Mikrochirurgische Dissektion und Gewebereinigung für hochauflösende Bildgebung der gesamten Netzhaut und des Glaskörpers

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll für die Bildgebung der intakten gesamten Netzhaut vorgestellt, bei dem die äußeren undurchsichtigen/pigmentierten Schichten des Augapfels chirurgisch entfernt werden und eine optische Reinigung angewendet wird, um die Netzhaut transparent zu machen, was die Visualisierung der peripheren Netzhaut und der hyaloiden Gefäße in intakter Netzhaut mittels Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht.

Zusammenfassung

Neuronale und vaskuläre Strukturen der Netzhaut unter physiologischen und pathologischen Zuständen können durch die Verwendung von intakten Bildgebungsverfahren der gesamten Netzhaut im Vergleich zu herkömmlichen retinalen Flat-Mount-Präparationen und -Schnitten besser sichtbar gemacht und charakterisiert werden. Die Immunfluoreszenzbildgebung der intakten gesamten Netzhaut wird jedoch durch die undurchsichtigen Beschichtungen des Augapfels, d. h. Sklera, Aderhaut und retinales Pigmentepithel (RPE), und die lichtstreuenden Eigenschaften der Netzhautschichten behindert, die eine hochauflösende optische Bildgebung in voller Dicke verhindern. Um diese Hindernisse zu beseitigen, wurden chemisches Bleichen der pigmentierten Schichten und Protokolle zur Gewebereinigung beschrieben. Die derzeit beschriebenen Methoden sind jedoch nicht geeignet, endogene fluoreszierende Moleküle wie das grün fluoreszierende Protein (GFP) in intakter ganzer Netzhaut abzubilden. Andere Ansätze umgingen diese Einschränkung, indem sie chirurgische Entfernung von Pigmentschichten und dem vorderen Segment des Augapfels ermöglichten, was eine intakte Bildgebung des Auges ermöglichte, obwohl die periphere Netzhaut und die hyaloiden Strukturen gestört wurden. Vorgestellt wird ein intaktes Immunfluoreszenz-Bildgebungsprotokoll für die gesamte Netzhaut und den Glaskörper, das die chirurgische Dissektion der Sklera-/Aderhaut-/Retina-Pigmentepithelschichten (RPE) mit einer modifizierten Gewebereinigungsmethode und Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie (LSFM) kombiniert. Der neue Ansatz bietet einen noch nie dagewesenen Blick auf ungestörte vaskuläre und neuronale Elemente der Netzhaut sowie des glasartigen und hyaloiden Gefäßsystems bei pathologischen Zuständen.

Einleitung

Die Interaktion zwischen den neuronalen und vaskulären Elementen der Netzhaut im gesunden und Krankheitszustand wird traditionell durch Immunfluoreszenzstudien an physikalischen Schnitten von paraffin- oder kryofixiertem Netzhautgewebe oder an Netzhaut-Flachpräparaten untersucht¹. Die Gewebeschnitte stören jedoch die neuronale und vaskuläre Kontinuität der Netzhaut, und obwohl eine dreidimensionale Rekonstruktion der angrenzenden Netzhautschnitte als mögliche Lösung vorgeschlagen wird, ist sie immer noch mit Fehlern und Artefakten behaftet. Retina-Flat-Mount-Präparate stören auch deutlich die Integrität der retinalen vaskulären und neuronalen Elemente und die geographische Verbindung zwischen benachbarten Netzhautbereichen². Alternativ wurde kürzlich die intakte Bildgebung der gesamten Netzhaut eingeführt, um die dreidimensionalen Projektionen der neuronalen und vaskulären Komponenten der Netzhaut in ihrer natürlichen anatomischen Position zu visualisieren 2,3,4,5.

