JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يتم تقديم بروتوكول لتصوير الشبكية الكاملة السليمة حيث تتم إزالة الطبقات الخارجية المعتمة / المصطبغة من مقلة العين جراحيا ، ويتم تطبيق المقاصة البصرية لجعل شبكية العين شفافة مما يتيح تصور الشبكية المحيطية والأوعية الدموية الهيالودية في شبكية العين السليمة باستخدام الفحص المجهري الفلوري للصفائح الخفيفة.

Abstract

يمكن تصور الهياكل العصبية والأوعية الدموية لشبكية العين في الحالات الفسيولوجية والمرضية وتمييزها بشكل أفضل باستخدام تقنيات تصوير الشبكية الكاملة السليمة مقارنة بالمستحضرات والأقسام التقليدية للشبكية المسطحة. ومع ذلك ، فإن التصوير المناعي الفلوري لشبكية العين الكاملة السليمة يعيقه الطلاء غير الشفاف لمقلة العين ، أي التصلب ، المشيمية ، وظهارة صبغة الشبكية (RPE) وخصائص تشتت الضوء لطبقات الشبكية التي تمنع التصوير البصري عالي الدقة بسماكة كاملة. تم وصف التبييض الكيميائي للطبقات المصطبغة وبروتوكولات إزالة الأنسجة لمعالجة هذه العقبات. ومع ذلك ، فإن الطرق الموصوفة حاليا ليست مناسبة لتصوير جزيئات الفلورسنت الذاتية مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP) في شبكية العين الكاملة السليمة. تجاوزت الأساليب الأخرى هذا القيد عن طريق الاستئصال الجراحي للطبقات المصطبغة والجزء الأمامي من مقلة العين مما يسمح بتصوير العين السليم ، على الرغم من تعطيل الشبكية المحيطية والهياكل الهيالويدية. يتم تقديم بروتوكول تصوير الشبكية المناعية الكاملة والزجاجية السليمة الذي يجمع بين التشريح الجراحي لطبقات ظهارة صبغة الصلبة / المشيمية / الشبكية (RPE) مع طريقة معدلة لإزالة الأنسجة والفحص المجهري الفلوري للصفائح الخفيفة (LSFM). يقدم النهج الجديد رؤية غير مسبوقة للعناصر الوعائية والعصبية غير المضطربة في شبكية العين بالإضافة إلى نظام الأوعية الدموية الزجاجية والهيالويد في الحالات المرضية.

Introduction

يتم استكشاف التفاعل بين العناصر العصبية والأوعية الدموية في الشبكية في الحالات الصحية والمرضية تقليديا من خلال دراسات الفلورسنت المناعي على الأقسام الفيزيائية لأنسجة الشبكية الثابتة بالتبريد أو على مستحضرات شبكية العينالمسطحة 1. ومع ذلك ، فإن تقسيم الأنسجة يعطل استمرارية الخلايا العصبية والأوعية الدموية في شبكية العين ، وعلى الرغم من اقتراح إعادة بناء ثلاثية الأبعاد لأقسام الشبكية المجاورة كحل ممكن ، إلا أنها لا تزال عرضة للأخطاء والتحف. كما أن مستحضرات التثبيت المسطح لشبكية العين تزعج بشكل ملحوظ سلامة عناصر الشبكية والأوعية الدموية والعصبية والعلاقة الجغرافية بين مناطق الشبكية المجاورة2. بدلا من ذلك ، تم مؤخرا تقديم تصوير شبكية العين الكامل السليم لتصور الإسقاطات ثلاثية الأبعاد للخلايا العصبية والأوعية الدموية في الشبكية في موضعها التشريحي الطبيعي2،3،4،5.

