Dynamische Messung und Bildgebung von Kapillaren, Arteriolen und Pericyten im Mausherz

Zusammenfassung

Präsentiert wird hier ein Protokoll zur Untersuchung der koronaren Mikrozirkulation im lebenden murinen Herzgewebe durch ex vivo-Überwachung des arteriellen Perfusionsdrucks und -flusses, der den Druck aufrechterhält, sowie gefäßvaskulärer Baumbestandteile, einschließlich der Kapillarbetten und Pericyten, da die Septalarterie kanüliert und unter Druck steht.

Zusammenfassung

Der koronare arterielle Ton sowie das Öffnen oder Schließen der Kapillaren bestimmen weitgehend den Blutfluss zu Kardiomyozyten bei konstantem Perfusionsdruck. Es ist jedoch schwierig, die dynamischen Veränderungen der koronaren Arteriolen und der Kapillaren im ganzen Herzen zu überwachen, vor allem aufgrund seiner Bewegung und non-stop schlagen. Hier beschreiben wir eine Methode, die die Überwachung der arteriellen Perfusionsrate, des Drucks und der Durchmesseränderungen der Arteriolen und Kapillaren in den rechten ventrikulären Papillarmuskeln der Maus ermöglicht. Die Mausseptalarterie wird kanüliert und bei einem konstanten Durchfluss oder Druck mit der anderen dynamisch gemessenen durchtränz. Nach Perfusion mit einem fluoreszierend gekennzeichneten Lektin (z.B. Alexa Fluor-488 oder -633 mit Weizen-Germ Agglutinin, WGA) konnten die Arteriolen und Kapillaren (und andere Gefäße) in rechten Ventrikelpapillarmuskel und Septum leicht abgebildet werden. Die Gefäßdurchmesseränderungen könnten dann in Gegenwart oder Abwesenheit von Herzkontraktionen gemessen werden. Wenn genetisch kodierte fluoreszierende Proteine exprimiert wurden, konnten bestimmte Merkmale überwacht werden. Zum Beispiel wurden Pericyte in Mausherzen visualisiert, die NG2-DsRed ausdrückten. Diese Methode hat eine nützliche Plattform zur Untersuchung der physiologischen Funktionen von kapillaren Pericyten im Herzen zur Verfügung gestellt. Es eignet sich auch zur Untersuchung der Wirkung von Reagenzien auf den Blutfluss im Herzen durch gleichzeitige Messung des Vaskulären/Kapillardurchmessers und des arteriellen Luminaldrucks. Dieses Präparat, kombiniert mit einem hochmodernen optischen Bildgebungssystem, ermöglicht es, den Blutfluss und seine Kontrolle auf zellulärer und molekularer Ebene im Herzen unter nahezu physiologischen Bedingungen zu untersuchen.

Einleitung

Eine angemessene koronare Druck-Durchfluss-Regulierung gewährleistet eine ausreichende Blutversorgung des Herzens, um seine metabolischen Anforderungen zu erfüllen¹. Allerdings ist erst vor kurzem deutlich geworden, wie der koronare Druckfluss im Herzen dynamisch reguliert wird, trotz umfangreicher Studien, die in den letzten Jahrzehnten in vivo und in vitro durchgeführt wurden. Einer der Gründe ist die Schwierigkeit, ein physiologisches Arbeitsmodell für solche Studien aufgrund des ständigen Schlagens des Herzens zu etablieren. Unabhängig davon wurden eine Vielzahl von Methoden zur Beobachtung der koronaren Mikrogefäße in lebenden Geweben oder Tieren etabliert, aber keine dieser Methoden war in der Lage, einen konstanten/stabilen Fokus und die Messungen von Druck, Durchfluss und mikrovaskulärem Durchmesser gleichzeitig zu erreichen^2,3. Die direkte Visualisierung von koronaren arteriellen Mikrogefäßen im schlagenden Herzen wurde vor Jahrzehnten eingeführt^4,3, aber die Durchmessermessungen in kleinen Gefäßen waren anspruchsvoll und die spezifischen Funktionen der vielen spezialisierten Zelltypen, die mit der Mikrozirkulation verbunden sind, waren ebenso ärgerlich. Selbst die Stroboskopmethode und das schwimmende Objektivsystem konnten die oben genannten Informationen nicht gleichzeitig liefern⁵. Nichtsdestotrotz wurde eine beträchtliche Menge wertvoller Informationen mit den oben genannten Technologien gewonnen, die uns geholfen haben, mehr über die Regulierung des koronaren Blutflusses zu verstehen⁶. Die Methode, die wir in diesem Papier beschreiben, wird einem helfen, zu untersuchen und im Detail zu verstehen, wie Komponenten der Herzkranzgefäße, der Arteriolen und der Mikrovaskulatur unterschiedlich auf Stimulationen und metabolische Anforderungen reagieren.

