Medición dinámica e imagen de capilares, arterias y pericitos en el corazón del ratón

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para estudiar la microcirculación coronaria en el tejido cardíaco murino vivo mediante la monitorización ex vivo de la presión arterial perfusión y el flujo que mantiene la presión, así como componentes de árboles vasculares incluyendo los lechos capilares y pericitos, ya que la arteria septal está cánulada y presurizada.

Resumen

El tono arterial coronario junto con la apertura o cierre de los capilares determinan en gran medida el flujo sanguíneo a los cardiomiocitos a presión constante de perfusión. Sin embargo, es difícil monitorear los cambios dinámicos de las arterias coronarias y los capilares en todo el corazón, principalmente debido a su movimiento y latido sin parar. Aquí describimos un método que permite monitorear la tasa de perfusión arterial, la presión y los cambios de diámetro de las arterias y capilares en los músculos papilares ventriculares derecho del ratón. La arteria septal del ratón se puede acumular y perfundir a un flujo o presión constante con la otra medida dinámica. Después de perfusión con una lectina etiquetada fluorescentemente (por ejemplo, Alexa Fluor-488 o -633 etiquetada Wheat-Germ Agglutinin, WGA), las arterias y capilares (y otros vasos) en el músculo papilar ventrículo derecho y el tabique podrían ser fácilmente imaginedos. Los cambios en el diámetro de los vasos podrían medirse en presencia o ausencia de contracciones cardíacas. Cuando se expresaron proteínas fluorescentes codificadas genéticamente, se pudieron monitorear características específicas. Por ejemplo, los pericitos se visualizaron en corazones de ratón que expresaban NG2-DsRed. Este método ha proporcionado una plataforma útil para estudiar las funciones fisiológicas de los pericitos capilares en el corazón. También es adecuado para estudiar el efecto de los reactivos en el flujo sanguíneo en el corazón mediante la medición del diámetro vascular / capilar y la presión luminal arterial simultáneamente. Esta preparación, combinada con un sistema de imágenes ópticas de última generación, permite estudiar el flujo sanguíneo y su control a nivel celular y molecular en el corazón en condiciones casi fisiológicas.

Introducción

La regulación adecuada del flujo de presión coronaria asegura suficiente suministro de sangre al corazón para satisfacer sus demandas metabólicas^1. Sin embargo, recientemente ha quedado claro cómo el flujo de presión coronario está regulado dinámicamente en el corazón, a pesar de los extensos estudios que se han realizado in vivo e in vitro durante las últimas décadas. Una de las razones es la dificultad de establecer un modelo de trabajo fisiológico para este tipo de estudios debido a la latido constante del corazón. A pesar de todo, se han establecido una variedad de métodos para la observación de los micro-vasos coronarios en tejidos vivos o animales, pero ninguno de estos métodos fue capaz de lograr un enfoque constante / estable y las mediciones de la presión, flujo y diámetro microvascular al mismo tiempo^2,3. La visualización directa de micro-vasos arteriales coronarios en el corazón latiendo se introdujo hace décadas^4,3,pero las mediciones de diámetro en recipientes pequeños fue un desafío y las funciones específicas de los muchos tipos de células especializadas asociadas con la microcirculación fueron igualmente molestas. Incluso el método estroboscópico y el sistema objetivo flotante no podían proporcionar la información anterior simultáneamente⁵. No obstante, se ha obtenido una cantidad significativa de información valiosa utilizando las tecnologías antes mencionadas, que nos han ayudado a comprender más sobre la regulación del flujo sanguíneo coronario^6. El método que estamos describiendo en este artículo ayudará a investigar y entender en detalle cómo los componentes de las arterias coronarias, las arterias y la microvasculatura responden de manera diferente a las estimulaciones y demandas metabólicas.