Bei der Bildgebung der intakten ganzen Netzhaut werden fluoreszierende Signale von den vaskulären und neuronalen Elementen benachbarter Netzhautbereiche (Kacheln) einer intakten ganzen Netzhaut mit einem Lichtblattmikroskop erfasst; Diese Kacheln werden dann "zusammengenäht", um eine dreidimensionale Ansicht der gesamten Netzhaut^zu rekonstruieren 2,3,4,5,6. Die intakte Bildgebung der gesamten Netzhaut bietet einen noch nie dagewesenen Blick auf die Netzhaut für die Untersuchung der Pathogenese von vaskulären, degenerativen und entzündlichen Erkrankungen der Netzhaut 2,3,4,5,6. Zum Beispiel zeigten Prahst et al. eine zuvor "unerkannte" verknotete Morphologie pathologischer Gefäßbüschel, eine abnormale Zellmotilität und eine veränderte Filopodiendynamik in einem sauerstoffinduzierten Retinopathie-Modell (OIR) unter Verwendung von Live-Bildgebung einer intakten gesamten Netzhaut². In ähnlicher Weise zeigten Henning et al., Singh et al. und Chang et al. das komplexe dreidimensionale retinale Gefäßnetzwerk in intakten ganzen Netzhäuten ^3,4,6. Vigouroux et al. verwendeten eine intakte bildgebende Methode des gesamten Auges, um die Organisation der Netzhaut und der visuellen Projektionen in der Perinatalperiode^{zu zeigen 5}. Um solch unvergleichliche dreidimensionale Ansichten der Netzhaut erstellen zu können, haben intakte Bildgebungsprotokolle der gesamten Netzhaut zwei wesentliche Einschränkungen überwunden: 1) das Vorhandensein von undurchsichtigen und pigmentierten Beschichtungen des Augapfels (Sklera, Aderhaut und RPE) und 2) die begrenzte Durchdringung des Lichts durch die gesamte Netzhautdicke, die durch die Lichtstreueigenschaften der nuklearen und plexiformen Schichten der Netzhaut verursacht wird. Henning et al. und Vigouroux et al. wendeten_H2O₂ Bleaching von Aderhaut-/RPE-Pigmenten an, um eine intakte Netzhaut abbilden^{zu können 3,5}. Das Bleichen ist jedoch nicht geeignet für Tierstämme mit endogenen Fluorophoren wie grün fluoreszierendem Protein (GFP) oder nach In-vivo-Immunfluoreszenzfärbungen ^3,5,7. Darüber hinaus wurde die Methode der H₂O₂ -Behandlung von Henning et al. unter wässrigen Bedingungen durchgeführt, die Mikrobläschen erzeugen können, die zu einer Netzhautablösung führen. Darüber hinaus wurde die H₂O₂ -Behandlung bei 55 °C durchgeführt, ein Zustand, der die Affinität der Gewebeantikörper weiter verschlechtert. Darüber hinaus kann es beim Bleichen zu einer starken Autofluoreszenz kommen, die von oxidiertem Melanin⁸ ausgeht. Andere Depigmentierungsprotokolle für Augenabschnitte mit Kaliumpermanganat und Oxalsäure waren in der Lage, RPE-Pigmente in embryonalen Schnitten zu entfernen, aber es wurde auch gezeigt, dass diese Depigmentierungsmethode die Wirksamkeit der Immunmarkierung verringert ^9,10. Als Alternative zum Bleaching entfernten Prahst et al., Singh et al. und Chang et al. Sklera, Aderhaut und Hornhaut, um eine ganze Netzhaut für Mikroskoplicht erreichbar zu machen ^2,4,6. Die Entfernung von Hornhaut, Linse und peripherer Netzhaut kann jedoch die periphere Netzhaut und die hyaloiden Gefäße verzerren und stören, so dass diese Methoden für die Untersuchung der peripheren Netzhaut und der hyaloiden Gefäße ungeeignet sind.