Das Arbeitsmodell, das wir für diese Studien etabliert haben, baute auf den früheren Arbeiten von Westerhof et al.²auf. Nach der Kanulation der Septalarterie des Mausherzes wurde eine physiologische Salzlösung verwendet, um diese Arterie zu durchdringen, um die Myozyten und andere Bestandteile des Herzgewebes zu nähren. Der arterielle Perfusionsdruck, der Durchfluss und der Gefäßdurchmesser wurden unter anderem mit hilfe geeigneter Fluoreszenzindikatoren überwacht. Diese Methode ermöglicht es uns, das koronare mikrovaskuläre Bett unter physiologischem Druck im lebenden Gewebe zu visualisieren und zum ersten Mal die zellulären Mechanismen zu untersuchen, die der Mikrozirkulationsregulation zugrunde liegen.

Protokoll

Die gesamte Tierpflege entsprach den Richtlinien der University of Maryland Baltimore und des Institutional Animal Care and Use Committee genehmigte Protokolle.

1. Vorbereitung der Lösungen

HINWEIS: Bereiten Sie Lösungen im Voraus vor. In den Experimenten werden zwei Arten von Basislösungen eingesetzt: (1) physiologische Salzlösungen (PSS) für Badsuperfusate und (2) Tyrodes Lösungen für Lumenperfusate. Kontinuierliches Blasen mit CO₂ ist erforderlich, um den pH-Wert von PSS aufrechtzuerhalten. HePES-gepufferte Tyrodes Lösung wird im Lumen anstelle von PSS verwendet, um zu vermeiden, dass Blasen in die Gefäße gelangen, da Blasen die Endothelzellen⁷ beschädigen und den Fluss ausblenden würden.

1. PSS-Lösung: Siehe Formel und Zusammensetzung der PSS-Lösung in Tabelle 1. Machen Sie 10 L ca²⁺-freie und glukosefreie PSS-Lagerlösung und lagern Sie bei Raumtemperatur. 1 h vor jedem Verfahren, nehmen Sie 1 L der Lagerlösung und Blase mit 5%_CO2 (74% N₂ und 21%_O2), um den pH-Wert der Lösung bei 7,4 zu halten. 1,8 g Glukose und 1,8 ml CaCl₂ (1 M Bestand)^{hinzufügen 8}.
   HINWEIS: Fügen Sie Ca²⁺ erst nach dem Blasen hinzu, wenn der pH-Wert 7,4 usd beträgt, andernfalls wird Ca²⁺ ausgefällt.
2. Tyrodes Lösung: Siehe Die Formel und Zusammensetzung der TyrodesLösung in Tabelle 1. Filtern Sie die Lösung (0,22 m) und lagern Sie sie bei 4 °C für die zukünftige Verwendung⁹.
3. Tyrodes Lösung mit BDM (2,3-Butanedion-Monoxim): Fügen Sie BDM als reversiblen Myofilament-Inhibitor hinzu, um die Kontraktion der Myozyten zu verhindern¹⁰. Wiegen Sie 600 mg BDM und fügen Sie die Tyrodes Lösung zu 200 ml hinzu. Rühren Sie die Lösung mit BDM, bis sie vollständig aufgelöst ist. Eine weitere Filtration ist nicht erforderlich.
4. Bewahren Sie die Tyrodes-Lösung mit BDM bei 4 °C für die zukünftige Verwendung auf.