El modelo de trabajo que establecimos para llevar a cabo estos estudios se construyó sobre el trabajo anterior de Westerhof et al.². Después de la canulación de la arteria septal del corazón del ratón, se utilizó solución salina fisiológica para perfundir esa arteria para mantener nutridos los micocitos y otros componentes del tejido cardíaco. La presión arterial por perfusión, el flujo y el diámetro vascular fueron monitoreados entre otras funciones fisiológicas utilizando indicadores fluorescentes apropiados. Este método nos permite visualizar el lecho microvascular coronario bajo presión fisiológica en el tejido vivo y estudiar por primera vez los mecanismos celulares subyacentes a la regulación de la microcirculación.

Protocolo

Todo el cuidado de los animales fue de acuerdo con las directrices de la Universidad de Maryland Baltimore y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales aprobó protocolos.

1. Preparación de las soluciones

NOTA: Preparar soluciones con antelación. Dos tipos de soluciones básicas se utilizan en los experimentos: (1) soluciones salinas fisiológicas (PSS) para superfusato de baño y (2) soluciones de Tirorode para perfusato de lúmenes. Se necesita un burbujeo continuo con CO₂ para mantener el pH de PSS. La solución de Tyrode amortiguada por HEPES se utiliza en el lúmenes en lugar de PSS para evitar que las burbujas entren en los recipientes, ya que las burbujas dañarían las células endoteliales⁷ y ocluirían el flujo.

1. Solución PSS: Consulte la fórmula y composición de la solución PSS en la Tabla 1. Haga 10 L de solución de stock PSS sin ca²⁺y sin glucosa y almacene a temperatura ambiente. 1 h antes de cualquier procedimiento, sacar 1 L de la solución de stock y burbuja con 5% CO₂ (74% N₂ y 21% O₂₎para mantener el pH de la solución en ~ 7.4. Añadir 1,8 g de glucosa y 1,8 mL CaCl₂ (1 M stock)⁸.
   NOTA: Añadir Ca^{2 +} sólo después de burbujear cuando el pH es ~ 7.4, de lo contrario, Ca^{2 +} se precipitará.
2. Solución de Tyrode: Véase la fórmula y composición de la solución del Tirol en la Tabla 1. Filtre la solución (0,22 μm) y almacene a 4 °C para su uso futuro⁹.
3. Solución de Tyrode con BDM (monoxime 2,3-Butanedione): Añadir BDM como inhibidor de miofilación reversible para prevenir la contracción de los micocitos¹⁰. Pesar 600 mg BDM y añadir a 200 mL de solución de Tirorode. Revuelva la solución con BDM hasta que se disuelva por completo. No se requiere más filtración.
4. Almacene la solución del Tyrode que contiene BDM a 4 °C para su uso futuro.

2. Preparación de la cámara

1. Cubra tanto la cámara de disección como la cámara experimental de antemano con polidimetillesiloxano (PDMS) siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante.
2. Llene la cámara de disección con la solución del Tyrode que contiene BDM.
3. Encienda el enfriador 1 h antes del procedimiento. Ajuste la temperatura a 4 °C.

3. Preparación de la cánula

1. Encienda el tirador de micropipette. Seleccione la configuración según las instrucciones del fabricante.
2. Tome un tubo de vidrio borosilicato limpio (el diámetro exterior e interior de los tubos de vidrio utilizados fue de 1,2 mm y 0,69 mm respectivamente).
3. Inserte un tubo de vidrio en las abrazaderas ranuradas de un tirador de pipeta Sutter con un filamento de calentamiento de platino en forma de U.
4. Active el tirador para producir dos cánulas, cada una con una punta delgada larga.
5. Corte la punta de cada cánula usando un par fino de tijeras bajo un microscopio diseccionador para hacer el diámetro final de la punta alrededor de 100 a 150 μm.
6. El fuego pule la punta de la cánula cortada para redondear ligeramente los bordes afilados.
7. Doble la cánula a lo largo del eje utilizando un cable de platino (calentado con control fino) colocado en el lado del eje aproximadamente 2 mm de la punta. El ángulo de la curva en la cánula debe ser de alrededor de 45°.
8. Inserte el extremo abierto de la cánula en el soporte de la cámara de miógrafo de presión y apriete el accesorio. Conecte una jeringa de 5 ml llena de la solución de Tyrode al otro lado del accesorio. Conecte la cánula a un micromanipulador montado en la cámara (consulte la Figura 1 y la Figura 2).
9. Llene la cánula con la solución de Tyrode utilizando la jeringa (5 ml), enjuagando, el tubo y el conector de burbujas de aire.
10. Antes del procedimiento de canulación, mida la presión de perfusión dentro de la cánula sobre un rango de flujo determinado (50 a 300 μL/min, Figura 3). Hazlo solo cuando se utilice una nueva cánula.
    NOTA: La presión de perfusión dentro de la cánula es proporcional al flujo y está instalada linealmente (Figura 3).

