Disección microquirúrgica y limpieza de tejido para obtener imágenes de retina y vítreo intactas de alta resolución

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para la obtención de imágenes de retina completa intacta en la que se extirpan quirúrgicamente las capas externas opacas/pigmentadas del globo ocular y se aplica un aclarado óptico para hacer que la retina sea transparente, lo que permite la visualización de la retina periférica y la vasculatura hialoidea en la retina intacta mediante microscopía fluorescente de lámina de luz.

Resumen

Las estructuras neuronales y vasculares de la retina en condiciones fisiológicas y patológicas se pueden visualizar y caracterizar mejor mediante el uso de técnicas de imágenes de retina completa intacta en comparación con las preparaciones y secciones convencionales de montaje plano de la retina. Sin embargo, las imágenes inmunofluorescentes de la retina completa intacta se ven obstaculizadas por los recubrimientos opacos del globo ocular, es decir, la esclerótica, la coroides y el epitelio pigmentario de la retina (EPR) y las propiedades de dispersión de la luz de las capas de la retina que impiden la obtención de imágenes ópticas de alta resolución de espesor completo. Se han descrito protocolos de blanqueo químico de las capas pigmentadas y de limpieza de tejidos para abordar estos obstáculos; sin embargo, los métodos descritos actualmente no son adecuados para obtener imágenes de moléculas fluorescentes endógenas como la proteína fluorescente verde (GFP) en retina completa intacta. Otros enfoques eludieron esta limitación mediante la extirpación quirúrgica de las capas pigmentadas y el segmento anterior del globo ocular, lo que permitió obtener imágenes oculares intactas, aunque la retina periférica y las estructuras hialoides se interrumpieron. Aquí se presenta un protocolo de imágenes inmunofluorescentes vítreas y retina entera intacta que combina la disección quirúrgica de las capas de esclerótica/coroides/epitelio pigmentario de la retina (EPR) con un método de limpieza de tejido modificado y microscopía fluorescente de lámina de luz (LSFM). El nuevo enfoque ofrece una visión sin precedentes de los elementos vasculares y neuronales no perturbados de la retina, así como del sistema vascular vítreo e hialoideo en condiciones patológicas.

Introducción

La interacción entre los elementos neuronales y vasculares de la retina en estados sanos y enfermos se explora tradicionalmente mediante estudios inmunofluorescentes en secciones físicas de tejido de la retina parafinado o criofijado o en preparaciones planas de la retina¹. Sin embargo, el seccionamiento de tejido interrumpe la continuidad neuronal y vascular de la retina, y aunque se sugiere la reconstrucción tridimensional de las secciones de retina adyacentes como una posible solución, todavía está sujeta a errores y artefactos. Las preparaciones de montaje plano de la retina también alteran notablemente la integridad de los elementos vasculares y neuronales de la retina y la conexión geográfica entre las áreas retinianas adyacentes². Por otra parte, recientemente se han introducido imágenes de retina completa intacta para visualizar las proyecciones tridimensionales de los componentes neuronales y vasculares de la retina en su posición anatómica natural 2,3,4,5.

En las imágenes de retina completa intacta, las señales fluorescentes de los elementos vasculares y neuronales de las áreas adyacentes de la retina (mosaicos) de una retina completa intacta se capturan utilizando un microscopio de lámina de luz; A continuación, estos mosaicos se "suturan" para reconstruir una vista tridimensional de toda la retina 2,3,4,5,6. Las imágenes de retina completa intacta proporcionan una visión sin precedentes de la retina para estudiar la patogenia de las enfermedades vasculares, degenerativas e inflamatorias de la retina 2,3,4,5,6. Por ejemplo, Prahst et al. revelaron una morfología anudada previamente "no apreciada" en mechones vasculares patológicos, motilidad celular anormal y dinámica de filopodios alterada en un modelo de retinopatía inducida por oxígeno (OIR) utilizando imágenes en vivo de una retina completa intacta². De manera similar, Henning et al., Singh et al., y Chang et al. demostraron la compleja red vascular retiniana tridimensional en retinas enteras intactas ^3,4,6. Vigouroux et al. utilizaron un método de imagen de ojo entero intacto para mostrar la organización de la retina y las proyecciones visuales en el período perinatal⁵. Con el fin de poder crear vistas tridimensionales sin precedentes de la retina, los protocolos de imágenes de retina completa intacta han superado dos limitaciones principales: 1) la presencia de recubrimientos opacos y pigmentados del globo ocular (esclerótica, coroides y EPR) y 2) la penetración limitada de la luz a través del grosor completo de la retina causada por las propiedades de dispersión de la luz de las capas nuclear y plexiforme de la retina. Henning et al. y Vigouroux et al. aplicaron el blanqueo_H2O2 de los pigmentos coroides/EPR para poder obtener imágenes de una retina intacta ^3,5. Sin embargo, el blanqueo no es adecuado para cepas animales con fluoróforos endógenos como la proteína verde fluorescente (GFP) o después de tinciones inmunofluorescentes in vivo ^3,5,7. Además, el método de tratamiento de_H2O2 de Henning et al. se llevó a cabo en condiciones acuosas que pueden generar microburbujas que provocan el desprendimiento de retina. Además, el tratamiento con_H2O2 se realizó a 55 °C, condición que deteriora aún más la afinidad tisular de los anticuerpos. Además, el blanqueo puede introducir una fuerte autofluorescencia originada por la melanina oxidada⁸. Otros protocolos de despigmentación para secciones de ojos que utilizaron permanganato de potasio y ácido oxálico lograron eliminar los pigmentos del EPR en secciones embrionarias, pero también se ha demostrado que este método de despigmentación reduce la eficacia del inmunomarcaje ^9,10. Como alternativa al blanqueamiento, Prahst et al., Singh et al., y Chang et al. extirparon la esclerótica, la coroides y la córnea para hacer que toda la retina fuera accesible a la luz del microscopio ^2,4,6. Sin embargo, la extirpación de la córnea, el cristalino y la retina periférica puede distorsionar y alterar la retina periférica y los vasos hialoideos, lo que hace que estos métodos no sean adecuados para estudiar la retina periférica y la vasculatura hialoidea.