2. Kammervorbereitung

1. Mantel sowohl Sezieren Kammer und Versuchskammer im Voraus mit Polydimethylsiloxan (PDMS) nach den Anweisungen des Herstellers.
2. Füllen Sie die Sezierkammer mit der Tyrodeslösung, die BDM enthält.
3. Schalten Sie den Kühler 1 h vor dem Eingriff ein. Stellen Sie die Temperatur auf 4 °C ein.

3. Kanülenzubereitung

1. Schalten Sie den Micropipette-Puller ein. Wählen Sie die Einstellungen gemäß den Anweisungen des Herstellers aus.
2. Nehmen Sie ein sauberes Borosilikatglasrohr (der Außen- und Innendurchmesser der verwendeten Glasrohre betrug 1,2 mm bzw. 0,69 mm).
3. Legen Sie ein Glasrohr in die Rillenklemmen eines Sutter Pipettenziehers mit einem U-förmigen Platin-Heizfilament ein.
4. Aktivieren Sie den Abzieher, um zwei Kanülen mit jeweils einer langen dünnen Spitze zu erzeugen.
5. Schneiden Sie die Spitze jeder Kanüle mit einer feinen Schere unter einem Sezieren des Mikroskops, um den endgültigen Durchmesser der Spitze um 100 bis 150 m zu machen.
6. Feuer polieren Sie die Spitze der geschnittenen Kanüle, um die scharfen Kanten leicht zu umrunden.
7. Biegen Sie die Kanüle entlang der Welle mit einem Platindraht (mit Feinsteuerung beheizt) auf der Seite der Welle etwa 2 mm von der Spitze positioniert. Der Winkel der Biegung in der Kanüle sollte um 45° betragen.
8. Setzen Sie das offene Ende der Kanüle in den Halter der Druckmyographenkammer ein und ziehen Sie die Armatur fest. Schließen Sie eine 5 ml Spritze, die mit der Tyrodes Lösung gefüllt ist, an die andere Seite des Fittings an. Schließen Sie die Kanüle an einen an der Kammer montierten Mikromanipulator an (siehe Abbildung 1 und Abbildung 2).
9. Füllen Sie die Kanüle mit Deryrodes Lösung mit der Spritze (5 ml), spülen Sie sie, den Schlauch und den Anschluss von Luftblasen.
10. Messen Sie vor dem Kanulationsverfahren den Perfusionsdruck innerhalb der Kanüle über einen bestimmten Durchflussbereich (50 bis 300 l/min, Abbildung 3). Tun Sie dies nur, wenn eine neue Kanüle verwendet wird.
    HINWEIS: Der Perfusionsdruck innerhalb der Kanüle ist proportional zum Durchfluss und ist linear montiert (Abbildung 3).

4. Extraktion des Mausherzes

1. Legen Sie eine C57BL/6 Maus (entweder Geschlecht, 8-16 Wochen alt) in die Anästhesiebox, die mit den Tanks von Isofluran und Sauerstoff verbunden ist.
2. Schalten Sie den Sauerstofftank ein und starten Sie den Fluss von Isofluran. Warten Sie 5 min, bis die Maus vollständig beästhetisiert ist.
3. Nachdem die Anästhesie festgestellt wurde, nehmen Sie die Maus aus der Anästhesiebox und injizieren Heparin IP (in die Peritonealhöhle, 360 Einheiten, 0,5 ml/Maus), um die Bildung von Blutgerinnsel in der Vaskulatur zu vermeiden. Dann legen Sie die Maus wieder in die Anästhesie-Box.
4. 10 min, nachdem das Heparin injiziert wurde, bewegen Sie die Maus auf das beheizte Bett in einer Rückenposition und stabilisieren Sie ihre Pfoten mit Etikettierband. Halten Sie die Maus unter Vollanästhesie mit Isofluran e mit einem Nasenkegel.
5. Heben Sie die Bauchhaut der Maus über das Zwerchfell mit Zange und verwenden Sie eine chirurgische Schere, um das Zwerchfell zu schneiden und auszusetzen.
6. Das Zwerchfell und das Brustbein schneiden. Öffnen Sie die Brust.
7. Sezieren Sie das Herz aus der Brusthöhle und schneiden Sie so nah wie möglich an der dorsalen Brustwand.
8. Legen Sie das Herz in die eiskalte Tyrodes Lösung mit 30 mM BDM.
9. Reinigen Sie das Herz, um das Bindegewebe wie die Lunge zu entfernen.
10. Übertragen Sie das Herz in die vorgekühlte Sezierkammer, die mit Tyrodes Lösung gefüllt ist, die 30 mM BDM enthält.

