고해상도의 온전한 전체 망막 및 유리체 이미징을 위한 Microsurgical Dissection and Tissue Clearing

요약

여기에 제시된 프로토콜은 안구의 외부 불투명층/착색층을 수술로 제거하고, 광학적 투명화를 적용하여 망막을 투명하게 만들어 광시트 형광 현미경을 사용하여 온전한 망막의 주변 망막과 히알로이드 혈관 구조를 시각화할 수 있도록 하는 온전한 망막 이미징을 위한 프로토콜입니다.

초록

생리학적 및 병리학적 조건에서 망막의 신경 및 혈관 구조는 기존의 망막 플랫 마운트 제제 및 절편과 비교하여 온전한 전체 망막 이미징 기술을 사용하여 더 잘 시각화하고 특성화할 수 있습니다. 그러나 온전한 망막의 면역형광 이미징은 안구의 불투명한 코팅, 즉 공막, 맥락막, 망막 색소 상피(RPE)와 전체 두께의 고해상도 광학 이미징을 방해하는 망막층의 광 산란 특성으로 인해 방해를 받습니다. 이러한 장애물을 해결하기 위해 색소 층의 화학적 표백 및 조직 제거 프로토콜이 설명되었습니다. 그러나 현재 설명된 방법은 손상되지 않은 전체 망막에서 녹색 형광 단백질(GFP)과 같은 내인성 형광 분자를 이미징하는 데 적합하지 않습니다. 다른 접근법은 색소층과 안구의 앞쪽 부분을 외과적으로 제거하여 이러한 제한을 우회하여 주변 망막과 히알로이드 구조가 파괴되었음에도 불구하고 온전한 눈 이미징을 가능하게 했습니다. 여기에 제시된 것은 공막/맥락막/망막 색소 상피(RPE) 층의 외과적 박리와 변형된 조직 투명화 방법 및 광시트 형광 현미경(LSFM)을 결합한 손상되지 않은 전체 망막 및 유리체 면역 형광 이미징 프로토콜입니다. 이 새로운 접근법은 병리학적 조건에서 망막의 교란되지 않은 혈관 및 신경 요소뿐만 아니라 유리체 및 히알로이드 혈관 시스템에 대한 전례 없는 관점을 제공합니다.

서문

건강한 상태와 질병 상태에서 망막, 신경 세포, 혈관 요소 간의 상호 작용은 전통적으로 파라핀 또는 극저온 고정 망막 조직의 물리적 부분 또는 망막 편평한 제제에 대한 면역 형광 연구를 통해 탐구되어 왔습니다¹. 그러나 조직 절편은 망막 신경 세포와 혈관 연속성을 방해하며, 인접한 망막 절편의 3차원 재건이 가능한 해결책으로 제안되고 있지만 여전히 오류와 아티팩트의 여지가 있습니다. Retina flat mount 제제는 또한 망막 혈관 및 신경 요소의 무결성과 인접한 망막 영역 간의 지리적 연결을 현저하게 방해합니다². 대안적으로, 자연적인 해부학적 위치에서 망막, 신경 및 혈관 구성 요소의 3차원 투영을 시각화하기 위해 최근에 온전한 전체 망막 이미징이 도입되었습니다 ^2,3,4,5.

