显微外科解剖和组织透明化，用于高分辨率完整全视网膜和玻璃体成像

摘要

这里介绍的是完整全视网膜成像的方案，其中通过手术去除眼球的外部不透明/色素层，并应用光学透明化以使视网膜透明，从而能够使用光片荧光显微镜在完整视网膜中可视化周边视网膜和透明体脉管系统。

摘要

与传统的视网膜平面安装制备和切片相比，使用完整的全视网膜成像技术可以更好地可视化和表征生理和病理条件下视网膜的神经元和血管结构。然而，完整整个视网膜的免疫荧光成像受到眼球不透明涂层（即巩膜、脉络膜和视网膜色素上皮 （RPE））以及视网膜层的光散射特性的阻碍，这些特性阻碍了全层高分辨率光学成像。色素层的化学漂白和组织透明化方案已被描述为解决这些障碍;然而，目前描述的方法不适用于对完整整个视网膜中的内源性荧光分子如绿色荧光蛋白 （GFP） 进行成像。其他方法通过手术去除色素层和眼球前段绕过了这一限制，允许完整的眼睛成像，尽管周边视网膜和透明体结构被破坏。这里介绍的是完整的全视网膜和玻璃体免疫荧光成像方案，该方案将巩膜/脉络膜/视网膜色素上皮 （RPE） 层的手术解剖与改良的组织透明化方法和光片荧光显微镜 （LSFM） 相结合。新方法为病理条件下视网膜未受干扰的血管和神经元元素以及玻璃体和透明体血管系统提供了前所未有的视图。

引言

传统上，通过对石蜡或冷冻固定的视网膜组织的物理切片或视网膜扁平制剂进行免疫荧光研究来探索健康和疾病状态下视网膜神经元和血管成分之间的相互作用¹。然而，组织切片会破坏视网膜神经元和血管的连续性，尽管相邻视网膜切片的三维重建被认为是一种可能的解决方案，但它仍然容易受到错误和伪影的影响。视网膜平面安装制剂还显著干扰视网膜血管和神经元元件的完整性以及相邻视网膜区域之间的地理连接²。或者，最近引入了完整的全视网膜成像，以可视化视网膜神经元和血管成分在其自然解剖位置的三维投影 2,3,4,5。

在完整全视网膜成像中，使用光片显微镜捕获来自完整全视网膜相邻视网膜区域（瓦片）的血管和神经元元件的荧光信号;然后将这些平铺“缝合”在一起，以重建整个视网膜的三维视图 ^2,3,4,5,6。完整的全视网膜成像为研究视网膜血管、退行性和炎症性疾病的发病机制提供了前所未有的视网膜视图 2,3,4,5,6。例如，Prahst 等人使用完整全视网膜² 的实时成像，在氧诱导的视网膜病变 （OIR） 模型中揭示了以前“未被重视”的病理血管簇的打结形态、异常的细胞运动和改变的丝状伪足动力学。同样，Henning 等人、Singh 等人和 Chang 等人证明了完整全视网膜中复杂的三维视网膜血管网络 ^3,4,6。Vigouroux 等人使用完整的全眼成像方法来显示围产期视网膜的组织和视觉投射⁵。为了能够创建如此无与伦比的视网膜三维视图，完整的全视网膜成像方案克服了两个主要限制：1） 眼球（巩膜、脉络膜和 RPE）的不透明和着色涂层的存在，以及 2） 由于视网膜核层和丛状层的光散射特性，光线穿过整个视网膜厚度的渗透受到限制。Henning 等人和 Vigouroux 等人对脉络膜/RPE 色素进行了 H₂O₂ 漂白，以便能够对完整的视网膜进行成像 ^3,5。然而，漂白不适用于具有内源性荧光团（如绿色荧光蛋白 （GFP））的动物菌株或体内免疫荧光染色后的动物菌株 ^3,5,7。此外，Henning 等人的 H₂O₂ 处理方法是在水条件下进行的，这可能会产生导致视网膜脱离的微泡。此外，H₂O₂ 处理在 55 °C 下进行，这种情况进一步恶化了组织抗体亲和力。此外，漂白可能会引入源自氧化黑色素的严重自发荧光⁸。使用高锰酸钾和草酸的其他眼部脱色方案能够去除胚胎切片中的 RPE 色素，但这种脱色方法也被证明会降低免疫标记的功效 ^9,10。作为漂白的替代方法，Prahst 等人、Singh 等人和 Chang 等人去除了巩膜、脉络膜和角膜，使整个视网膜可以在显微镜下到达 ^2,4,6。然而，切除角膜、晶状体和周边视网膜可能会扭曲和破坏周边视网膜和透明质血管，使这些方法不适合研究周边视网膜和透明质脉管系统。

