Dissecção microcirúrgica e limpeza de tecidos para imagens de retina inteira e vítreo intactas de alta resolução

Resumo

Apresentado aqui é um protocolo para imagem de retina inteira intacta em que as camadas externas opacas / pigmentadas do globo ocular são removidas cirurgicamente e a limpeza óptica é aplicada para tornar a retina transparente, permitindo a visualização da retina periférica e da vasculatura hialóide na retina intacta usando microscopia fluorescente de folha de luz.

Resumo

As estruturas neuronais e vasculares da retina em condições fisiológicas e patológicas podem ser melhor visualizadas e caracterizadas usando técnicas de imagem de retina inteira intacta em comparação com as preparações e cortes convencionais de montagem plana da retina. No entanto, a imagem imunofluorescente de toda a retina intacta é prejudicada pelos revestimentos opacos do globo ocular, ou seja, esclera, coroide e epitélio pigmentar da retina (EPR) e pelas propriedades de dispersão de luz das camadas da retina que impedem imagens ópticas de alta resolução de espessura total. O branqueamento químico das camadas pigmentadas e os protocolos de limpeza de tecidos foram descritos para resolver esses obstáculos; no entanto, os métodos atualmente descritos não são adequados para imagens de moléculas fluorescentes endógenas, como a proteína fluorescente verde (GFP) em toda a retina intacta. Outras abordagens contornaram essa limitação pela remoção cirúrgica das camadas pigmentadas e do segmento anterior do globo ocular, permitindo imagens oculares intactas, embora a retina periférica e as estruturas hialóides tenham sido interrompidas. Apresentamos aqui um protocolo de imagem imunofluorescente de retina inteira intacta e vítreo que combina dissecção cirúrgica das camadas de esclera / coróide / epitélio pigmentar da retina (RPE) com um método de limpeza de tecido modificado e microscopia fluorescente de folha de luz (LSFM). A nova abordagem oferece uma visão sem precedentes dos elementos vasculares e neuronais não perturbados da retina, bem como do sistema vascular vítreo e hialoide em condições patológicas.

Introdução

A interação entre os elementos neuronais e vasculares da retina em estados saudáveis e de doença é tradicionalmente explorada por estudos de imunofluorescência em seções físicas de tecido de retina fixado em parafina ou crio-fixada ou em preparações planas de retina¹. No entanto, a secção de tecido interrompe a continuidade neuronal e vascular da retina e, embora a reconstrução tridimensional das seções adjacentes da retina seja sugerida como uma possível solução, ela ainda está sujeita a erros e artefatos. As preparações de montagem plana da retina também perturbam acentuadamente a integridade dos elementos vasculares e neuronais da retina e a conexão geográfica entre as áreas retinianas adjacentes². Alternativamente, a imagem de retina inteira intacta foi recentemente introduzida para visualizar as projeções tridimensionais dos componentes neuronais e vasculares da retina em sua posição anatômica natural 2,3,4,5.

Na imagem de retina inteira intacta, os sinais fluorescentes dos elementos vasculares e neuronais das áreas adjacentes da retina (telhas) de uma retina inteira intacta são capturados usando um microscópio de folha de luz; Esses ladrilhos são então "costurados" para reconstruir uma visão tridimensional de toda a retina 2,3,4,5,6. A imagem de retina inteira intacta fornece uma visão sem precedentes da retina para estudar a patogênese das doenças vasculares, degenerativas e inflamatórias da retina 2,3,4,5,6. Por exemplo, Prahst et al. revelaram uma morfologia de nó anteriormente "não apreciada" para tufos vasculares patológicos, motilidade celular anormal e dinâmica de filopódios alterada em um modelo de retinopatia induzida por oxigênio (OIR) usando imagens ao vivo de uma retina inteira intacta². Da mesma forma, Henning et al., Singh et al. e Chang et al. demonstraram a complexa rede vascular tridimensional da retina em retinas inteiras intactas ^3,4,6. Vigouroux et al. usaram um método de imagem de olho inteiro intacto para mostrar a organização da retina e as projeções visuais no período perinatal⁵. Para poder criar visualizações tridimensionais incomparáveis da retina, os protocolos de imagem de retina inteira intacta superaram duas limitações principais: 1) a presença de revestimentos opacos e pigmentados do globo ocular (esclera, coróide e EPR) e 2) a penetração limitada da luz através da espessura total da retina causada pelas propriedades de dispersão de luz das camadas nuclear e plexiforme da retina. Henning et al. e Vigouroux et al. aplicaram o clareamento H₂O₂ dos pigmentos coróide/EPR para poder obter imagens de uma retina intacta ^3,5. No entanto, o branqueamento não é adequado para cepas animais com fluoróforos endógenos, como proteína fluorescente verde (GFP) ou após colorações imunofluorescentes in vivo ^3,5,7. Além disso, o método de Henning et al. de tratamento com H₂O₂ foi realizado em condições aquosas que podem gerar microbolhas que resultam em descolamento de retina. Além disso, o tratamento com H₂O₂ foi realizado a 55 °C, uma condição que deteriora ainda mais a afinidade dos anticorpos teciduais. Além disso, o branqueamento pode introduzir autofluorescência pesada originada da melanina oxidada⁸. Outros protocolos de despigmentação para seções oculares usando permanganato de potássio e ácido oxálico foram capazes de remover pigmentos de EPR em cortes embrionários, mas esse método de despigmentação também demonstrou reduzir a eficácia da imunomarcação ^9,10. Como alternativa ao clareamento, Prahst et al., Singh et al. e Chang et al. removeram esclera, coróide e córnea para tornar toda a retina acessível à luz do microscópio ^2,4,6. No entanto, a remoção da córnea, do cristalino e da retina periférica pode distorcer e romper a retina periférica e os vasos hialóides, tornando esses métodos inadequados para estudar a retina periférica e a vasculatura hialóide.