온전한 전체 망막 이미징에서, 온전한 전체 망막의 인접한 망막 영역(타일)의 혈관 및 신경 요소에서 나오는 형광 신호는 광시트 현미경을 사용하여 캡처됩니다. 그런 다음 이 타일을 함께 "스티치"하여 전체 망막 ^2,3,4,5,6의 3차원 보기를 재구성합니다. 온전한 전체 망막 영상은 망막 혈관, 퇴행성 및 염증성 질환의 발병 기전을 연구하기 위해 망막에 대한 전례 없는 관점을 제공합니다 ^2,3,4,5,6. 예를 들어, Prahst 등은 손상되지 않은 전체 망막²의 실시간 이미징을 사용하여 산소 유도 망막병증(OIR) 모델에서 병리학적 혈관 다발, 비정상적인 세포 운동성 및 변경된 필로포디아 역학에 대한 이전에 "인정되지 않은" 매듭 형태를 밝혔습니다. 마찬가지로, Henning et al., Singh et al., and Chang et al.은 온전한 전체 망막에서 복잡한 3차원 망막 혈관 네트워크를 입증했습니다 ^3,4,6. Vigouroux 등은 온전한 전안 이미징 방법을 사용하여 주산기⁵의 망막 구조와 시각적 투영을 보여주었습니다. 망막에 대한 이처럼 비교할 수 없는 3차원 뷰를 생성하기 위해, 온전한 전체 망막 이미징 프로토콜은 두 가지 주요 한계를 극복했습니다: 1) 안구(공막, 맥락막 및 RPE)의 불투명 및 착색 코팅의 존재와 2) 망막 핵층 및 망상층의 광 산란 특성으로 인한 전체 망막 두께를 통한 빛의 제한된 투과. Henning et al. 및 Vigouroux et al.은 온전한 망막 ^3,5를 이미지화할 수 있도록 맥락막/RPE 색소의 H 2 O 2 표백을 적용했습니다. 그러나 표백은 녹색 형광 단백질(GFP)과 같은 내인성 형광단이 있는 동물 균주 또는 생체 내 면역 형광 염색 후 동물 균주에 적합하지 않습니다 ^3,5,7. 또한, Henning 등의_H2O2처리 방법은 망막 박리를 유발하는 미세 기포를 생성할 수 있는 수성 조건에서 수행되었습니다. 더욱이,_H2O2처리는 55°C에서 시행하였는데, 이는 조직 항체 친화성을 더욱 악화시키는 조건이다. 또한, 표백은 산화된 멜라닌⁸에서 비롯된 무거운 자가형광을 유발할 수 있습니다. 과망간산칼륨과 옥살산을 사용하는 눈 부위에 대한 다른 탈색소 프로토콜은 배아 절편에서 RPE 색소를 제거할 수 있었지만 이 탈색소 역시 면역 표지의 효능을 감소시키는 것으로 나타났습니다 ^9,10. 백화 현상의 대안으로, Prahst et al., Singh et al., and Chang et al.은 공막과 맥락막, 각막을 제거하여 망막 전체가 현미경 빛에 도달할 수 있도록 했습니다 ^2,4,6. 그러나 각막, 수정체 및 주변 망막을 제거하면 주변 망막과 히알로이드 혈관이 왜곡되고 파괴될 수 있으므로 이러한 방법은 말초 망막 및 히알로이드 혈관 구조를 연구하는 데 적합하지 않습니다.

현재 사용 가능한 모든 온전한 전체 눈 이미징 프로토콜에는 망막층의 광 산란 특성을 극복하기 위한 조직 광학 투명화 단계의 사용이 포함됩니다 ^2,3,4,5. 조직 광학 투명화(tissue optical clearing)는 빛의 산란과 흡수를 최소화하기 위해 주어진 조직(여기서는 망막)의 굴절률을 모든 세포 및 세포 간 요소에 걸쳐 균등화함으로써 망막을 현미경 빛에 투명하게 만듭니다¹¹. 안구의 색소 코팅(맥락막 및 RPE)을 충분히 제거할 수 없으므로 맥락막과 RPE는 안구의 색소 코팅(맥락막과 RPE)을 충분히 제거할 수 없으므로 망막에 조직 광학 투명화를 적용하기 전에 제거하거나 표백해야 합니다 6,12,13,14,15,16,17,18.

미숙아 망막병증(retinopathy of prematurity, ROP), 지속성 태아 혈관 구조(persistent fetal vasculature, PFV), 노리병(Norrie Disease), 스티클러병(Stickler Disease)과 같은 병리학적 질환에서 유리체 및 히알로이드 혈관계의 참여와 기여는 조직 준비 과정에서 망막과 히알로이드 혈관이 파괴되지 않을 때 가장 잘 연구될 수 있다 19,20,21,22,23. 온전한 전체 망막 이미징을 위한 기존 방법은 유리체와 혈관 구조를 자연적으로 파괴하는 눈의 앞쪽 부분을 제거하거나 내인성 형광단을 제거할 수 있는 표백제를 적용하는 것입니다. 유리체와 혈관 구조를 온전하고 손대지 않은 상태로 시각화하기 위한 발표된 방법은 부족합니다. 여기에서는 안구의 색소 및 불투명 코팅에 대한 외과적 박리, 망막에 최적화된 변형 조직 광학 투명화 및 광시트 형광 현미경 검사로 구성된 전체 망막 및 유리체 이미징 방법에 대해 설명합니다. 샘플 준비, 조직 광학 투명화, 광시트 현미경 검사 및 이미지 처리 단계는 아래에 자세히 설명되어 있습니다.