4. Extracción del corazón del ratón

1. Ponga un ratón C57BL/6 (cualquiera de los dos sexos, de 8 a 16 semanas de edad) en la caja de anestesia que está conectada a los tanques de isoflurano y oxígeno.
2. Encienda el tanque de oxígeno e inicie el flujo de isofluranos. Espere ~5 minutos hasta que el ratón esté completamente anestesiado.
3. Una vez establecida la anestesia, saque el ratón de la caja de anestesia e inyecte heparina IP (en la cavidad peritoneal, 360 unidades, 0,5 ml/ratón) para evitar la formación de coágulos sanguíneos en la vasculatura. A continuación, vuelva a colocar el ratón en la caja de anestesia.
4. 10 minutos después de inyectar la heparina, mueva el ratón a la cama calentada en posición supina y estabilice sus patas usando cinta adhesiva. Mantenga el ratón bajo anestesia completa con isoflurano usando un cono nasal.
5. Levante la piel abdominal del ratón por encima del diafragma con fórceps y use tijeras quirúrgicas para cortar y exponer el diafragma.
6. Corta el diafragma y el esternón. Abre el pecho.
7. Disecciona el corazón de la cavidad torácica, cortando lo más cerca posible de la pared torácica dorsal.
8. Coloque el corazón en la solución de Tyrode helada que contenga BDM de 30 mM.
9. Limpie el corazón para extraer los tejidos conectivos como el pulmón.
10. Transfiera el corazón a la cámara de disección preenfriada llena con la solución de Tyrode que contiene BDM de 30 mM.

5. Preparación y canulación de arteria septal

1. Encienda la bomba servo. Ajuste la bomba servo al modo de "flujo". Deje que funcione a alta velocidad hasta que el tubo esté lleno de la solución del Tyrode que se utilizará para perfundir el lúmenes vasculares. Asegúrese de que no haya burbujas en el tubo. A continuación, baje la velocidad.
2. Ancle el corazón sobre el PDMS, evitando cualquier daño a la zona media del corazón.
3. Retire las adriículas derecha e izquierda. Abra el ventrículo derecho y retire la pared libre ventricular derecha con un microscopio diseccionador.
4. Exponer e identificar la arteria septal. Coloque un hilo de nylon (30 μm de diámetro) debajo de la arteria septal y ate un nudo suelto para su uso futuro.
   NOTA: La arteria septal se puede identificar fácilmente mediante un microscopio diseccionador. La arteria septal es una arteria importante en el tabique procedente de la arteria coronaria derecha en la mayoría de los casos.
5. Retire la pared libre ventricular izquierda con tijeras finas.
6. Transfiera la preparación del músculo papilar a la cámara experimental en la que se colocó la cánula. La cámara está llena de la solución de Tyrode que contiene BDM. La parte inferior de esta cámara está recubierta con una fina capa (~2 mm) de PDMS.
7. Ajuste la posición de la cánula (utilizando el micromanipulador) para permitir la canulación de la arteria septal. Apriete el nudo.
8. Asegure el músculo papilar usando pequeños alfileres en el suelo de la cámara para que el objetivo del microscopio tenga una visión clara de la vasculatura. Preste atención al ángulo y a la posición de la cánula y asegúrese de que la punta de la cánula esté paralela a la pared arterial.
9. Pruebe la canulación expulsando gradualmente la solución de la jeringa a través de la cánula. Si todos los elementos funcionan correctamente, la sangre residual en el músculo papilar saldrá del tejido al comienzo de este proceso y sólo la solución de Tyrode se verá más adelante.