Todos os protocolos de imagem de olho inteiro intactos atualmente disponíveis incluem o uso de uma etapa de limpeza óptica do tecido para superar as propriedades de dispersão de luz das camadas retinianas 2,3,4,5. A limpeza óptica do tecido torna a retina transparente à luz do microscópio, equalizando o índice de refração de um determinado tecido, aqui a retina, em todos os seus elementos celulares e intercelulares para minimizar a dispersão e absorção de luz¹¹. A coroide e o EPR devem ser removidos ou branqueados antes que a limpeza óptica do tecido seja aplicada à retina, pois os revestimentos pigmentados do globo ocular (coróide e EPR) não podem ser suficientemente limpos 6,12,13,14,15,16,17,18.

A participação e as contribuições do sistema vascular vítreo e hialoide em condições patológicas como retinopatia da prematuridade (ROP), vasculatura fetal persistente (VPP), doença de Norrie e doença de Stickler são mais bem estudadas quando a retina e os vasos hialoides não são rompidos na preparação do tecido 19,20,21,22,23. Os métodos existentes para imagens de retina inteira intacta removem o segmento anterior do olho, o que naturalmente interrompe o vítreo e sua vasculatura, ou aplicam agentes clareadores, que podem remover fluoróforos endógenos. Faltam métodos publicados para visualizar o corpo vítreo e a vasculatura em sua condição intacta e intocada. Descrevemos aqui um método de imagem de retina e vítreo completo que consiste na dissecção cirúrgica de revestimentos pigmentados e opacos do globo ocular, uma limpeza óptica de tecido modificada otimizada para retina e microscopia fluorescente de folha de luz. As etapas de preparação de amostras, limpeza óptica de tecidos, microscopia de folha de luz e processamento de imagem são detalhadas abaixo.

Protocolo

Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Divisão Médica da Universidade do Texas (IACUC). O uso e os cuidados com os animais estavam de acordo com a declaração da Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) para o uso de animais em pesquisas oftalmológicas e de visão. Todos os materiais necessários para realizar este procedimento estão listados na Tabela de Materiais. Use luvas sem pó ao executar cada etapa. Para as etapas 6 e 7, consulte também o manual de operação oficial do microscópio.

1. Preparação dos animais

1. Eutanasiar os camundongos experimentais de acordo com o protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais aplicável (anestesia com uma combinação de cetamina 60 mg / kg e dexmedetomidina 0,5 mg / kg seguida de luxação cervical foi usada aqui). Proceda imediatamente à estabilização do animal em uma plataforma para dissecção e perfusão cardíaca.
   NOTA: Os animais experimentais são escolhidos com base no desenho do estudo individual.
2. Disseque o abdômen e o tórax para expor o coração. Realizar a perfusão cardíaca por transfusão do coração através de uma agulha 27 G colocada no ventrículo esquerdo e criar uma pequena incisão (~1 mm) no átrio direito para permitir a saída de sangue²⁴.
   1. Primeiro, transfunda 30-50 mL de solução salina balanceada de fosfato gelado (PBS) e, em seguida, 30-50 mL de paraformaldeído a 4% (PFA) recém-preparado.
   2. Para verificar se há uma transfusão de PFA bem-sucedida, verifique se há espasmos musculares visíveis em todo o corpo e cauda. Prossiga para a etapa de enucleação.