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프로토콜

모든 실험은 텍사스 대학교 의과 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다. 동물 사용 및 관리는 안과 및 시력 연구에서 동물 사용에 대한 ARVO(Association for Research in Vision and Ophthalmology)의 성명에 따랐습니다. 이 절차를 수행하는 데 필요한 모든 자료는 재료 표에 나열되어 있습니다. 각 단계를 수행하는 동안 가루가 없는 장갑을 착용하십시오. 6단계와 7단계는 공식 현미경 사용 설명서도 참조하십시오.

1. 동물의 준비

1. 해당 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 승인한 프로토콜(케타민 60mg/kg과 덱스메데토미딘 0.5mg/kg을 조합한 마취 후 자궁경부 탈구가 사용됨)에 따라 실험용 마우스를 안락사시킵니다. 즉시 박리 및 심장 관류를 위한 플랫폼에서 동물을 안정화하는 작업을 진행하십시오.
   참고: 실험 동물은 개별 연구의 설계에 따라 선택됩니다.
2. 복부와 흉부를 절개하여 심장을 드러냅니다. 좌심실에 삽입된 27G 바늘을 통해 심장을 수혈하여 심장 관류를 수행하고 우심방에 작은(~1mm) 절개를 만들어 혈액이 배출될 수 있도록 합니다²⁴.
   1. 먼저 30-50mL의 얼음처럼 차가운 인산염 균형 식염수(PBS)를 수주입한 다음 갓 준비한 4% 파라포름알데히드(PFA) 30-50mL를 수혈합니다.
   2. 성공적인 PFA 수혈을 확인하려면 몸과 꼬리 전체에 눈에 띄는 근육 경련이 있는지 확인하십시오. 적출 단계를 진행한다.

2. 안구 적출 및 고정

1. 곡선형 보석상의 집게를 사용하여 위쪽 또는 아래쪽 눈꺼풀을 부드럽게 밀어 안구에서 안구를 빼냅니다. 다른 보석 세공 또는 이와 유사한 집게 세트를 사용하여 측면에서 결막에 구멍을 뚫고 시신경 쪽에서 지구본을 잡습니다. 시신경에서 절단될 때까지 소켓에서 지구본을 천천히 들어 올립니다.
2. 갓 준비한 얼음처럼 차가운 4% PFA가 들어 있는 튜브에 글로브를 옮깁니다. 그에 따라 튜브에 레이블을 지정합니다. 지구본을 4°C 냉장고에서 4°C 냉장고에서 4시간(밤새) 동안 12% PFA로 유지합니다.
   알림: 절단 팁이 있는 플라스틱 전사 피펫을 사용하여 글로브를 전사합니다. 두 번째 피펫 팁으로 절단 팁의 개구부를 넓혀 날카로운 모서리로 샘플이 손상되지 않도록 합니다.

3. 샘플 해부 (그림 1 및 그림 2)