Alle derzeit verfügbaren Bildgebungsprotokolle für das gesamte Auge beinhalten die Verwendung eines gewebeoptischen Reinigungsschritts, um die Lichtstreuungseigenschaften der Netzhautschichten^{zu überwinden 2,3,4,5}. Die optische Reinigung des Gewebes macht die Netzhaut für das Licht des Mikroskops transparent, indem der Brechungsindex eines bestimmten Gewebes, hier der Netzhaut, über alle seine zellulären und interzellulären Elemente hinweg ausgeglichen wird, um die Lichtstreuung und -absorption zu minimieren¹¹. Aderhaut und RPE sollten entfernt oder gebleicht werden, bevor die Gewebeoptik auf die Netzhaut aufgetragen wird, da die pigmentierten Beschichtungen des Augapfels (Aderhaut und RPE) nicht ausreichend entfernt werden können 6,12,13,14,15,16,17,18.

Die Beteiligung und der Beitrag des glasartigen und hyaloiden Gefäßsystems bei pathologischen Zuständen wie Frühgeborenenretinopathie (ROP), persistierendem fetalem Gefäßsystem (PFV), Norrie-Krankheit und Morbus Stickler wird am besten untersucht, wenn Netzhaut und hyaloide Gefäße bei der Gewebepräparation nicht gestört werden 19,20,21,22,23 . Bestehende Methoden zur Bildgebung der gesamten Netzhaut entfernen entweder den vorderen Augenabschnitt, wodurch der Glaskörper und seine Gefäße auf natürliche Weise gestört werden, oder es werden Bleichmittel eingesetzt, die endogene Fluorophore entfernen können. Publizierte Methoden zur Visualisierung des Glaskörpers und des Gefäßsystems in ihrem intakten, unberührten Zustand fehlen. Wir beschreiben hier ein bildgebendes Verfahren der gesamten Netzhaut und des Glaskörpers, das aus der chirurgischen Dissektion von pigmentierten und undurchsichtigen Beschichtungen des Augapfels, einer modifizierten gewebeoptischen Reinigung, die für die Netzhaut optimiert ist, und der Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie besteht. Die Schritte Probenvorbereitung, optische Gewebereinigung, Lichtblattmikroskopie und Bildverarbeitung werden im Folgenden beschrieben.

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Protokoll

Alle Versuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Texas Medical Branch genehmigt. Die Verwendung und Pflege der Tiere erfolgte in Übereinstimmung mit der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung. Alle Materialien, die für die Durchführung dieses Verfahrens erforderlich sind, sind in der Materialtabelle aufgeführt. Tragen Sie bei jedem Schritt puderfreie Handschuhe. Die Schritte 6 und 7 finden Sie auch in der offiziellen Bedienungsanleitung des Mikroskops.

1. Vorbereitung der Tiere

1. Euthanasieren Sie die Versuchsmäuse in Übereinstimmung mit dem anwendbaren, vom Institutional Animal Care and Use Committee genehmigten Protokoll (hier wurde eine Anästhesie mit einer Kombination aus Ketamin 60 mg/kg und Dexmedetomidin 0,5 mg/kg gefolgt von einer Zervixluxation verwendet). Fahren Sie sofort mit der Stabilisierung des Tieres auf einer Plattform für die Dissektion und Herzperfusion fort.
   HINWEIS: Die Versuchstiere werden auf der Grundlage des Designs der Einzelstudie ausgewählt.
2. Präparieren Sie den Bauch und den Thorax, um das Herz freizulegen. Führen Sie eine Herzperfusion durch, indem Sie das Herz über eine 27-G-Nadel transfundieren, die in den linken Ventrikel platziert wird, und erstellen Sie einen kleinen (~1 mm) Schnitt im rechten Vorhof, um den Austritt von Blut^{zu ermöglichen 24}.
   1. Transfundieren Sie zunächst 30–50 ml eiskalte, phosphatbalancierte Kochsalzlösung (PBS) und dann 30–50 ml frisch zubereitetes 4%iges Paraformaldehyd (PFA).
   2. Um eine erfolgreiche PFA-Transfusion zu überprüfen, überprüfen Sie auf sichtbare Muskelzuckungen im gesamten Körper und Schwanz. Fahren Sie mit dem Enukleationsschritt fort.