في تصوير شبكية العين الكاملة السليمة ، يتم التقاط إشارات الفلورسنت من العناصر الوعائية والعصبية لمناطق الشبكية المجاورة (البلاط) لشبكية العين الكاملة السليمة باستخدام مجهر الورقة الضوئية. ثم يتم "خياطة" هذه البلاط معا لإعادة بناء عرض ثلاثي الأبعاد لشبكية العين بأكملها2،3،4،5،6. يوفر تصوير الشبكية الكاملة السليمة رؤية غير مسبوقة لشبكية العين لدراسة التسبب في أمراض الأوعية الدموية والتنكسية والالتهابية في الشبكية2،3،4،5،6. على سبيل المثال ، Prahst et al. كشف عن مورفولوجيا معقودة "غير مقدرة" سابقا لخصلات الأوعية الدموية المرضية ، وحركة الخلايا غير الطبيعية وديناميكيات filopodia المتغيرة في نموذج اعتلال الشبكية الناجم عن الأكسجين (OIR) باستخدام التصوير الحي لشبكية العين الكاملةالسليمة 2. وبالمثل ، أظهر Henning et al. و Singh et al. و Chang et al. شبكة الأوعية الدموية الشبكية المعقدة ثلاثية الأبعاد في شبكية العين الكاملةالسليمة 3،4،6. استخدم Vigouroux et al. طريقة تصوير العين الكاملة السليمة لإظهار تنظيم شبكية العين والإسقاطات البصرية في فترة الفترة المحيطةبالولادة 5. من أجل أن تكون قادرا على إنشاء مثل هذه المناظر ثلاثية الأبعاد التي لا مثيل لها لشبكية العين ، تغلبت بروتوكولات تصوير شبكية العين الكاملة السليمة على قيدين رئيسيين: 1) وجود طلاءات غير شفافة ومصطبغة لمقلة العين (الصلبة والمشيمية و RPE) و 2) الاختراق المحدود للضوء من خلال سماكة الشبكية الكاملة الناتجة عن خصائص تشتت الضوء للطبقات النووية والضفيرية. Henning et al. و Vigouroux et al. طبق تبييض H2O2 لأصباغ المشيمية / RPE حتى يتمكنوا من تصوير شبكية العينالسليمة 3،5. ومع ذلك ، فإن التبييض غير مناسب للسلالات الحيوانية ذات الفلوروفورات الداخلية مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP) أو بعد تلطيخ الفلورسنت المناعيفي الجسم الحي 3،5،7. بالإضافة إلى ذلك ، تم تنفيذ طريقة Henning et al. لعلاج H2O2 في ظروف مائية قد تولد فقاعات دقيقة تؤدي إلى انفصال الشبكية. علاوة على ذلك ، تم إجراء علاج H2O2 عند 55 درجة مئوية ، وهي حالة تزيد من تدهور تقارب الأجسام المضادة للأنسجة. علاوة على ذلك ، قد يؤدي التبييض إلى تألق ذاتي ثقيل ينشأ من الميلانينالمؤكسد 8. تمكنت بروتوكولات إزالة التصبغ الأخرى لأقسام العين باستخدام برمنجنات البوتاسيوم وحمض الأكساليك من إزالة أصباغ RPE في الأقسام الجنينية ، ولكن ثبت أيضا أن طريقة إزالة التصبغ هذه تقلل من فعالية وضع العلامات المناعية9،10. كبديل للتبييض ، قام Prahst et al. و Singh et al. و Chang et al. بإزالة الصلبة والمشيمية والقرنية لجعل شبكية العين بأكملها يمكن الوصول إليها إلى ضوء المجهر2،4،6. ومع ذلك ، فإن إزالة القرنية والعدسة والشبكية المحيطية قد تؤدي إلى تشويه وتعطيل الشبكية المحيطية والأوعية الهيالودية مما يجعل هذه الطرق غير مناسبة لدراسة الشبكية المحيطية والأوعية الدموية الهيالويدية.

تتضمن جميع بروتوكولات تصوير العين الكاملة السليمة المتوفرة حاليا استخدام خطوة تطهير بصري للأنسجة للتغلب على خصائص تشتت الضوء لطبقات الشبكية2،3،4،5. يجعل التطهير البصري للأنسجة شبكية العين شفافة لضوء المجهر عن طريق معادلة معامل الانكسار لنسيج معين ، هنا شبكية العين ، عبر جميع عناصرها الخلوية وبين الخلايا لتقليل تشتت الضوء وامتصاصه11. يجب إزالة المشيمية و RPE أو تبييضها قبل تطبيق المقاصة البصرية للأنسجة على شبكية العين حيث لا يمكن مسح الطلاءات المصطبغة لمقلة العين (المشيمية و RPE) بشكل كاف6،12،13،14،15،16،17،18.