2. Enucleação e fixação do globo ocular

1. Use uma pinça de joalheiro curva para empurrar suavemente a pálpebra superior ou inferior para forçar o globo ocular para fora de sua órbita. Use outro conjunto de pinças de joalheiro ou semelhantes para perfurar a conjuntiva pelo lado e segurar o globo pelo lado do nervo óptico. Levante lentamente o globo de seu encaixe até que seja separado do nervo óptico.
2. Transfira o globo para um tubo contendo PFA 4% gelado recém-preparado. Rotule o tubo de acordo. Deixe o globo permanecer em 4% de PFA em uma geladeira a 4 ° C por 12 h (durante a noite).
   NOTA: Use uma pipeta de transferência de plástico com uma ponta cortada para transferir o globo. Alargue a abertura da ponta cortada com uma segunda ponta de pipeta para evitar danificar a amostra com bordas afiadas.

3. Dissecção da amostra (Figura 1 e Figura 2)

1. Sob um estereomicroscópio, localize a junção córnea-esclera ( Figura 1A ) e use a ponta afiada de corte de uma agulha de 30 G para fazer um corte muito superficial na esclera aproximadamente 0,5 a 1 mm atrás da junção córnea-esclera ( Figura 1B ).
2. Avance uma das lâminas de uma tesoura de dissecação de ponta afiada através da incisão que acabou de ser feita no espaço potencial entre a esclera / coróide / EPR e a retina (Figura 1C). Avance a tesoura e corte circunferencialmente até que a esclera / coróide / EPR possa ser removida da superfície externa da retina (Figura 1D, E).
   NOTA: É importante executar esta etapa lenta e suavemente para evitar perfurar a retina. Os primeiros cortes são particularmente críticos para evitar cortar a retina.
3. Se necessário, faça cortes radiais relaxantes na esclera / coróide / EPR para facilitar o processo de corte circunferencial e a subsequente descamação do nervo óptico e esclera / coróide / EPR. Remova pequenas manchas de EPR (Figura 1F) usando um pincel de pintura tamanho 1 embebido em PBS.
4. Transfira todo o globo ocular intacto para um tubo contendo PBS. Prossiga imediatamente para a próxima etapa ou preserve em 4 ° C para imunomarcação.
   NOTA: As marcas podem ser colocadas no globo ocular após a enucleação e, em seguida, após a dissecção, para preservar a orientação do olho, se necessário. O protocolo pode ser pausado aqui, e as amostras podem ser preservadas durante a noite em uma geladeira a 4 ° C antes de prosseguir para as próximas etapas.

4. Coloração vascular

1. Permeabilize o tecido imergindo-o em PBS contendo 0,2% de Tween-20 em temperatura ambiente por 20 min.
2. Lave a amostra com PBS 3 vezes em uma coqueteleira por 10 min.
3. Incubar a amostra com 5% de soro de cabra normal (NGS) em PBS contendo 0,25% de Triton X-100 à temperatura ambiente por 1 h.
4. Incubar com o anticorpo primário a 4 °C durante a noite. Aqui, um anticorpo anti-colágeno IV de camundongo foi usado (a concentração final foi preparada em PBS contendo 0,2% de Tween-20).
5. Lave 3 vezes com PBS, por 5 min por lavagem.
6. Incube a amostra com anticorpos secundários marcados com fluorescência. Aqui, um Alexa Fluor 568 anti-coelho foi usado por 12 h a 4 ° C (diluição 1: 200 em PBS contendo 0,2% de Tween-20).
7. Lave com PBS 3 vezes, por 1 h cada, e depois prossiga com as etapas de limpeza do tecido.

5. Limpeza óptica com 2,2′-tiodietanol (TDE)

1. Prepare as concentrações de TDE de trabalho usando a solução TDE de estoque com PBS para uma concentração final de 10%, 20%, 30%, 40%, 50% e 60% volume a volume (v/v). Prepare pelo menos 2 mL de solução para cada amostra de olho para permitir que o excesso de volume penetre no tecido.
2. Incubar as amostras em uma placa de 6 ou 12 poços com concentração crescente de TDE. Comece imergindo os globos oculares inteiros intactos em solução TDE a 10% por 2–4 h em um shaker em temperatura ambiente. Sucessivamente, transfira a amostra para uma concentração TDE mais alta por 2–4 h em cada concentração TDE (Figura 2C).
   NOTA: A retina começa a clarear em concentrações de 40% a 50%, mas a clareação máxima ocorre após a incubação em uma solução de 60%. A retina torna-se menos transparente em concentrações de 70% ou mais (Figura 2D).
3. Interrompa o processo de compensação durante a noite, se necessário, em qualquer uma das etapas sucessivas da troca de compensação.