Todos los protocolos de imágenes de ojo entero intacto disponibles en la actualidad incluyen el uso de un paso de limpieza óptica de tejido para superar las propiedades de dispersión de la luz de las capas de la retina 2,3,4,5. El aclaramiento óptico de los tejidos hace que la retina sea transparente a la luz del microscopio al igualar el índice de refracción de un tejido dado, aquí la retina, a través de todos sus elementos celulares e intercelulares^para minimizar la dispersión y absorción de la luz. La coroides y el EPR deben eliminarse o blanquearse antes de aplicar el aclaramiento óptico tisular a la retina, ya que los recubrimientos pigmentados del globo ocular (coroides y EPR) no pueden eliminarse suficientemente 6,12,13,14,15,16,17,18.

La participación y las contribuciones del sistema vascular vítreo e hialoideo en condiciones patológicas como la retinopatía del prematuro (ROP), la vasculatura fetal persistente (PFV), la enfermedad de Norrie y la enfermedad de Stickler se estudian mejor cuando la retina y los vasos hialoides no se alteran en la preparación del tejido 19,20,21,22,23. Los métodos existentes para la obtención de imágenes de retina completa intacta eliminan el segmento anterior del ojo, que altera naturalmente el vítreo y su vasculatura, o aplican agentes blanqueadores, que pueden eliminar los fluoróforos endógenos. Faltan métodos publicados para visualizar el cuerpo vítreo y la vasculatura en su estado intacto e intacto. Describimos aquí un método de imagen de retina y vítreo completo que consiste en la disección quirúrgica de recubrimientos pigmentados y opacos del globo ocular, un aclaramiento óptico de tejido modificado optimizado para la retina y microscopía fluorescente de lámina de luz. A continuación se detallan los pasos de preparación de muestras, limpieza óptica de tejidos, microscopía de lámina óptica y procesamiento de imágenes.

Protocolo

Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Rama Médica de la Universidad de Texas. El uso y el cuidado de los animales estuvieron de acuerdo con la declaración de la Asociación para la Investigación de la Visión y la Oftalmología (ARVO) para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión. Todos los materiales necesarios para llevar a cabo este trámite se enumeran en la Tabla de Materiales. Use guantes sin polvo mientras realiza cada paso. Para los pasos 6 y 7, consulte también el manual de instrucciones oficial del microscopio.

1. Preparación de los animales

1. Sacrificar a los ratones experimentales de acuerdo con el protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (aquí se utilizó anestesia con una combinación de ketamina 60 mg/kg y dexmedetomidina 0,5 mg/kg seguida de dislocación cervical). Proceda inmediatamente a estabilizar al animal en una plataforma para su disección y perfusión cardíaca.
   NOTA: Los animales de experimentación se eligen en función del diseño del estudio individual.
2. Diseccionar el abdomen y el tórax para exponer el corazón. Realizar la perfusión cardíaca mediante una transfusión del corazón a través de una aguja de 27 G colocada en el ventrículo izquierdo y crear una pequeña incisión (~1 mm) en la aurícula derecha para permitir la salida de la sangre²⁴.
   1. Primero, transfunda 30-50 mL de solución salina balanceada (PBS) de fosfato helada y luego, 30-50 mL de paraformaldehído (PFA) al 4% recién preparado.
   2. Para verificar si una transfusión de PFA es exitosa, verifique si hay contracciones musculares visibles en todo el cuerpo y la cola. Continúe con el paso de enucleación.