من الأفضل دراسة مشاركة ومساهمات نظام الأوعية الدموية الزجاجي والهيالويد في الحالات المرضية مثل اعتلال الشبكية الخداجي (ROP) ، والأوعية الدموية الجنينية المستمرة (PFV) ، ومرض نوري ، ومرض ستيكلر عندما لا تتعطل شبكية العين والأوعية الهيالودية في تحضيرالأنسجة 19،20،21،22،23. الطرق الحالية لتصوير الشبكية الكاملة السليمة إما تزيل الجزء الأمامي من العين ، مما يعطل الجسم الزجاجي والأوعية الدموية بشكل طبيعي ، أو تطبق عوامل التبييض ، والتي قد تزيل الفلوروفورات الداخلية. لا توجد طرق منشورة لتصور الجسم الزجاجي والأوعية الدموية في حالتها السليمة التي لم تمسها. نصف هنا طريقة تصوير كاملة لشبكية العين والجسم الزجاجي تتكون من التشريح الجراحي للطلاءات المصطبغة وغير الشفافة لمقلة العين ، وتنظيف بصري معدل للأنسجة محسن لشبكية العين ، وفحص مجهر فلوري للصفائح الخفيفة. يتم تفصيل إعداد العينة ، والمسح البصري للأنسجة ، والفحص المجهري للصفائح الضوئية ، وخطوات معالجة الصور أدناه.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسي التابعة لجامعة تكساس (IACUC). كان استخدام ورعايتها وفقا لبيان جمعية أبحاث الرؤية وطب العيون (ARVO) لاستخدام في أبحاث طب العيون والرؤية. جميع المواد المطلوبة لتنفيذ هذا الإجراء مدرجة في جدول المواد. ارتد قفازات خالية من البودرة أثناء تنفيذ كل خطوة. للخطوتين 6 و 7 ، راجع أيضا دليل تشغيل المجهر الرسمي.

1. تحضير

  1. القتل الرحيم للفئران التجريبية وفقا للبروتوكول المعمول به من قبل لجنة رعاية المؤسسي واستخدامه (تم استخدام التخدير بمزيج من الكيتامين 60 مجم / كجم وديكسميديتوميدين 0.5 مجم / كجم متبوعا بخلع عنق الرحم هنا). انتقل على الفور إلى تثبيت على منصة للتشريح وتروية القلب.
    ملاحظة: يتم اختيار التجارب بناء على تصميم الدراسة الفردية.
  2. تشريح البطن والصدر لكشف القلب. قم بإجراء التروية القلبية عن طريق نقل القلب عبر إبرة 27 جم موضوعة في البطين الأيسر وقم بعمل شق صغير (~ 1 مم) في الأذين الأيمن للسماح بخروج الدم24.
    1. أولا ، قم بنقل 30-50 مل من محلول ملحي متوازن للفوسفات المثلج (PBS) ثم 30-50 مل من 4٪ بارافورمالدهيد طازج (PFA).
    2. للتحقق من نجاح نقل الدم PFA ، تحقق من وجود تشنجات عضلية مرئية في جميع أنحاء الجسم والذيل. انتقل إلى خطوة الاستئصال.

2. استئصال مقلة العين والتثبيت

  1. استخدمي ملقط صائغ منحني للضغط برفق على الجفن العلوي أو السفلي لإجبار مقلة العين على الخروج من تجويفها. استخدم مجموعة أخرى من الملقط أو الملقط المماثل لثقب الملتحمة من الجانب وتثبيت الكرة الأرضية من جانب العصب البصري. ارفع الكرة الأرضية ببطء من تجويفها حتى يتم قطعها عن العصب البصري.
  2. انقل الكرة الأرضية إلى أنبوب يحتوي على 4٪ PFA طازج مثلج. قم بتسمية الأنبوب وفقا لذلك. اترك الكرة الأرضية في 4٪ PFA في ثلاجة 4 درجات مئوية لمدة 12 ساعة (طوال الليل).
    ملاحظة: استخدم ماصة نقل بلاستيكية ذات طرف مقطوع لنقل الكرة الأرضية. قم بتوسيع فتحة الطرف المقطوع بطرف ماصة ثان لتجنب إتلاف العينة بحواف حادة.