目前所有可用的完整全眼成像方案都包括使用组织光学透明化步骤来克服视网膜层的光散射特性 2,3,4,5。组织光学透明化通过均衡给定组织（此处为视网膜）的所有细胞和细胞间元件的折射率，使视网膜对显微镜光线透明，以最大限度地减少光散射和吸收¹¹。在将组织光学透明化应用于视网膜之前，应去除脉络膜和 RPE，因为眼球的色素涂层（脉络膜和 RPE）无法充分透明 6,12,13,14,15,16,17,18。

当视网膜和透明体血管在组织准备中未被破坏时，最好研究玻璃体和透明体血管系统在早产儿视网膜病变 （ROP）、持续性胎儿脉管系统 （PFV）、Norrie 病和斯蒂克勒病等病理状况中的参与和贡献 19,20,21,22,23.现有的完整全视网膜成像方法要么去除眼睛的前段，这会自然地破坏玻璃体及其脉管系统，要么使用漂白剂，这可能会去除内源性荧光团。缺乏已发表的可视化玻璃体和脉管系统完整、未受触及状态的方法。我们在这里描述了一种完整的视网膜和玻璃体成像方法，该方法包括眼球色素沉着和不透明涂层的手术解剖、针对视网膜优化的改良组织光学透明化以及光片荧光显微镜。样品制备、组织光学透明化、光片显微镜和图像处理步骤详述如下。

研究方案

所有实验均已获得德克萨斯大学医学分部机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。动物的使用和护理符合视觉和眼科学研究协会 （ARVO） 关于动物在眼科和视觉研究中使用的声明。执行此程序所需的所有材料均列在 材料表中。执行每个步骤时戴上无粉手套。有关步骤 6 和 7，另请参阅官方显微镜作手册。

1. 动物的准备

1. 根据适用的机构动物护理和使用委员会批准的方案对实验小鼠实施安乐死（此处使用氯胺酮 60 mg/kg 和右美托咪定 0.5 mg/kg 联合麻醉，然后颈椎脱位）。立即着手将动物稳定在平台上进行解剖和心脏灌注。
   注意：实验动物是根据个体研究的设计选择的。
2. 解剖腹部和胸部，露出心脏。通过放置在左心室的 27 G 针头输血心脏进行心脏灌注，并在右心房做一个小 （~1 mm） 切口以允许血液流出²⁴。
   1. 首先，输注 30-50 mL 冰冷的磷酸盐平衡盐水溶液 （PBS），然后输注 30-50 mL 新鲜制备的 4% 多聚甲醛 （PFA）。
   2. 要检查 PFA 输血是否成功，请检查全身和尾部是否有可见的肌肉抽搐。继续进行剜除步骤。

2. 眼球剜除和固定

1. 使用弯曲的珠宝商镊子轻轻推过上眼睑或下眼睑，将眼球从眼窝中挤出。使用另一套珠宝镊子或类似镊子从侧面刺穿结膜，并从视神经侧固定眼球。慢慢地将眼球从眼窝中提起，直到它与视神经分离。
2. 将球体转移到含有新鲜制备的冰冷 4% PFA 的试管中。相应地标记试管。让地球在 4 °C 冰箱中在 4% PFA 中保持 12 小时（过夜）。
   注意：使用带有切割尖端的塑料移液管转移地球仪。用第二个移液器吸头加宽切割吸头的开口，以避免用锋利的边缘损坏样品。