2. Enucleación y fijación del globo ocular

1. Use unas pinzas de joyero curvadas para empujar suavemente sobre el párpado superior o inferior para forzar el globo ocular fuera de su órbita. Use otro juego de pinzas de joyero o similares para perforar la conjuntiva desde el costado y sostener el globo desde el lado del nervio óptico. Levante lentamente el globo de su órbita hasta que se separe del nervio óptico.
2. Transfiera el globo a un tubo que contenga PFA al 4% helado recién preparado. Etiquete el tubo en consecuencia. Deje que el globo permanezca en PFA al 4% en un refrigerador a 4 °C durante 12 h (toda la noche).
   NOTA: Utilice una pipeta de transferencia de plástico con una punta cortada para transferir el globo. Amplíe la abertura de la punta de corte con una segunda punta de pipeta para evitar dañar la muestra con bordes afilados.

3. Disección de la muestra (Figura 1 y Figura 2)

1. Bajo un microscopio estereoscópico, localice la unión córnea-esclerótica (Figura 1A) y utilice la punta de corte afilada de una aguja de 30 G para hacer un corte muy superficial en la esclerótica aproximadamente 0,5-1 mm detrás de la unión córnea-esclerótica (Figura 1B).
2. Avance una de las hojas de una tijera de disección de punta afilada a través de la incisión que se acaba de hacer en el espacio potencial entre la esclerótica/coroides/EPR y la retina (Figura 1C). Avance las tijeras y corte circunferencialmente hasta que la esclerótica/coroides/EPR se pueda despegar de la superficie externa de la retina (Figura 1D,E).
   NOTA: Es importante realizar este paso lenta y suavemente para evitar perforar la retina. Los primeros cortes son particularmente críticos para evitar cortar la retina.
3. Si es necesario, realice cortes radiales relajantes en la esclerótica/coroides/EPR para facilitar el proceso de corte circunferencial y el posterior descamado del nervio óptico y la esclerótica/coroides/EPR. Retire los parches pequeños de EPR (Figura 1F) con un pincel de pintura de tamaño 1 empapado en PBS.
4. Transfiera todo el globo ocular intacto a un tubo que contenga PBS. Continúe inmediatamente con el siguiente paso o conserve a 4 °C para el inmunomarcaje.
   NOTA: Se pueden colocar marcas en el globo ocular después de la enucleación y luego, después de la disección, para preservar la orientación del ojo si es necesario. El protocolo puede detenerse aquí, y las muestras pueden conservarse durante la noche en un refrigerador a 4 °C antes de continuar con los siguientes pasos.

4. Tinción vascular

1. Permeabilizar el tejido sumergiéndolo en PBS que contiene 0,2% de Tween-20 a temperatura ambiente durante 20 min.
2. Lave la muestra con PBS 3 veces en una coctelera durante 10 min.
3. Incubar la muestra con un 5% de suero normal de cabra (NGS) en PBS que contenga un 0,25% de Triton X-100 a temperatura ambiente durante 1 h.
4. Incubar con el anticuerpo primario a 4 °C durante la noche. En este caso, se utilizó un anticuerpo anti-Colágeno IV de ratón (la concentración final se preparó en PBS que contenía 0,2% de Tween-20).
5. Lavar 3 veces con PBS, durante 5 minutos por lavado.
6. Incubar la muestra con anticuerpos secundarios marcados con fluorescente. En este caso, se utilizó una Alexa Fluor 568 anti-conejo durante 12 h a 4 °C (dilución 1:200 en PBS que contenía 0,2% de Tween-20).
7. Lave con PBS 3 veces, durante 1 h cada una, y luego continúe con los pasos de limpieza de tejidos.

5. Aclarado óptico con 2,2′-tiodietanol (TDE)

1. Prepare las concentraciones de TDE de trabajo utilizando una solución madre de TDE con PBS para una concentración final de 10%, 20%, 30%, 40%, 50% y 60% de volumen a volumen (v/v). Prepare al menos 2 ml de solución para cada muestra de ojo para permitir que el exceso de volumen penetre en el tejido.
2. Incubar las muestras en un pocillo de placa de 6 o 12 pocillos a una concentración creciente de TDE. Comience sumergiendo los globos oculares enteros intactos en una solución de TDE al 10% durante 2-4 h en un agitador a temperatura ambiente. Sucesivamente, transfiera la muestra a una concentración de TDE más alta durante 2-4 h en cada concentración de TDE (Figura 2C).
   NOTA: La retina comienza a aclararse a concentraciones del 40% al 50%, pero el aclaramiento máximo se produce después de la incubación en una solución al 60%. La retina se vuelve menos transparente a concentraciones del 70% o más (Figura 2D).
3. Detenga el proceso de compensación durante la noche, si es necesario, en cualquiera de los pasos sucesivos de la bolsa de compensación.