3. تشريح العينة (الشكل 1 والشكل 2)

  1. تحت المجهر المجسم ، حدد موقع تقاطع القرنية والصلبة (الشكل 1 أ) واستخدم طرف القطع الحاد لإبرة 30 جم لعمل قطع سطحي للغاية في الصلبة حوالي 0.5-1 مم خلف تقاطع القرنية والصلبة (الشكل 1 ب).
  2. تقدم إحدى شفرات مقص تشريح طرف حاد من خلال الشق الذي تم إجراؤه للتو في المساحة المحتملة بين الصلبة / المشيمية / RPE وشبكية العين (الشكل 1 ج). قم بتقديم المقص وقصه بشكل محيطي حتى يمكن تقشير الصلبة / المشيمية / RPE من السطح الخارجي لشبكية العين (الشكل 1D ، E).
    ملاحظة: من المهم تنفيذ هذه الخطوة ببطء ولطف لتجنب ثقب الشبكية. تعتبر الجروح القليلة الأولى مهمة بشكل خاص لتجنب قطع شبكية العين.
  3. إذا لزم الأمر ، قم بعمل جروح استرخاء شعاعية على الصلبة / المشيمية / RPE لتسهيل عملية القطع المحيطي والتقشير اللاحق للعصب البصري والصلبة / المشيمية / RPE. قم بإزالة بقع صغيرة من RPE (الشكل 1F) باستخدام فرشاة طلاء بحجم 1 مبللة ببرنامج تلفزيوني.
  4. انقل مقلة العين السليمة بالكامل إلى أنبوب يحتوي على PBS. انتقل على الفور إلى الخطوة التالية أو احتفظ بها في 4 درجات مئوية لوضع العلامات المناعية.
    ملاحظة: يمكن وضع علامات على مقلة العين بعد الاستئصال ثم بعد التشريح للحفاظ على اتجاه العين إذا لزم الأمر. قد يتم إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا ، ويمكن حفظ العينات طوال الليل في ثلاجة 4 درجات مئوية قبل المتابعة إلى الخطوات التالية.

4. تلطيخ الأوعية الدموية

  1. قم باختراق الأنسجة عن طريق غمرها في PBS التي تحتوي على 0.2٪ Tween-20 في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
  2. اغسل العينة باستخدام PBS 3 مرات على شاكر لمدة 10 دقائق.
  3. احتضان العينة بمصل الماعز العادي بنسبة 5٪ (NGS) في PBS الذي يحتوي على 0.25٪ Triton X-100 في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
  4. احتضان الجسم المضاد الأساسي عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. هنا ، تم استخدام جسم مضاد للكولاجين IV مضاد للفأر (تم تحضير التركيز النهائي في PBS يحتوي على 0.2٪ Tween-20).
  5. يغسل 3 مرات باستخدام PBS لمدة 5 دقائق لكل غسلة.
  6. احتضان العينة بأجسام مضادة ثانوية تحمل علامة الفلورسنت. هنا ، تم استخدام Alexa Fluor 568 المضاد للأرانب لمدة 12 ساعة عند 4 درجات مئوية (تخفيف 1: 200 في PBS يحتوي على 0.2٪ Tween-20).
  7. اغسل باستخدام PBS 3 مرات ، لمدة ساعة واحدة لكل منها ، ثم تابع خطوات إزالة الأنسجة.

