour revenir à la solution normale de Tyrode.

8. Imagerie confocale d’artérioles et capillaires

1. Allumez le système de microscope confocal à disque Nipkow.
2. Utilisez le microscope pour localiser l’artère septale à l’aide d’un objectif de faible puissance (4x) en mode lumière transmise.
   REMARQUE : L’artère septale peut être située en suivant la position de la canule.
3. Commencez l’imagerie confocale avec le disque rotatif confocal et choisissez 488 nm excitation laser, grossissement objectif 40x et ajuster l’intensité laser et le taux d’échantillonnage (10 - 500 ms par image).
4. Configurez des positions d’imagerie de haut en bas pour le microscope confocal afin de définir la plage d’imagerie et d’entrer les paramètres de l’imagerie z-stack.
5. Définissez la taille de l’étape comme recommandé pour le système qui est utilisé ou définissez la taille de l’étape comme vous le souhaitez.
6. Choisissez le paramètre z-stack et/ou les paramètres des séries de temps.
7. Sélectionnez ou définissez un nouveau dossier pour stocker la nouvelle image.
8. Cliquez sur "Exécuter" pour commencer à enregistrer l’imagerie pour une analyse future( Figure 5).

9. Exemple d’expérience vasodilatateur : vasodilatation induite par le pinacidil (Vidéo 1).

1. Préparer la solution de stock de pinacidil (100 mM en DMSO) et stockée à 4 °C.
2. Préparez 10 mL de solution tyrode. Ajouter 10 μL de solution de stock de pinacidil pour faire la concentration finale de pinacidil 100 μM.
3. Image du muscle papillaire à faible grossissement (objectif 4x) pour inclure l’artère septale et les artérioles de branche.
4. Passez de la solution luminaire à la solution contenant du pinacidil.

10. Exemple d’expériences de contrôle du flux sanguin : augmentation de la pression artérielle induite par vasoconstricteur à débit constant (Figure 6)

1. Préparer la solution de stock endothéline-1 (ET-1) (10 μM) et stockée à -20 °C.
2. Préparez 10 mL de solution tyrode. Ajouter 10 μL de solution de stock ET-1 (10 μM) pour faire la concentration finale d’ET-1 10 nM.
3. Enregistrez la pression luminaire avec un débit constant et imagez le muscle papillaire.
4. Passez de la solution luminaire à la solution contenant et-1.

11. Exemples d’images capillaires avec péricytes (Figure 7)

1. Sacrifier une souris transgénique NG2DsRedBAC telle que décrite dans la section 4 de ce protocole.
2. Extraire le cœur, cannuler l’artère septale et charger l’échantillon avec Alexa-Fluor-488 conjugué WGA suivant les protocoles 5-7.
3. Image du muscle papillaire à 488 nm et 560 nm excitation, et 510-525 nm, émission de 575-625 nm en utilisant confocal. La pression artériole sera d’environ 40 mmHg.

Résultats

Lorsqu’un marqueur vasculaire de fluorescence est perfusé dans le lumen vasculaire (ici WGA conjugué à Alexa Fluor-488), il est possible de visualiser des arbres vasculaires entiers comme le montre la figure 5 (panneau gauche) à l’aide d’un microscope confocal à grande vitesse. Un grossissement plus important permet l’imagerie capillaire en détail(figure 5, panneau droit). Puisque le système pressurisé prend en charge une surveillance constante d...

Discussion

Dans le présent travail, nous avons introduit une méthode ex vivo remarquablement simple mais très pratique pour étudier la microcirculation coronaire dans le cœur dans des conditions physiologiques. Cette méthode a été modifiée à partir d’investigations mécaniques à l’aide de rats². L’ajout stimulant a été la technologie d’imagerie à grande vitesse et haute résolution optique. Nous avons donc pu tirer parti des systèmes d’imagerie optique avancés qui sont maintenant di...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M CaCl2 solution	MilliporeSigma, USA	21115
1 M MgCl2 solution	MilliporeSigma, USA	M1028
AxoScope software	Molecular Devices, San Jose, CA, USA
Chiller/water incubator	FisherScientific, USA	Isotemp 3016S
Confocal	Nikon Instruments, USA	A1R
Custom glass tubing	Drummond Scientific Company	9-000-3301
Digidata 1322A	Molecular Devices, San Jose, CA, USA
Dissecting microscope	Olympus, Japan	SZX12
Endothelin-1	MilliporeSigma, USA	E7764
Forceps	Fine Scientific Tools	11295-51
Heparin Sodium Salt	Sigma-Aldrich, USA	H3393
Inline solution Heater	Warner Istruments, Hamden, CT, USA	SH-27B
Isoflurane	VETone, Idaho, USA	502017
Micropipette puller	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97
Micropipette/cannula holder	Warner Istruments, Hamden, CT, USA	64-0981
NG2DsRedBAC transgenic mouse	The Jackson Laboratory	#008241
Nylon thread for tying blood vessels	Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA	THR-G
PDMS (polydimethylsiloxane)	SYLGARD, Germantown, WI, USA	184 SIL ELAST KIT
Peristaltic pump	Gilson, Middleton, WI, USA	minipuls 3
Pressure Servo Controller	Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA	PS-200-S
Scissors	Fine Scientific Tools, Foster City, CA, USA	15000-10
Servo Pump	Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA	PS-200-P
Temperature controller	Warner Instruments, Hamden, CT, USA	TC-324B
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA USA	W11261