6. Imágenes de todo el ojo utilizando una microscopía de lámina de luz

1. Monte las muestras de ojo entero intactas teniendo en cuenta la configuración de la plataforma de microscopio de lámina de luz que se está utilizando. Siga las instrucciones del microscopio y del software de adquisición para configurar los parámetros de adquisición, incluida la alineación de la lámina de luz y la iluminación y detección de trayectorias ópticas.
   NOTA: Las muestras utilizadas en este experimento se pegaron desde el lado de la córnea hasta la punta de una aguja hipodérmica en una jeringa de insulina (Figura 2E). A continuación, la muestra se suspendió dentro de la cámara del microscopio.
2. Llene la cámara del microscopio con un 60% de TDE como solución de limpieza.
3. Sumerja la muestra dentro de la cámara del microscopio de lámina de luz en una solución de TDE al 60% (la concentración final de aclarado).
4. Obtenga imágenes del ojo despejado por medio de una variedad de microscopios confocales y de lámina de luz comerciales o personalizados. En este protocolo, se utiliza un microscopio de lámina de luz de iluminación de doble cara.
5. Utilice imágenes de baja resolución y bajo aumento (5x, NA 0,16) para obtener imágenes de la morfología celular y el trazado de procesos celulares, especialmente cuando se combina con mosaicos. Utilice imágenes de alta resolución y aumento (20x, NA 1.0) para obtener imágenes tanto de la morfología celular como de grandes orgánulos subcelulares, como núcleos y grupos mitocondriales.

7. Procesamiento de imágenes posterior a la adquisición

NOTA: El procesamiento posterior a la adquisición depende del tipo de archivo y del software compatible con los archivos de imagen.

1. Aplique el desenfoque o la deconvolución para aumentar aún más las imágenes sin procesar antes de unir los mosaicos de la imagen. Se puede aplicar un filtro Weiner para desenfocar las imágenes. Alternativamente, las imágenes se pueden desconvolucionar iterativamente después de eliminar el ruido con la deconvolución de Richardson-Lucy y un PSF medido teórica o experimentalmente utilizando herramientas de modelado como el complemento generador de PSF^{ImageJ 25}.
2. Realice la unión de pilas z preprocesadas y transformaciones de volumen afines y no rígidas, seguidas de registro y fusión de volúmenes multivista utilizando una variedad de paquetes de software comerciales o de dominio público (complemento ImageJ - BigStitcher)²⁶.

Resultados

En la Figura 3A se muestra una proyección de ángulo cero de la red vascular peripapilar y la microglía. Además, en la Figura 3B se presenta la distribución intacta de la microglía de la retina completa en un ratón CX3CR1-GFP. Una ventaja importante del método presentado aquí es su capacidad para obtener imágenes de fluoróforos innatos. La Figura 3C,D muestra la...

Discusión

El desarrollo y las patologías de la retina y el vítreo se estudian mejor con técnicas de imágenes de retina completa intacta en las que la retina no se corta por secciones o para preparaciones de montaje plano. Los métodos existentes de imágenes de ojo entero intacto incorporan el blanqueo de pigmentos, que elimina los fluoróforos innatos, o implican la eliminación física de los recubrimientos opacos del globo ocular (EPR, coroides y esclerótica) junto con el segmento anterior...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Experimental animal
CX3CR1-GFP Mouse	The Jackson Laboratory	5582
Anesthetic
Dexmedetomidine	Par Pharmaceutical	42023-146-25
Ketamine	Fresenius Kabi
Tissue harvesting, fixation, and sample dissection
cardiac perfusion pump	Fisher scientific	NC9069235
Cyanoacrylate superglue	amazon.com
Fine scissors-sharp	Fine Science Tools	14160-10
Fine tweezers	Fine Science Tools	11412-11
Paraformaldehyde (PFA)	Electrone microscopy sciences	15710-S
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	10010049
size 1 painting brush	dickblick.com
straight spring scissors	Fine Science Tools	15000-03
syringe, needle tip, 27 gauge x 1.25"	BD
Tubes 1.5 ml, 15 ml, 50 ml	Thermo sceintific
Tween-20	ThermoFisher	85114
Immunofluorescent staining
Anti-mouse collagen IV antibody	Abcam	ab19808	1:200 dilution
Anti-rabbit Alexa Fluor 568	Invitreogen	A-11011	1:200 dilution
Normal goat serum	ThermoFisher	50062Z	10% concentration
Tissue clearing
2,2′-thiodiethanol (TDE)	Fluka analytica	STBD7772V
Rocking shaker	Fisher scientific	02-217-765
Microscopy
Fluorescent microspheres	TetraSpeck	T14792
Light sheet fluorescent microscope (LSFM)	Zeiss	Z1
Microglia enumeration
ImageJ	National Institue of Health