6. Estabilización de la preparación

1. Encienda la bomba peristáltica que proporcionará la solución de superfusión. A continuación, sobrefunda constantemente la preparación en el baño con PSS pre-gaseoso a razón de 3-4 mL/min.
2. Encienda el controlador de temperatura para la solución de superfusión. Ajuste la temperatura del superfusato de baño a ~35-37 °C.
3. Conecte la cánula a la servobomba. Lea la presión mostrada en el controlador de servo de presión.
4. Monitoree el flujo y la presión. El flujo (μL/min) y la presión arterial por perfusión (mm Hg) se digitalizan mediante digitalizador y se registran utilizando un software asociado (Figura 2).
5. Ajuste el flujo para ajustar la presión ~ 10 mmHg y dejar que funcione por ~ 10 min.
6. Aumente el flujo de la solución luminal para hacer la presión de la arteria ~ 60 mmHg. Obtener la presión de perfusión final de la propia arteria restando la caída de presión de la cánula (Figura 3).
   NOTA: Si se selecciona el modo de "presión" en el controlador de servo de presión, la presión luminal se establece ~60 mmHg para estos experimentos. A continuación, supervise el cambio del flujo.
7. Deje que la muestra se estabilice durante ~30-60 min monitoreando los niveles de flujo y/o presión. Normalmente se observa un aumento gradual de la presión arterial al principio de la perfusión después de la canulación. Un nuevo estado estable se establecerá por sí mismo en unos 30 minutos(Figura 4).
8. Inicie un experimento después de estabilizar la presión de perfusión (en flujo constante).

7. Carga de la preparación con agglutinina de germen de trigo etiquetada fluorescentemente (WGA)

1. Prepare la solución de Tyrode que contiene Alexa-Fluor-488 WGA conjugada añadiendo 100 μg de WGA conjugado en 5 ml de solución de Tyrode.
2. Cambie cuidadosamente el perfusato de la solución normal de Tyrode a uno que contenga WGA etiquetada fluorescentemente. Es importante cambiar cuidadosamente el perfusato para que no se introduzcan burbujas.
3. Después de ~30 min de perfusión WGA o cuando la solución WGA está a punto de agotarse, cambie el perfusato de nuevo a la solución normal de Tyrode.

8. Imágenes confocales de arterias y capilares

1. Encienda el sistema de microscopios confocales de disco Nipkow.
2. Utilice el microscopio para localizar la arteria septal utilizando un objetivo de baja potencia (4x) en modo de luz transmitida.
   NOTA: La arteria septal se puede localizar siguiendo la posición de la cánula.
3. Inicie las imágenes confocales con el disco giratorio confocal y elija el láser de excitación de 488 nm, la ampliación objetiva de 40x y ajuste la intensidad del láser y la frecuencia de muestreo (10 - 500 ms por imagen).
4. Configure las posiciones de imagen superior e inferior del microscopio confocal para definir el rango de imágenes e introduzca los parámetros de las imágenes de pila z.
5. Establezca el tamaño del paso según lo recomendado para el sistema que se está utilizando o establezca el tamaño del paso como desee.
6. Elija la configuración de la pila z y/o la configuración de la serie temporal.
7. Seleccione o establezca una nueva carpeta para almacenar la nueva imagen.
8. Haga clic en "Ejecutar" para iniciar la grabación de imágenes para su análisis futuro (Figura 5).