5. Vorbereitung und Cannulation der Septalarterie

1. Schalten Sie die Servopumpe ein. Stellen Sie die Servopumpe auf den "Flow"-Modus ein. Lassen Sie es mit hoher Geschwindigkeit laufen, bis der Schlauch mit der Tyrodes-Lösung gefüllt ist, die verwendet wird, um das Gefäßlumen zu durchdringen. Stellen Sie sicher, dass sich keine Blasen in den Schläuchen befinden. Dann senken Sie die Geschwindigkeit.
2. Heften Sie das Herz an das PDMS an, um Schäden am mittleren Bereich des Herzens zu vermeiden.
3. Entfernen Sie sowohl die rechte als auch die linke Vorhöfin. Schneiden Sie den rechten Ventrikel auf und entfernen Sie die rechte ventrikuläre freie Wand mit einem Sezierendes Mikroskop.
4. Belichten und identifizieren Sie die Septalarterie. Legen Sie ein Nylonfaden (30 m Durchmesser) unter die Septalarterie und binden Sie einen losen Knoten für die zukünftige Verwendung.
   HINWEIS: Die Septalarterie kann leicht mit einem Sezierendes Mikroskop identifiziert werden. Die Septalarterie ist in den meisten Fällen eine Hauptschlagader auf dem Septum, die von der rechten Herzkranzgefäße stammt.
5. Entfernen Sie die linksventrikuläre freie Wand mit einer feinen Schere.
6. Übertragen Sie das Papillarmuskelpräparat in die Versuchskammer, in der die Kanüle positioniert war. Die Kammer ist mit Tyrodes Lösung gefüllt, die BDM enthält. Der Boden dieser Kammer ist mit einer dünnen (ca. 2 mm) Schicht aus PDMS beschichtet.
7. Passen Sie die Position der Kanüle (mit Hilfe des Mikromanipulators) an, um die Kanüle der Septalarterie zu ermöglichen. Ziehen Sie den Knoten fest.
8. Sichern Sie den Papillenmuskel mit kleinen Stiften am Kammerboden, so dass das Mikroskopobjektiv einen klaren Blick auf die Gefäße hat. Achten Sie auf den Winkel und die Position der Kanüle und stellen Sie sicher, dass die Spitze der Kanüle parallel zur Arterienwand verläuft.
9. Testen Sie die Cannulation, indem Sie die Lösung schrittweise aus der Spritze durch die Kanüle ausweisen. Wenn alle Elemente richtig funktionieren, wird Restblut im Papillenmuskel das Gewebe zu Beginn dieses Prozesses verlassen und nur Tyrodes Lösung wird später gesehen.