2. Enukleation und Fixierung des Augapfels

1. Schiebe mit einer gebogenen Juwelierzange sanft über das obere oder untere Augenlid, um den Augapfel aus seiner Augenhöhle zu drücken. Verwenden Sie eine andere Juwelierzange oder eine ähnliche Pinzette, um die Bindehaut von der Seite zu punktieren und halten Sie die Kugel von der Seite des Sehnervs fest. Heben Sie die Kugel langsam aus ihrer Steckdose, bis sie vom Sehnerv getrennt ist.
2. Füllen Sie den Globus in ein Röhrchen mit frisch zubereitetem, eiskaltem 4% PFA. Beschriften Sie die Tube entsprechend. Lassen Sie den Globus 12 h (über Nacht) in einem 4 % PFA Kühlschrank bei 4 °C bleiben.
   HINWEIS: Verwenden Sie eine Kunststoff-Transferpipette mit einer abgeschnittenen Spitze, um den Globus zu übertragen. Erweitern Sie die Öffnung der abgeschnittenen Spitze mit einer zweiten Pipettenspitze, um eine Beschädigung der Probe durch scharfe Kanten zu vermeiden.

3. Zerlegung der Probe (Abbildung 1 und Abbildung 2)

1. Lokalisieren Sie unter einem Stereomikroskop den Hornhaut-Sklera-Übergang (Abbildung 1A) und verwenden Sie die scharfe Schneidspitze einer 30-G-Nadel, um einen sehr oberflächlichen Schnitt an der Sklera etwa 0,5 bis 1 mm hinter dem Hornhaut-Sklera-Übergang zu machen (Abbildung 1B).
2. Schieben Sie eine der Klingen einer Präparierschere mit scharfer Spitze durch den Schnitt, der gerade gemacht wurde, in den potenziellen Raum zwischen Sklera/Aderhaut/RPE und Netzhaut (Abbildung 1C). Schieben Sie die Schere vor und schneiden Sie umlaufend, bis sich die Sklera/Aderhaut/RPE von der äußeren Oberfläche der Netzhaut ablösen lässt (Abbildung 1D,E).
   HINWEIS: Es ist wichtig, diesen Schritt langsam und sanft durchzuführen, um eine Punktion der Netzhaut zu vermeiden. Die ersten Schnitte sind besonders wichtig, um einen Schnitt durch die Netzhaut zu vermeiden.
3. Machen Sie bei Bedarf radiale entspannende Schnitte an der Sklera/Aderhaut/RPE, um den Prozess des Umfangsschnitts und das anschließende Schälen des Sehnervs und der Sklera/Aderhaut/RPE zu erleichtern. Entfernen Sie kleine RPE-Flecken (Abbildung 1F) mit einem in PBS getränkten Malpinsel der Größe 1.
4. Übertragen Sie den gesamten intakten Augapfel in ein Röhrchen, das PBS enthält. Fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort oder bewahren Sie sie für die Immunmarkierung bei 4 °C auf.
   HINWEIS: Markierungen können nach der Enukleation und dann nach der Dissektion auf dem Augapfel platziert werden, um die Ausrichtung des Auges bei Bedarf zu erhalten. Das Protokoll kann hier pausiert werden, und die Proben können über Nacht in einem 4 °C-Kühlschrank aufbewahrt werden, bevor mit den nächsten Schritten fortgefahren wird.