9. Ejemplo de experimento vasodilatador: vasodilatación inducida por pinacida (Video 1).

1. Preparar solución de pinacidil stock (100 mM en DMSO) y almacenar a 4 °C.
2. Prepare 10 ml de solución de Tirol. Añadir 10 μL de solución de pinacidil stock para hacer la concentración final de pinacidil 100 μM.
3. Imagen del músculo papilar a baja magnificación (objetivo 4x) para incluir la arteria septal y las arterias de la rama.
4. Cambie la solución luminal a la solución que contiene pinacidil.

10. Ejemplo de experimentos de control del flujo sanguíneo: aumento de la presión arterial de perfusión inducida por vasoconstrictor a flujo constante (Figura 6)

1. Preparar solución de stock de endotelina-1 (ET-1) (10 μM) y almacenarse a -20 °C.
2. Prepare 10 ml de solución de Tirol. Añadir 10 μL de solución de stock ET-1 (10 μM) para realizar la concentración final de ET-1 10 nM.
3. Graba la presión luminal con flujo constante e imagen del músculo papilar.
4. Cambie la solución luminal a la solución que contiene ET-1.

11. Ejemplos de imágenes de capilar con pericitos (Figura 7)

1. Sacrificar un ratón transgénico NG2DsRedBAC como se describe en la sección 4 de este protocolo.
2. Extraiga el corazón, cannulate la arteria septal y cargue la muestra con Alexa-Fluor-488 WGA conjugado siguiendo los protocolos 5-7.
3. Imagen del músculo papilar a 488 nm y 560 nm de excitación, y 510-525 nm, 575-625 nm de emisión utilizando confocal. La presión arterial rondará los 40 mmHg.

Resultados

Cuando un marcador vascular de fluorescencia se perfunde en lúmenes vasculares (aquí WGA conjugado con Alexa Fluor-488), es posible visualizar árboles vasculares enteros como se muestra en la Figura 5 (panel izquierdo) utilizando microscopio confocal de alta velocidad. Una mayor ampliación permite la toma de imágenes de capilar en detalle(Figura 5,Panel derecho). Dado que el sistema presurizado admite un monitoreo constante de la presión luminal, esta prep...

Discusión

En el presente trabajo, hemos introducido un método ex vivo notablemente simple pero altamente práctico para estudiar la microcirculación coronaria en el corazón en condiciones fisiológicas. Este método fue modificado a partir de investigaciones mecánicas utilizando ratas². La adición desafiante fue la tecnología de imágenes con alta velocidad y alta resolución óptica. Por lo tanto, pudimos aprovechar los avanzados sistemas de imágenes ópticas que ahora están disponibles comercialme...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M CaCl2 solution	MilliporeSigma, USA	21115
1 M MgCl2 solution	MilliporeSigma, USA	M1028
AxoScope software	Molecular Devices, San Jose, CA, USA
Chiller/water incubator	FisherScientific, USA	Isotemp 3016S
Confocal	Nikon Instruments, USA	A1R
Custom glass tubing	Drummond Scientific Company	9-000-3301
Digidata 1322A	Molecular Devices, San Jose, CA, USA
Dissecting microscope	Olympus, Japan	SZX12
Endothelin-1	MilliporeSigma, USA	E7764
Forceps	Fine Scientific Tools	11295-51
Heparin Sodium Salt	Sigma-Aldrich, USA	H3393
Inline solution Heater	Warner Istruments, Hamden, CT, USA	SH-27B
Isoflurane	VETone, Idaho, USA	502017
Micropipette puller	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97
Micropipette/cannula holder	Warner Istruments, Hamden, CT, USA	64-0981
NG2DsRedBAC transgenic mouse	The Jackson Laboratory	#008241
Nylon thread for tying blood vessels	Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA	THR-G
PDMS (polydimethylsiloxane)	SYLGARD, Germantown, WI, USA	184 SIL ELAST KIT
Peristaltic pump	Gilson, Middleton, WI, USA	minipuls 3
Pressure Servo Controller	Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA	PS-200-S
Scissors	Fine Scientific Tools, Foster City, CA, USA	15000-10
Servo Pump	Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA	PS-200-P
Temperature controller	Warner Instruments, Hamden, CT, USA	TC-324B
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA USA	W11261