3. 样品解剖（图 1 和 图 2）

1. 在立体显微镜下，找到角膜-巩膜交界处（图 1A），并使用 30 G 针的锋利切割尖端在角膜-巩膜交界处后方约 0.5-1 毫米的巩膜处进行非常浅的切割（图 1B）。
2. 将切割剪刀的尖头刀片之一推进，穿过刚刚进入巩膜/脉络膜/RPE 和视网膜之间潜在空间的切口（图 1C）。推进剪刀并沿圆周切割，直到巩膜/脉络膜/RPE 可以从视网膜的外表面剥离（图 1D，E）。
   注意：重要的是要缓慢而轻柔地执行此步骤，以避免刺穿视网膜。前几次切割对于避免切割视网膜尤为关键。
3. 如果需要，在巩膜/脉络膜/RPE 上进行径向松弛切割，以促进圆周切割过程和随后的视神经和巩膜/脉络膜/RPE 的剥离。使用浸泡在 PBS 中的 1 号画笔去除小块 RPE（图 1F）。
4. 将整个完整的眼球转移到含有 PBS 的试管中。立即进行下一步或在 4 °C 下保存以进行免疫标记。
   注意：如果需要，可以在眼球摘除后和解剖后将标记放在眼球上，以保持眼睛的方向。该方案可以在此处暂停，并且样品可以在4°C冰箱中保存过夜，然后再进行下一步。

4. 血管染色

1. 通过在室温下将组织浸入含有 0.2% Tween-20 的 PBS 中 20 分钟来透化组织。
2. 在摇床上用 PBS 洗涤样品 3 次，每次 10 分钟。
3. 将样品与含有 0.25% Triton X-100 的 PBS 中的 5% 正常山羊血清 （NGS） 在室温下孵育 1 小时。
4. 与 Primary Antibody 在 4 °C 下孵育过夜。在这里，使用抗小鼠 IV 型胶原抗体（在含有 0.2% Tween-20 的 PBS 中制备终浓度）。
5. 用 PBS 洗涤 3 次，每次洗涤 5 分钟。
6. 将样品与荧光标记的二抗一起孵育。在这里，将抗兔 Alexa Fluor 568 在 4 °C 下使用 12 小时（在含有 0.2% Tween-20 的 PBS 中以 1：200 稀释）。
7. 用 PBS 洗涤 3 次，每次 1 小时，然后进行组织透明化步骤。

5. 用 2,2′-硫代二乙醇 （TDE） 进行光学透明化

1. 使用含 PBS 的 TDE 储备液制备工作 TDE 浓度，最终浓度为 10%、20%、30%、40%、50% 和 60% 体积比 （v/v）。为每个眼部样品准备至少 2 mL 的溶液，以允许足够的过量体积穿透组织。
2. 在 6 或 12 孔板孔中以增加 TDE 浓度孵育样品。首先在室温下将完整的整个眼球浸入 10% TDE 溶液中 2-4 小时。连续地，在每个 TDE 浓度中将样品转移到更高的 TDE 浓度 2-4 小时（图 2C）。
   注：视网膜在 40%–50% 的浓度下开始透明化，但在 60% 溶液中孵育后，透明化程度最高。视网膜在 70% 或更高的浓度下变得不那么透明（图 2D）。
3. 如果需要，在任何连续的清算交易步骤中，隔夜停止清算过程。