6. Stabilisierung der Zubereitung

1. Schalten Sie die peristaltische Pumpe ein, die die Superfusionslösung liefert. Dann die Zubereitung im Bad mit vorvergastem PSS mit einer Geschwindigkeit von 3-4 ml/min ständig überlagern.
2. Schalten Sie den Temperaturregler für die Superfusionslösung ein. Stellen Sie die Temperatur des Bades superfusate auf 35-37 °C.
3. Schließen Sie die Kanüle an die Servopumpe an. Lesen Sie den Druck auf dem Druckservoregler.
4. Überwachen Sie den Durchfluss und den Druck. Der Durchfluss (L/min) und der arterielle Perfusionsdruck (mm Hg) werden mit Digitalisierer digitalisiert und mit einer zugehörigen Software aufgezeichnet (Abbildung 2).
5. Stellen Sie den Durchfluss ein, um den Druck von 10 mmHg einzustellen, und lassen Sie ihn für 10 min laufen.
6. Erhöhen Sie den Durchfluss der Luminallösung, um den Druck der Arterie n 60 mmHg zu machen. Erhalten Sie den endgültigen Perfusionsdruck der Artemole selbst, indem Sie den Druckabfall der Kanüle subtrahieren (Abbildung 3).
   HINWEIS: Wenn der Druckmodus auf dem Druckservoregler ausgewählt ist, wird für diese Experimente der Luminaldruck mit 60 mmHg eingestellt. Überwachen Sie dann die Änderung des Durchflusses.
7. Lassen Sie die Probe für 30-60 min stabilisieren, indem Sie den Durchfluss und/oder den Druckpegel überwachen. Eine allmähliche Erhöhung des arteriellen Drucks wird normalerweise zu Beginn der Perfusion nach der Cannulation beobachtet. In etwa 30 min wird sich ein neuer stabiler Zustand etablieren (Abbildung 4).
8. Initiieren Sie ein Experiment, nachdem der Perfusionsdruck stabilisiert wurde (bei konstantem Durchfluss).

7. Beladen der Zubereitung mit fluoreszierend getaggtem Weizenkeim Agglutinin (WGA)

1. Bereiten Sie Die Tyrodes Lösung mit Alexa-Fluor-488 konjugierter WGA vor, indem Sie 100 g konjugierte WGA in 5 ml Der Tyrodes Lösung hinzufügen.
2. Schalten Sie die Perfusate vorsichtig von der normalen Tyrodes-Lösung auf eine Lösung um, die fluoreszierend WGA enthält. Es ist wichtig, die Perfusate sorgfältig zu schalten, damit keine Blasen eingeführt werden.
3. Nach 30 min WGA-Perfusion oder wenn die WGA-Lösung ausläuft, ändern Sie die Perfusate wieder in normale Tyrodes Lösung.

8. Konfokale Bildgebung von Arteriolen und Kapillaren

1. Schalten Sie das konfokale Mikroskopsystem der Nipkow-Scheibe ein.
2. Verwenden Sie das Mikroskop, um die Septalarterie mit einem Low-Power-Objektiv (4x) im Durchlichtmodus zu lokalisieren.
   HINWEIS: Die Septalarterie kann durch Befolgen der Position der Kanüle lokalisiert werden.
3. Starten Sie die konfokale Bildgebung mit der drehbaren Scheibe konfokale und wählen Sie 488 nm Anregungslaser, 40x Objektivvergrößerung und passen Sie die Laserintensität und die Abtastrate (10 - 500 ms pro Bild) an.
4. Richten Sie obere und untere Bildgebungspositionen für das konfokale Mikroskop ein, um den Bildbereich zu definieren und die Parameter für die Z-Stack-Bildgebung einzugeben.
5. Legen Sie die Schrittgröße wie für das verwendete System empfohlen fest, oder legen Sie die Schrittgröße wie gewünscht fest.
6. Wählen Sie die Einstellung z-Stack und/oder Zeitreiheneinstellungen aus.
7. Wählen Sie einen neuen Ordner aus, oder legen Sie ihn fest, um das neue Bild zu speichern.
8. Klicken Sie auf "Ausführen", um die Aufzeichnung der Bildgebung für zukünftige Analysen zu starten (Abbildung 5).

9. Beispiel Vasodilatator-Experiment: Pinacidil-induzierte Vasodilatation (Video 1).

1. Pinacidil-Stammlösung (100 mM in DMSO) vorbereiten und bei 4 °C lagern.
2. Bereiten Sie 10 ml der Tyrodes Lösung vor. Fügen Sie 10 l Pinacidil-Stammlösung hinzu, um die endgültige Konzentration von Pinacidil 100 m zu erreichen.
3. Stellen Sie sich den Papillenmuskel bei geringer Vergrößerung (4x Objektiv) vor, um die Septalarterie und die Astarteriolen einzubeziehen.
4. Schalten Sie die Luminallösung auf die pinacidil enthaltende Lösung.