1. 실체현미경으로 각막-공막 접합부(그림 1A)를 찾고, 30G 바늘의 날카로운 절단 끝을 사용하여 각막-공막 접합부 약 0.5-1mm 뒤에 있는 공막을 매우 표면적으로 절단합니다(그림 1B).
2. 공막/맥락막/RPE와 망막 사이의 잠재적 공간으로 방금 만들어진 절개 부위를 통해 날카로운 끝 절개 가위의 날 중 하나를 전진시킵니다(그림 1C). 가위를 전진시키고 공막/맥락막/RPE가 망막의 외부 표면에서 벗겨질 수 있을 때까지 원주방향으로 자릅니다(그림 1D,E).
   알림: 망막에 구멍이 나지 않도록 이 단계를 천천히 부드럽게 수행하는 것이 중요합니다. 처음 몇 군데의 절개는 망막을 절단하지 않기 위해 특히 중요합니다.
3. 필요한 경우 공막/맥락막/RPE를 방사형으로 이완하여 원주 절단 과정과 시신경 및 공막/맥락막/RPE의 박리 과정을 용이하게 합니다. PBS에 적신 크기 1 페인팅 브러시를 사용하여 RPE의 작은 패치(그림 1F)를 제거합니다.
4. 손상되지 않은 안구 전체를 PBS가 들어 있는 튜브로 옮깁니다. 즉시 다음 단계를 진행하거나 면역 라벨링을 위해 4°C에서 보존합니다.
   참고: 적출 후 안구에 표시를 한 다음 필요한 경우 눈의 방향을 보존하기 위해 해부 후에 배치할 수 있습니다. 여기서 프로토콜은 일시 중지될 수 있으며, 샘플은 다음 단계로 진행하기 전에 4°C 냉장고에서 밤새 보존될 수 있습니다.

4. 혈관 염색

1. 실온에서 0.2% Tween-20이 함유된 PBS에 20분 동안 조직을 침지하여 투과시킵니다.
2. PBS로 샘플을 셰이커에서 10분 동안 3회 세척합니다.
3. 0.25% Triton X-100을 함유한 PBS에 5% 일반 염소 혈청(NGS)을 함유한 샘플을 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
4. 1차 항체와 함께 4°C에서 밤새 배양합니다. 여기에서는 항-마우스 콜라겐 IV 항체를 사용하였다(최종 농도는 0.2% Tween-20을 함유하는 PBS에서 제조하였다).
5. PBS로 3회 세탁하여 한 번에 5분 동안 세탁합니다.
6. 검체를 형광 표지된 2차 항체로 배양합니다. 여기서, 토끼 퇴치제인 Alexa Fluor 568을 4°C에서 12시간 동안 사용했습니다(0.2% Tween-20을 함유하는 PBS에서 1:200 희석).
7. PBS로 각각 3시간씩 1회 세척한 다음 조직 세척 단계를 진행합니다.

5. 2,2'-티오디에탄올(TDE)을 사용한 광학 클리어링

1. 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 및 60% 부피 대 부피(v/v)의 최종 농도에 대해 PBS와 함께 스톡 TDE 용액을 사용하여 작업 TDE 농도를 준비합니다. 조직을 관통하기에 충분한 부피가 충분할 수 있도록 각 눈 샘플에 대해 최소 2mL의 용액을 준비합니다.
2. TDE의 농도를 증가시키기 위해 6 또는 12 웰 플레이트 웰에서 샘플을 배양하십시오. 온전한 안구 전체를 10% TDE 용액에 실온의 셰이커에서 2-4시간 동안 담그는 것으로 시작합니다. 연속적으로, 각 TDE 농도에서 2-4시간 동안 샘플을 더 높은 TDE 농도로 옮깁니다(그림 2C).
   참고: 망막은 40%–50%의 농도에서 세척을 시작하지만 60% 용액에서 배양 후 최대 세척이 발생합니다. 망막은 농도가 70% 이상일 경우 투명도가 떨어집니다(그림 2D).
3. 필요한 경우 연속적인 청산 교환 단계 중 하나에서 하룻밤 동안 청산 프로세스를 중지하십시오.

6. 광시트 현미경을 사용한 전체 눈 이미징

1. 사용 중인 광시트 현미경 플랫폼의 구성을 고려하여 온전한 전체 눈 샘플을 장착합니다. 현미경 및 획득 소프트웨어 지침에 따라 광 시트 정렬, 광학 경로의 조명 및 감지를 포함한 획득 매개변수를 설정합니다.
   참고: 이 실험에 사용된 샘플은 인슐린 주사기의 각막 쪽에서 피하 주사 바늘 끝까지 접착되었습니다(그림 2E). 그런 다음 샘플을 현미경 챔버 내부에 매달아 놓았습니다.
2. 현미경 챔버를 투명화 용액으로 60% TDE로 채웁니다.
3. 광시트 현미경 챔버 내의 샘플을 60% TDE 용액(최종 투명화 농도)에 담급니다.
4. 다양한 상업용 또는 맞춤형 컨포칼 및 광시트 현미경을 사용하여 선명한 눈을 이미지화합니다. 이 프로토콜에서는 양면 조명 광시트 현미경이 사용됩니다.
5. 저해상도 및 저배율 이미징(5x, NA 0.16)을 사용하여 특히 타일링과 결합할 때 세포 형태 및 세포 프로세스 추적을 이미지화합니다. 고해상도 및 확대 이미징(20x, NA 1.0)을 사용하여 세포 형태와 핵 및 미토콘드리아 클러스터와 같은 큰 세포 내 소기관을 모두 이미징합니다.