6. 使用光片显微镜进行全眼成像

1. 考虑到正在使用的光片显微镜平台的配置，安装完整的全眼样品。按照显微镜和采集软件的说明设置采集参数，包括光片对准以及光路的照明和检测。
   注意：本实验中使用的样品从角膜侧粘到胰岛素注射器上皮下注射针头的尖端（图 2E）。然后将样品悬浮在显微镜腔室内。
2. 用 60% TDE 填充显微镜室作为透明溶液。
3. 将样品浸入光片显微镜腔室内的 60% TDE 溶液（最终清除浓度）中。
4. 通过各种商用或定制的共聚焦和光片显微镜对清除的眼睛进行成像。在该协议中，使用了双侧照明光片显微镜。
5. 使用低分辨率和低放大倍率成像（5x，NA 0.16）对细胞形态和细胞过程追踪进行成像，尤其是与平铺结合使用时。使用高分辨率和放大成像（20 倍，NA 1.0）对细胞形态和大型亚细胞器（如细胞核和线粒体簇）进行成像。

7. 采集后图像处理

注意：采集后处理取决于文件类型和与成像文件兼容的软件。

1. 在拼接成像图块之前，应用去模糊或反卷积以进一步增强原始图像。可以应用 Weiner 滤镜来对图像进行去模糊处理。或者，在使用 Richardson-Lucy 反卷积和理论或实验测量的 PSF 进行去噪后，可以使用 ImageJ PSF 生成器插件²⁵ 等建模工具对图像进行迭代反卷积。
2. 使用各种商业或公共领域软件包（ImageJ – BigStitcher 插件）²⁶ 执行预处理的 z 堆栈的拼接以及仿射和非刚性体积变换，然后进行多视图体积配准和融合。

结果

周围血管网络和小胶质细胞的零角投影如图 3A 所示。此外，CX3CR1-GFP 小鼠中完整的全视网膜小胶质细胞分布如图 3B 所示。这里介绍的方法的一个主要优点是它能够对先天荧光团进行成像。图 3C、D 显示了使用当前完整全眼成像方法（图 3C）和平面安装制备方法?...

讨论

视网膜和玻璃体的发育和病理最好使用完整的全视网膜成像技术进行研究，其中视网膜不被切割用于切片或平面安装准备。现有的完整全眼成像方法要么采用色素漂白，去除固有的荧光团，要么涉及物理去除眼球的不透明涂层（RPE、脉络膜和巩膜）以及眼睛的前段，这可能会干扰周边视网膜和玻璃体。Chang 等人和 Prahst 等人去除了眼球和角膜的外涂层，从而可能破坏玻璃?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Experimental animal
CX3CR1-GFP Mouse	The Jackson Laboratory	5582
Anesthetic
Dexmedetomidine	Par Pharmaceutical	42023-146-25
Ketamine	Fresenius Kabi
Tissue harvesting, fixation, and sample dissection
cardiac perfusion pump	Fisher scientific	NC9069235
Cyanoacrylate superglue	amazon.com
Fine scissors-sharp	Fine Science Tools	14160-10
Fine tweezers	Fine Science Tools	11412-11
Paraformaldehyde (PFA)	Electrone microscopy sciences	15710-S
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	10010049
size 1 painting brush	dickblick.com
straight spring scissors	Fine Science Tools	15000-03
syringe, needle tip, 27 gauge x 1.25"	BD
Tubes 1.5 ml, 15 ml, 50 ml	Thermo sceintific
Tween-20	ThermoFisher	85114
Immunofluorescent staining
Anti-mouse collagen IV antibody	Abcam	ab19808	1:200 dilution
Anti-rabbit Alexa Fluor 568	Invitreogen	A-11011	1:200 dilution
Normal goat serum	ThermoFisher	50062Z	10% concentration
Tissue clearing
2,2′-thiodiethanol (TDE)	Fluka analytica	STBD7772V
Rocking shaker	Fisher scientific	02-217-765
Microscopy
Fluorescent microspheres	TetraSpeck	T14792
Light sheet fluorescent microscope (LSFM)	Zeiss	Z1
Microglia enumeration
ImageJ	National Institue of Health