6. Imagem de todo o olho usando uma microscopia de folha de luz

1. Monte as amostras de olho inteiro intactas considerando a configuração da plataforma de microscópio de folha de luz que está sendo usada. Siga as instruções do microscópio e do software de aquisição para configurar os parâmetros de aquisição, incluindo alinhamento da folha de luz e iluminação e detecção de caminhos ópticos.
   NOTA: As amostras utilizadas neste experimento foram coladas do lado da córnea à ponta de uma agulha hipodérmica em uma seringa de insulina (Figura 2E). A amostra foi então suspensa dentro da câmara do microscópio.
2. Encha a câmara do microscópio com TDE a 60% como solução de limpeza.
3. Mergulhe a amostra na câmara do microscópio de folha de luz em solução TDE a 60% (a concentração final de limpeza).
4. Crie imagens do olho limpo por meio de uma variedade de microscópios confocais e de folha de luz comerciais ou personalizados. Neste protocolo, é utilizado um microscópio de folha de luz de iluminação de dupla face.
5. Use imagens de baixa resolução e baixa ampliação (5x, NA 0,16) para obter imagens da morfologia celular e do rastreamento do processo celular, especialmente quando combinadas com ladrilhos. Use imagens de alta resolução e ampliação (20x, NA 1.0) para obter imagens da morfologia celular e de grandes organelas subcelulares, como núcleos e aglomerados mitocondriais.

7. Processamento de imagem pós-aquisição

NOTA: O processamento pós-aquisição depende do tipo de arquivo e software compatível com os arquivos de imagem.

1. Aplique desfoque ou deconvolução para aumentar ainda mais as imagens brutas antes de costurar os blocos de imagem. Um filtro Weiner pode ser aplicado para desfocar as imagens. Alternativamente, as imagens podem ser deconvolvidas iterativamente após a remoção de ruído com a deconvolução de Richardson-Lucy e um PSF medido teórica ou experimentalmente usando ferramentas de modelagem, como o plug-in gerador ImageJ PSF²⁵.
2. Execute a costura de pilhas z pré-processadas e transformações de volume afim e não rígidas, seguidas de registro e fusão de volume de visualização múltipla usando uma variedade de pacotes de software comerciais ou de domínio público (ImageJ – plug-in BigStitcher)²⁶.

Resultados

Uma projeção de ângulo zero da rede vascular peripapilar e da microglia é mostrada na Figura 3A. Além disso, a distribuição intacta de toda a microglia da retina em um camundongo CX3CR1-GFP é apresentada na Figura 3B. Uma grande vantagem do método apresentado aqui é sua capacidade de obter imagens de fluoróforos inatos. A Figura 3C, D mostra a microglia em proj...

Discussão

O desenvolvimento e as patologias da retina e do vítreo são melhor estudados com técnicas de imagem de retina inteira intacta, nas quais a retina não é cortada para cortes ou para preparações de montagem plana. Os métodos de imagem de olho inteiro intactos existentes incorporam clareamento de pigmento, que remove fluoróforos inatos, ou envolvem a remoção física dos revestimentos opacos do globo ocular (EPR, coroide e esclera) junto com o segmento anterior do olho, o que pode ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Experimental animal
CX3CR1-GFP Mouse	The Jackson Laboratory	5582
Anesthetic
Dexmedetomidine	Par Pharmaceutical	42023-146-25
Ketamine	Fresenius Kabi
Tissue harvesting, fixation, and sample dissection
cardiac perfusion pump	Fisher scientific	NC9069235
Cyanoacrylate superglue	amazon.com
Fine scissors-sharp	Fine Science Tools	14160-10
Fine tweezers	Fine Science Tools	11412-11
Paraformaldehyde (PFA)	Electrone microscopy sciences	15710-S
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	10010049
size 1 painting brush	dickblick.com
straight spring scissors	Fine Science Tools	15000-03
syringe, needle tip, 27 gauge x 1.25"	BD
Tubes 1.5 ml, 15 ml, 50 ml	Thermo sceintific
Tween-20	ThermoFisher	85114
Immunofluorescent staining
Anti-mouse collagen IV antibody	Abcam	ab19808	1:200 dilution
Anti-rabbit Alexa Fluor 568	Invitreogen	A-11011	1:200 dilution
Normal goat serum	ThermoFisher	50062Z	10% concentration
Tissue clearing
2,2′-thiodiethanol (TDE)	Fluka analytica	STBD7772V
Rocking shaker	Fisher scientific	02-217-765
Microscopy
Fluorescent microspheres	TetraSpeck	T14792
Light sheet fluorescent microscope (LSFM)	Zeiss	Z1
Microglia enumeration
ImageJ	National Institue of Health