4. Gefäßfärbung

1. Permeabilisieren Sie das Gewebe, indem Sie es 20 Minuten lang bei Raumtemperatur in PBS mit 0,2 % Tween-20 eintauchen.
2. Waschen Sie die Probe 3 Mal mit PBS auf einem Shaker für 10 Minuten.
3. Die Probe wird 1 h lang mit 5 % normalem Ziegenserum (NGS) in PBS mit 0,25 % Triton X-100 bei Raumtemperatur inkubiert.
4. Inkubieren Sie mit dem Primärantikörper bei 4 °C über Nacht. Hier wurde ein Anti-Maus-Kollagen-IV-Antikörper verwendet (die Endkonzentration wurde in PBS mit 0,2 % Tween-20 hergestellt).
5. 3 Mal mit PBS waschen, 5 Minuten pro Wäsche.
6. Inkubieren Sie die Probe mit fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörpern. Hier wurde ein Anti-Kaninchen-Alexa Fluor 568 für 12 h bei 4 °C verwendet (1:200 Verdünnung in PBS mit 0,2 % Tween-20).
7. Waschen Sie sich 3 Mal jeweils 1 Stunde lang mit PBS und fahren Sie dann mit den Schritten zur Reinigung des Gewebes fort.

5. Optisches Clearing mit 2,2"-Thiodiethanol (TDE)

1. Bereiten Sie Arbeits-TDE-Konzentrationen unter Verwendung von TDE-Stammlösung mit PBS für eine Endkonzentration von 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 % und 60 Vol.-% (v/v) vor. Bereiten Sie mindestens 2 ml Lösung für jede Augenprobe vor, damit genügend überschüssiges Volumen in das Gewebe eindringen kann.
2. Inkubieren Sie die Proben in einer 6- oder 12-Well-Plattenvertiefung bei steigender TDE-Konzentration. Beginnen Sie damit, die intakten ganzen Augäpfel 2–4 Stunden lang in 10%iger TDE-Lösung auf einem Shaker bei Raumtemperatur zu tauchen. Übertragen Sie die Probe nacheinander für 2–4 Stunden in jeder TDE-Konzentration auf eine höhere TDE-Konzentration (Abbildung 2C).
   HINWEIS: Die Netzhaut beginnt bei Konzentrationen von 40 % bis 50 % zu reinigen, aber die maximale Reinigung erfolgt nach der Inkubation in einer 60%igen Lösung. Die Netzhaut wird bei Konzentrationen von 70 % und mehr weniger transparent (Abbildung 2D).
3. Stoppen Sie den Clearing-Vorgang bei Bedarf über Nacht bei einem der aufeinanderfolgenden Clearing-Exchange-Schritte.

6. Bildgebung des ganzen Auges mit einer Lichtblattmikroskopie

1. Montieren Sie die intakten Ganzaugenproben unter Berücksichtigung der Konfiguration der verwendeten Lichtblattmikroskop-Plattform. Befolgen Sie die Anweisungen in der Mikroskop- und Erfassungssoftware, um die Erfassungsparameter einschließlich der Ausrichtung des Lichtblatts sowie der Beleuchtung und Erkennung von Strahlengängen einzurichten.
   HINWEIS: Die in diesem Experiment verwendeten Proben wurden von der Hornhautseite auf die Spitze einer Injektionsnadel auf einer Insulinspritze geklebt (Abbildung 2E). Die Probe wurde dann in der Mikroskopkammer aufgehängt.
2. Füllen Sie die Mikroskopkammer mit 60% TDE als Reinigungslösung.
3. Tauchen Sie die Probe in die Kammer des Lichtblattmikroskops in 60%ige TDE-Lösung (die endgültige Clearing-Konzentration).
4. Bilden Sie das gereinigte Auge mit einer Vielzahl von kommerziellen oder speziell angefertigten Konfokal- und Lichtblattmikroskopen ab. In diesem Protokoll wird ein beidseitig beleuchtetes Lichtblattmikroskop verwendet.
5. Verwenden Sie Bildgebung mit niedriger Auflösung und geringer Vergrößerung (5x, NA 0,16), um die zelluläre Morphologie und die zelluläre Prozessverfolgung abzubilden, insbesondere in Kombination mit Kacheln. Verwenden Sie hochauflösende Bildgebung mit Vergrößerung (20x, NA 1,0), um sowohl die zelluläre Morphologie als auch große subzelluläre Organellen wie Zellkerne und mitochondriale Cluster abzubilden.