5. المقاصة البصرية مع 2،2 ′-thiodiethanol (TDE)

  1. تحضير تركيزات TDE العاملة باستخدام محلول TDE مع PBS للتركيز النهائي بنسبة 10٪ و 20٪ و 30٪ و 40٪ و 50٪ و 60٪ من الحجم إلى الحجم (حجم / حجم). قم بإعداد ما لا يقل عن 2 مل من المحلول لكل عينة عين للسماح بحجم زائد كاف لاختراق الأنسجة.
  2. احتضان العينات في صفيحة 6 أو 12 بئر عند زيادة تركيز TDE. ابدأ بغمر مقل العيون الكاملة السليمة في محلول TDE بنسبة 10٪ لمدة 2-4 ساعات على شاكر في درجة حرارة الغرفة. على التوالي ، انقل العينة إلى تركيز TDE أعلى لمدة 2-4 ساعات في كل تركيز TDE (الشكل 2 ج).
    ملاحظة: تبدأ شبكية العين في التنظيف بتركيزات 40٪ -50٪ ، ولكن يحدث الحد الأقصى للإزالة بعد الحضانة في محلول 60٪. تصبح شبكية العين أقل شفافية بتركيزات 70٪ وأعلى (الشكل 2 د).
  3. أوقف عملية المقاصة بين عشية وضحاها ، إذا لزم الأمر ، في أي من خطوات تبادل المقاصة المتتالية.

6. تصوير العين بالكامل باستخدام الفحص المجهري للورقة الضوئية

  1. قم بتركيب عينات العين الكاملة السليمة مع مراعاة تكوين منصة مجهر الألواح الضوئية المستخدمة. اتبع تعليمات المجهر وبرنامج الاستحواذ لإعداد معلمات الاستحواذ بما في ذلك محاذاة ورقة الضوء والإضاءة والكشف عن المسارات البصرية.
    ملاحظة: تم لصق العينات المستخدمة في هذه التجربة من جانب القرنية إلى طرف إبرة تحت الجلد على حقنة الأنسولين (الشكل 2 ه). ثم تم تعليق العينة داخل غرفة المجهر.
  2. املأ غرفة المجهر بنسبة 60٪ TDE كمحلول مقاصة.
  3. اغمر العينة داخل غرفة مجهر الورقة الضوئية في محلول TDE بنسبة 60٪ (تركيز المقاصة النهائي).
  4. قم بتصوير العين التي تم تطهيرها عن طريق مجموعة متنوعة من المجاهر التجارية أو المصممة خصيصا والمناهر الورقية الخفيفة. في هذا البروتوكول ، يتم استخدام مجهر ورقة إضاءة مزدوجة الجانب.
  5. استخدم التصوير منخفض الدقة والتكبير المنخفض (5x ، NA 0.16) لتصوير التشكل الخلوي وتتبع العملية الخلوية خاصة عند دمجه مع التجانب. استخدم تصويرا عالي الدقة وتكبير (20x ، NA 1.0) لتصوير كل من التشكل الخلوي والعضيات الخلوية الكبيرة مثل النوى ومجموعات الميتوكوندريا.

7. معالجة الصور بعد الاستحواذ

ملاحظة: تعتمد المعالجة اللاحقة للاستحواذ على نوع الملف والبرامج المتوافقة مع الملفات المصورة.

  1. قم بتطبيق إزالة التشويش أو إزالة الالتفاف لزيادة الصور الأولية قبل خياطة البلاط المصور. يمكن تطبيق مرشح Weiner لإزالة تشويش الصور. بدلا من ذلك ، يمكن إلغاء الالتفاف للصور بشكل متكرر بعد تقليل الضوضاء باستخدام إزالة الالتفاف Richardson-Lucy و PSF النظري أو التجريبي المقاس باستخدام أدوات النمذجة مثل المكون الإضافي ImageJ PSF generator25.
  2. قم بإجراء خياطة مكدسات z المعالجة مسبقا وتحويلات وحدة التخزين الخالية من اللافائدة وغير الصلبة متبوعة بتسجيل وحدة التخزين متعددة المشاهدات والاندماج باستخدام مجموعة متنوعة من حزم البرامج التجارية أو العامة (ImageJ - المكون الإضافي BigStitcher)26.