7. 취득 후 이미지 처리

참고: 획득 후 처리는 이미징된 파일과 호환되는 파일 및 소프트웨어의 유형에 따라 다릅니다.

1. 디블러링 또는 디콘볼루션을 적용하여 이미지화된 타일을 스티칭하기 전에 원시 이미지를 더욱 보강합니다. Weiner 필터를 적용하여 이미지의 흐림을 제거할 수 있습니다. 또는 ImageJ PSF 생성기 플러그인²⁵와 같은 모델링 도구를 사용하여 Richardson-Lucy 디콘볼루션 및 이론적 또는 실험적으로 측정된 PSF로 노이즈 제거한 후 이미지를 반복적으로 디콘볼루션할 수 있습니다.
2. 사전 처리된 z-스택의 스티칭과 아핀 및 비강성 볼륨 변환을 수행한 후 다양한 상용 또는 공용 도메인 소프트웨어 패키지(ImageJ – BigStitcher 플러그인)를 사용하여 멀티뷰 볼륨 등록 및 융합을 수행합니다²⁶.

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결과

유두주위 혈관 네트워크와 미세아교세포의 제로 각도 투영이 그림 3A에 나와 있습니다. 또한 CX3CR1-GFP 마우스의 온전한 전체 망막 미세아교세포 분포가 그림 3B에 나와 있습니다. 여기에 제시된 방법의 주요 장점은 선천성 형광단을 이미지화할 수 있다는 것입니다. 그림 3C,D는 현재의 ?...

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토론

망막과 유리체 발달 및 병리학은 절편이나 플랫 마운트 준비를 위해 망막을 절단하지 않는 온전한 전체 망막 이미징 기술로 가장 잘 연구됩니다. 기존의 온전한 전안 이미징 방법은 선천적 형광단을 제거하는 색소 표백을 통합하거나 주변 망막과 유리체를 방해할 수 있는 안구 전안부와 함께 안구의 불투명한 코팅(RPE, 맥락막 및 공막)을 물리적으로 제거하는 것입니다. Ch...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Experimental animal
CX3CR1-GFP Mouse	The Jackson Laboratory	5582
Anesthetic
Dexmedetomidine	Par Pharmaceutical	42023-146-25
Ketamine	Fresenius Kabi
Tissue harvesting, fixation, and sample dissection
cardiac perfusion pump	Fisher scientific	NC9069235
Cyanoacrylate superglue	amazon.com
Fine scissors-sharp	Fine Science Tools	14160-10
Fine tweezers	Fine Science Tools	11412-11
Paraformaldehyde (PFA)	Electrone microscopy sciences	15710-S
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	10010049
size 1 painting brush	dickblick.com
straight spring scissors	Fine Science Tools	15000-03
syringe, needle tip, 27 gauge x 1.25"	BD
Tubes 1.5 ml, 15 ml, 50 ml	Thermo sceintific
Tween-20	ThermoFisher	85114
Immunofluorescent staining
Anti-mouse collagen IV antibody	Abcam	ab19808	1:200 dilution
Anti-rabbit Alexa Fluor 568	Invitreogen	A-11011	1:200 dilution
Normal goat serum	ThermoFisher	50062Z	10% concentration
Tissue clearing
2,2′-thiodiethanol (TDE)	Fluka analytica	STBD7772V
Rocking shaker	Fisher scientific	02-217-765
Microscopy
Fluorescent microspheres	TetraSpeck	T14792
Light sheet fluorescent microscope (LSFM)	Zeiss	Z1
Microglia enumeration
ImageJ	National Institue of Health