7. Bildverarbeitung nach der Aufnahme

HINWEIS: Die Verarbeitung nach der Erfassung hängt vom Dateityp und der Software ab, die mit den abgebildeten Dateien kompatibel ist.

1. Wenden Sie Unschärfe oder Entfaltung an, um die Rohbilder weiter zu verbessern, bevor Sie die bebilderten Kacheln zusammenfügen. Ein Weiner-Filter kann angewendet werden, um die Bilder unscharf zu machen. Alternativ können Bilder nach dem Entrauschen mit der Richardson-Lucy-Dekonvolution und einer theoretisch oder experimentell gemessenen PSF iterativ dekonvolviert werden, indem Modellierungswerkzeuge wie das ImageJ PSF-Generator-Plugin²⁵ verwendet werden.
2. Führen Sie das Stitching von vorverarbeiteten Z-Stacks und eine affine und nicht-starre Volumentransformation durch, gefolgt von Multi-View-Volumenregistrierung und -fusion mit einer Vielzahl von kommerziellen oder gemeinfreien Softwarepaketen (ImageJ – BigStitcher-Plugin)²⁶.

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Ergebnisse

Eine Nullwinkelprojektion des peripapillären Gefäßnetzwerks und der Mikroglia ist in Abbildung 3A dargestellt. Auch die intakte Verteilung der gesamten Retina-Mikroglia in einer CX3CR1-GFP-Maus ist in Abbildung 3B dargestellt. Ein großer Vorteil der hier vorgestellten Methode ist ihre Fähigkeit, angeborene Fluorophore abzubilden. Abbildung 3C,D zeigen Mikroglia in re...

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Diskussion

Die Entwicklung und Pathologien der Netzhaut und des Glaskörpers werden am besten mit intakten Bildgebungsverfahren der gesamten Netzhaut untersucht, bei denen die Netzhaut nicht für Schnitte oder für Flat-Mount-Präparationen geschnitten wird. Bestehende bildgebende Verfahren für intakte ganze Augen beinhalten entweder das Pigmentbleichen, bei dem angeborene Fluorophore entfernt werden, oder die physikalische Entfernung der undurchsichtigen Beschichtungen des Augapfels (RPE, Aderhau...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Experimental animal
CX3CR1-GFP Mouse	The Jackson Laboratory	5582
Anesthetic
Dexmedetomidine	Par Pharmaceutical	42023-146-25
Ketamine	Fresenius Kabi
Tissue harvesting, fixation, and sample dissection
cardiac perfusion pump	Fisher scientific	NC9069235
Cyanoacrylate superglue	amazon.com
Fine scissors-sharp	Fine Science Tools	14160-10
Fine tweezers	Fine Science Tools	11412-11
Paraformaldehyde (PFA)	Electrone microscopy sciences	15710-S
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	10010049
size 1 painting brush	dickblick.com
straight spring scissors	Fine Science Tools	15000-03
syringe, needle tip, 27 gauge x 1.25"	BD
Tubes 1.5 ml, 15 ml, 50 ml	Thermo sceintific
Tween-20	ThermoFisher	85114
Immunofluorescent staining
Anti-mouse collagen IV antibody	Abcam	ab19808	1:200 dilution
Anti-rabbit Alexa Fluor 568	Invitreogen	A-11011	1:200 dilution
Normal goat serum	ThermoFisher	50062Z	10% concentration
Tissue clearing
2,2′-thiodiethanol (TDE)	Fluka analytica	STBD7772V
Rocking shaker	Fisher scientific	02-217-765
Microscopy
Fluorescent microspheres	TetraSpeck	T14792
Light sheet fluorescent microscope (LSFM)	Zeiss	Z1
Microglia enumeration
ImageJ	National Institue of Health