10. Beispiel Blutflusskontrollexperimente: Vasokonstriktor-induzierte arterielle Perfusionsdruckerhöhung bei konstantem Durchfluss (Abbildung 6)

1. Endothelin-1 (ET-1) Stofflösung (10 m) vorbereiten und bei -20 °C lagern.
2. Bereiten Sie 10 ml der Tyrodes Lösung vor. Fügen Sie 10 L ET-1-Lagerlösung (10 m) hinzu, um die Endkonzentration von ET-1 10 nM zu erreichen.
3. Nehmen Sie den Luminaldruck mit konstantem Durchfluss auf und bilden Sie den Papillenmuskel ab.
4. Schalten Sie die Luminallösung auf die ET-1-haltige Lösung.

11. Beispielbilder von Kapillaren mit Pericyten (Abbildung 7)

1. Opfern Sie eine transgene NG2DSRedBAC-Maus, wie in Abschnitt 4 dieses Protokolls beschrieben.
2. Extrahieren Sie das Herz, können Sie die Septalarterie anheben und die Probe mit Alexa-Fluor-488 konjugiertem WGA nach den Protokollen 5-7 laden.
3. Stellen Sie den Papillenmuskel bei 488 nm und 560 nm Anregung und 510-525 nm, 575-625 nm Emission mit konfokaler Emission dar. Der Arteriendruck wird etwa 40 mmHg betragen.

Ergebnisse

Wenn ein Fluoreszenzgefäßmarker in Gefäßlumen durchdrungen ist (hier WGA konjugiert mit Alexa Fluor-488), ist es möglich, ganze Gefäßbäume zu visualisieren, wie in Abbildung 5 (linkes Panel) mit dem Konfokalmikroskop mit hoher Geschwindigkeit dargestellt. Eine weitere Vergrößerung ermöglicht die Abbildung der Kapillare im Detail(Abbildung 5, Rechtes Panel). Da das Drucksystem eine konstante Überwachung des Luminaldrucks unterstützt, kann dieses Prä...

Diskussion

In der vorliegenden Arbeit haben wir eine bemerkenswert einfache, aber sehr praktische Ex-vivo-Methode eingeführt, um die koronare Mikrozirkulation im Herzen unter physiologischen Bedingungen zu untersuchen. Diese Methode wurde aus mechanischen Untersuchungen mit Ratten²modifiziert. Die herausforderungsgemäße Ergänzung war die Bildgebungstechnologie mit hoher Geschwindigkeit und hoher optischer Auflösung. So konnten wir die fortschrittlichen optischen Bildgebungssysteme nutzen, die jetzt im H...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M CaCl2 solution	MilliporeSigma, USA	21115
1 M MgCl2 solution	MilliporeSigma, USA	M1028
AxoScope software	Molecular Devices, San Jose, CA, USA
Chiller/water incubator	FisherScientific, USA	Isotemp 3016S
Confocal	Nikon Instruments, USA	A1R
Custom glass tubing	Drummond Scientific Company	9-000-3301
Digidata 1322A	Molecular Devices, San Jose, CA, USA
Dissecting microscope	Olympus, Japan	SZX12
Endothelin-1	MilliporeSigma, USA	E7764
Forceps	Fine Scientific Tools	11295-51
Heparin Sodium Salt	Sigma-Aldrich, USA	H3393
Inline solution Heater	Warner Istruments, Hamden, CT, USA	SH-27B
Isoflurane	VETone, Idaho, USA	502017
Micropipette puller	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97
Micropipette/cannula holder	Warner Istruments, Hamden, CT, USA	64-0981
NG2DsRedBAC transgenic mouse	The Jackson Laboratory	#008241
Nylon thread for tying blood vessels	Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA	THR-G
PDMS (polydimethylsiloxane)	SYLGARD, Germantown, WI, USA	184 SIL ELAST KIT
Peristaltic pump	Gilson, Middleton, WI, USA	minipuls 3
Pressure Servo Controller	Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA	PS-200-S
Scissors	Fine Scientific Tools, Foster City, CA, USA	15000-10
Servo Pump	Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA	PS-200-P
Temperature controller	Warner Instruments, Hamden, CT, USA	TC-324B
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA USA	W11261