النتائج

يظهر إسقاط بزاوية صفرية لشبكة الأوعية الدموية المحيطة بالحليمي والخلايا الدبقية الصغيرة في الشكل 3 أ. أيضا ، يتم عرض توزيع الخلايا الدبقية الصغيرة الكاملة في شبكية العين في فأر CX3CR1-GFP في الشكل 3 ب. تتمثل الميزة الرئيسية للطريقة المعر...

Discussion

من الأفضل دراسة تطور الشبكية والجسم الزجاجي والأمراض باستخدام تقنيات تصوير الشبكية الكاملة السليمة التي لا يتم فيها قطع شبكية العين للأقسام أو لمستحضرات التثبيت المسطحة. تتضمن طرق تصوير العين الكاملة السليمة الحالية إما تبييض الصباغ ، الذي يزيل الفلوروفورات الفطرية ،...

Disclosures

لا يوجد تضارب تجاري ذي صلة.

Acknowledgements

تم تنفيذ هذا العمل في الفرع الطبي بجامعة تكساس. يقدر المؤلفون هارالد
يونج ، دكتوراه ، ديبورا فيرينجتون ، دكتوراه ، وهايدي روهريش ، جامعة مينيسوتا لمساعدتهم في إعداد الشكل 1 والفيلم 2. تم دعم LO من قبل T32ES007254 منحة تدريب NIEHS T32.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Experimental animal
CX3CR1-GFP MouseThe Jackson Laboratory5582
Anesthetic
DexmedetomidinePar Pharmaceutical42023-146-25
KetamineFresenius Kabi
Tissue harvesting, fixation, and sample dissection
cardiac perfusion pumpFisher scientificNC9069235
Cyanoacrylate superglueamazon.com
Fine scissors-sharpFine Science Tools14160-10
Fine tweezersFine Science Tools11412-11
Paraformaldehyde (PFA)Electrone microscopy sciences15710-S
Phosphate buffered saline (PBS)Gibco10010049
size 1 painting brushdickblick.com
straight spring scissorsFine Science Tools15000-03
syringe, needle tip, 27 gauge x 1.25"BD
Tubes 1.5 ml, 15 ml, 50 mlThermo sceintific
Tween-20ThermoFisher85114
Immunofluorescent staining
Anti-mouse collagen IV antibodyAbcamab198081:200 dilution
Anti-rabbit Alexa Fluor 568InvitreogenA-110111:200 dilution
Normal goat serumThermoFisher50062Z10% concentration
Tissue clearing
2,2′-thiodiethanol (TDE)Fluka analyticaSTBD7772V
Rocking shakerFisher scientific02-217-765
Microscopy
Fluorescent microspheresTetraSpeckT14792
Light sheet fluorescent microscope (LSFM)ZeissZ1
Microglia enumeration
ImageJNational Institue of Health

References

  1. Usui, Y., et al. Neurovascular crosstalk between interneurons and capillaries is required for vision. Journal of Clinical Investigation. 125, 2335-2346 (2015).
  2. Prahst, C., et al. Mouse retinal cell behaviour in space and time using light sheet fluorescence microscopy. eLife. 9, 49779 (2020).
  3. Henning, Y., Osadnik, C., Malkemper, E. P. EyeCi: Optical clearing and imaging of immunolabeled mouse eyes using light-sheet fluorescence microscopy. Experimental Eye Research. 180, 137-145 (2019).
  4. Chang, C. C., et al. Selective Plane Illumination Microscopy and Computing Reveal Differential Obliteration of Retinal Vascular Plexuses. bioRxiv. , (2020).
  5. Vigouroux, R. J., César, Q., Chédotal, A., Nguyen-Ba-Charvet, K. T. Revisiting the role of DCC in visual system development with a novel eye clearing method. eLife. 9, 51275 (2020).
  6. Singh, J. N., Nowlin, T. M., Seedorf, G. J., Abman, S. H., Shepherd, D. P. Quantifying three-dimensional rodent retina vascular development using optical tissue clearing and light-sheet microscopy. Journal of Biomedical Optics. 22, 076011 (2017).
  7. Kim, S. Y., Assawachananont, J. A new method to visualize the intact subretina from retinal pigment epithelium to retinal tissue in whole mount of pigmented mouse eyes. Translational Vision Science and Technology. 5, 1-8 (2016).
  8. Kayatz, P., et al. Oxidation causes melanin fluorescence. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 42, 241-246 (2001).
  9. Iwai-Takekoshi, L., et al. Retinal pigment epithelial integrity is compromised in the developing albino mouse retina. Journal of Comparative Neurology. 524, 3696-3716 (2016).
  10. Alexander, R. A., Cree, I. A., Foss, A. J. The immunoalkaline phosphatase technique in immunohistochemistry: the effect of permanganate-oxalate melanin bleaching upon four final reaction products. British Journal of Biomedical Science. 53, 170-171 (1996).
  11. Ueda, H. R., et al. Whole-Brain Profiling of Cells and Circuits in Mammals by Tissue Clearing and Light-Sheet Microscopy. Neuron. 106, 369-387 (2020).
  12. Hillman, E. M. C., Voleti, V., Li, W., Yu, H. Light-Sheet Microscopy in Neuroscience. Annual Review of Neuroscience. 42, 295-313 (2019).
  13. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the pegasos method. Cell Research. 28, 803-818 (2018).
  14. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
  15. Hohberger, B., Baumgart, C., Bergua, A. Optical clearing of the eye using the See Deep Brain technique. Eye. 31, 1496-1502 (2017).
  16. Kuwajima, T., et al. ClearT: A detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development (Cambridge). 140, 1364-1368 (2013).
  17. Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Developmental Biology. 14, 48 (2014).
  18. Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13, 859-867 (2016).
  19. Hegde, S., Srivastava, O. Different gene knockout/transgenic mouse models manifesting persistent fetal vasculature: Are integrins to blame for this pathological condition. Life Sciences. 171 (15), 30-38 (2016).
  20. Hartnett, M. E., Penn, J. S. Mechanisms and Management of Retinopathy of Prematurity. New England Journal of Medicine. 367, 2515-2526 (2012).
  21. Pierce, E. A., Foley, E. D., Smith, L. E. H. Regulation of vascular endothelial growth factor by oxygen in a model of retinopathy of prematurity. Archives of Ophthalmology. 114, 1219-1228 (1996).
  22. Ash, J., McLeod, D. S., Lutty, G. A. Transgenic expression of leukemia inhibitory factor (LIF) blocks normal vascular development but not pathological neovascularization in the eye. Molecular Vision. 11, 298-308 (2005).
  23. Reichel, M. B., et al. High frequency of persistent hyperplastic primary vitreous and cataracts in p53-deficient mice. Cell Death and Differentiation. 5, 156-162 (1998).
  24. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), 3564 (2012).
  25. Kirshner, H., Aguet, F., Sage, D., Unser, M. 3-D PSF fitting for fluorescence microscopy: Implementation and localization application. Journal of Microscopy. 249, 13-25 (2013).
  26. Hörl, D., et al. BigStitcher: reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples. Nature Methods. 16, 870-874 (2019).
  27. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and Whole-Organ Clearing and Imaging Techniques with Single-Cell Resolution: Toward Organism-Level Systems Biology in Mammals. Cell Chemical Biology. 23, 137-157 (2016).
  28. Tian, B., et al. Efficacy of novel highly specific bromodomain-containing protein 4 inhibitors in innate inflammation–driven airway remodeling. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 60, 68-83 (2019).
  29. Zaman, R. T., et al. Changes in morphology and optical properties of sclera and choroidal layers due to hyperosmotic agent. Journal of Biomedical Optics. 16, 077008 (2011).
  30. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10, 508-513 (2013).
  31. Renier, N., et al. IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159, 896-910 (2014).
  32. Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5, 9808 (2015).
  33. Aoyagi, Y., Kawakami, R., Osanai, H., Hibi, T., Nemoto, T. A rapid optical clearing protocol using 2,2'-thiodiethanol for microscopic observation of fixed mouse brain. PLoS One. 10, 0116280 (2015).
  34. Icha, J., et al. Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development. Journal of Visualized Experiments. (110), e53966 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

RPE

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved