Dissection microchirurgicale et nettoyage des tissus pour une imagerie haute résolution de la rétine entière intacte et du vitré

Résumé

Voici un protocole d’imagerie de la rétine entière intacte dans lequel les couches externes opaques/pigmentées du globe oculaire sont enlevées chirurgicalement et un dégagement optique est appliqué pour rendre la rétine transparente, permettant la visualisation de la rétine périphérique et du système vasculaire hyaloïde dans la rétine intacte à l’aide de la microscopie fluorescente à feuillet de lumière.

Résumé

Les structures neuronales et vasculaires de la rétine dans des conditions physiologiques et pathologiques peuvent être mieux visualisées et caractérisées en utilisant des techniques d’imagerie de la rétine entière intacte par rapport aux préparations et coupes conventionnelles de montage plat de la rétine. Cependant, l’imagerie immunofluorescente de la rétine entière intacte est entravée par les revêtements opaques du globe oculaire, c’est-à-dire la sclère, la choroïde et l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR), ainsi que par les propriétés de diffusion de la lumière des couches rétiniennes qui empêchent l’imagerie optique haute résolution sur toute l’épaisseur. Le blanchiment chimique des couches pigmentées et les protocoles de nettoyage des tissus ont été décrits pour surmonter ces obstacles ; cependant, les méthodes actuellement décrites ne conviennent pas à l’imagerie de molécules fluorescentes endogènes telles que la protéine fluorescente verte (GFP) dans une rétine entière intacte. D’autres approches ont contourné cette limitation en enlevant chirurgicalement les couches pigmentées et le segment antérieur du globe oculaire, permettant une imagerie oculaire intacte, bien que les structures périphériques de la rétine et hyaloïdes aient été perturbées. Voici un protocole d’imagerie immunofluorescente de la rétine entière intacte et du vitré qui combine la dissection chirurgicale des couches de la sclérotique, de la choroïde et de l’épithélium pigmentaire de la rétine (EPR) avec une méthode modifiée de clarification des tissus et la microscopie fluorescente à feuillet de lumière (LSFM). La nouvelle approche offre une vue sans précédent des éléments vasculaires et neuronaux non perturbés de la rétine ainsi que du système vasculaire vitré et hyaloïde dans des conditions pathologiques.

Introduction

L’interaction entre les éléments rétiniens, neuronaux et vasculaires dans les états sains et pathologiques est traditionnellement explorée par des études immunofluorescentes sur des coupes physiques de tissu rétinien fixé en paraffine ou cryo-fixé ou sur des préparations plates de rétine¹. Cependant, la section tissulaire perturbe la continuité neuronale et vasculaire de la rétine, et bien que la reconstruction tridimensionnelle des coupes de rétine adjacentes soit suggérée comme une solution possible, elle est toujours sujette à des erreurs et des artefacts. Les préparations de montage plat de la rétine perturbent également de manière marquée l’intégrité des éléments vasculaires et neuronaux de la rétine et la connexion géographique entre les zones rétiniennes adjacentes². Alternativement, l’imagerie de la rétine entière intacte a récemment été introduite pour visualiser les projections tridimensionnelles des composants neuronaux et vasculaires de la rétine dans leur position anatomique naturelle 2,3,4,5.

Dans l’imagerie de la rétine entière intacte, les signaux fluorescents des éléments vasculaires et neuronaux des zones rétiniennes adjacentes (tuiles) d’une rétine entière intacte sont capturés à l’aide d’un microscope à feuillet de lumière ; Ces tuiles sont ensuite « cousues » ensemble pour reconstruire une vue tridimensionnelle de l’ensemble de la rétine 2,3,4,5,6. L’imagerie de la rétine entière intacte fournit une vue sans précédent de la rétine pour l’étude de la pathogenèse des maladies vasculaires, dégénératives et inflammatoires rétiniennes 2,3,4,5,6. Par exemple, Prahst et al. ont révélé une morphologie nouée auparavant « non appréciée » de touffes vasculaires pathologiques, une motilité cellulaire anormale et une dynamique de filopodie altérée dans un modèle de rétinopathie induite par l’oxygène (OIR) en utilisant l’imagerie en direct d’une rétine entière intacte². De même, Henning et al., Singh et al., et Chang et al. ont démontré le réseau vasculaire rétinien tridimensionnel complexe dans des rétines entières intactes ^3,4,6. Vigouroux et al. ont utilisé une méthode d’imagerie de l’œil entier intact pour montrer l’organisation de la rétine et les projections visuelles dans la période périnatale⁵. Afin de pouvoir créer des vues tridimensionnelles de la rétine sans pareil, les protocoles d’imagerie de la rétine entière intacte ont surmonté deux limitations majeures : 1) la présence de revêtements opaques et pigmentés du globe oculaire (sclère, choroïde et EPR) et 2) la pénétration limitée de la lumière à travers toute l’épaisseur de la rétine causée par les propriétés de diffusion de la lumière des couches nucléaires et plexiformes de la rétine. Henning et al. et Vigouroux et al. ont appliqué un blanchiment H₂O₂ des pigments choroïdes/EPR afin de pouvoir imager une rétine intacte ^3,5. Cependant, le blanchiment ne convient pas aux souches animales avec des fluorophores endogènes tels que la protéine fluorescente verte (GFP) ou après des colorations immunofluorescentes in vivo ^3,5,7. De plus, la méthode de traitement_H2O₂ de Henning et al. a été réalisée dans des conditions aqueuses qui peuvent générer des microbulles entraînant un décollement de la rétine. De plus, le traitement_H2O₂ a été effectué à 55 °C, une condition qui détériore encore l’affinité tissulaire des anticorps. De plus, le blanchiment peut introduire une forte autofluorescence provenant de la mélanine⁸ oxydée. D’autres protocoles de dépigmentation pour les sections oculaires utilisant du permanganate de potassium et de l’acide oxalique ont permis d’éliminer les pigments EPR dans les coupes embryonnaires, mais il a également été démontré que cette méthode de dépigmentation réduit l’efficacité de l’immunomarquage ^9,10. Comme alternative au blanchiment, Prahst et al., Singh et al., et Chang et al. ont enlevé la sclérotique, la choroïde et la cornée pour rendre une rétine entière accessible à la lumière du microscope ^2,4,6. Cependant, l’ablation de la cornée, du cristallin et de la rétine périphérique peut déformer et perturber la rétine périphérique et les vaisseaux hyaloïdes, ce qui rend ces méthodes inadaptées à l’étude de la rétine périphérique et du système vasculaire hyaloïde.

Tous les protocoles d’imagerie de l’œil entier intact actuellement disponibles incluent l’utilisation d’une étape de nettoyage optique des tissus pour surmonter les propriétés de diffusion de la lumière des couches rétiniennes 2,3,4,5. Le nettoyage optique tissulaire rend la rétine transparente à la lumière du microscope en égalisant l’indice de réfraction d’un tissu donné, ici la rétine, à travers tous ses éléments cellulaires et intercellulaires afin de minimiser la diffusion et l’absorption de la lumière¹¹. La choroïde et l’EPR doivent être enlevées ou blanchies avant l’application d’un nettoyage optique tissulaire sur la rétine, car les revêtements pigmentés du globe oculaire (choroïde et EPR) ne peuvent pas être suffisamment éliminés 6,12,13,14,15,16,17,18.

La participation et les contributions du système vasculaire vitré et hyaloïde dans des conditions pathologiques telles que la rétinopathie du prématuré (RDP), la vascularisation fœtale persistante (PFV), la maladie de Norrie et la maladie de Stickler sont mieux étudiées lorsque la rétine et les vaisseaux hyaloïdes ne sont pas perturbés dans la préparation des tissus 19,20,21,22,23. Les méthodes existantes pour l’imagerie de la rétine entière intacte enlèvent le segment antérieur de l’œil, ce qui perturbe naturellement le vitré et son système vasculaire, ou appliquent des agents de blanchiment, qui peuvent éliminer les fluorophores endogènes. Il n’existe pas de méthodes publiées pour visualiser le corps vitré et le système vasculaire dans leur état intact et intact. Nous décrivons ici une méthode d’imagerie complète de la rétine et du vitré qui consiste en une dissection chirurgicale de revêtements pigmentés et opaques du globe oculaire, une clarification optique tissulaire modifiée optimisée pour la rétine et une microscopie fluorescente à feuillet de lumière. Les étapes de préparation des échantillons, de clarification optique des tissus, de microscopie à feuille de lumière et de traitement d’images sont détaillées ci-dessous.

Protocole

Toutes les expériences ont été approuvées par le comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC) de la branche médicale de l’Université du Texas. L’utilisation et les soins aux animaux étaient conformes à la déclaration de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) concernant l’utilisation d’animaux dans la recherche en ophtalmologie et sur la vision. Tous les matériaux nécessaires à la réalisation de cette procédure sont répertoriés dans la table des matériaux. Portez des gants non poudrés lors de chaque étape. Pour les étapes 6 et 7, reportez-vous également au manuel d’utilisation officiel du microscope.

1. Préparation des animaux

1. Euthanasier les souris expérimentales conformément au protocole applicable approuvé par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (une anesthésie avec une combinaison de kétamine 60 mg/kg et de dexmédétomidine 0,5 mg/kg suivie d’une luxation cervicale a été utilisée ici). Procéder immédiatement à la stabilisation de l’animal sur une plate-forme de dissection et de perfusion cardiaque.
   REMARQUE : Les animaux de laboratoire sont choisis en fonction de la conception de l’étude individuelle.
2. Disséquez l’abdomen et le thorax pour exposer le cœur. Effectuez la perfusion cardiaque en transfusant le cœur à l’aide d’une aiguille de 27 G placée dans le ventricule gauche et créez une petite incision (~1 mm) dans l’oreillette droite pour permettre la sortie du sang²⁴.
   1. Tout d’abord, transfuser 30 à 50 ml de solution saline équilibrée au phosphate (PBS) glacée, puis 30 à 50 ml de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) fraîchement préparé.
   2. Pour vérifier si une transfusion de PFA a réussi, vérifiez la présence de contractions musculaires visibles dans tout le corps et la queue. Passez à l’étape de l’énucléation.

2. Énucléation et fixation du globe oculaire

1. À l’aide d’une pince de bijoutier incurvée, poussez doucement sur la paupière supérieure ou inférieure pour forcer le globe oculaire à sortir de son orbite. Utilisez une autre pince de bijoutier ou similaire pour percer la conjonctive sur le côté et tenir le globe du côté du nerf optique. Soulevez lentement le globe de sa cavité jusqu’à ce qu’il soit séparé du nerf optique.
2. Transférez le globe dans un tube contenant du PFA glacé à 4 % fraîchement préparé. Étiquetez le tube en conséquence. Laisser le globe conserver dans 4 % de PFA dans un réfrigérateur à 4 °C pendant 12 h (toute la nuit).
   REMARQUE : Utilisez une pipette de transfert en plastique avec une pointe coupée pour transférer le globe. Élargissez l’ouverture de la pointe coupée avec une deuxième pointe de pipette pour éviter d’endommager l’échantillon avec des arêtes vives.

3. Dissection de l’échantillon (Figure 1 et Figure 2)

1. Au stéréomicroscope, localisez la jonction cornée-sclérotique (figure 1A) et, à l’aide de la pointe tranchante d’une aiguille de 30 G, faites une incision très superficielle au niveau de la sclérotique à environ 0,5 à 1 mm en arrière de la jonction cornée-sclérotique (figure 1B).
2. Avancez l’une des lames d’une pointe pointue en disséquant des ciseaux à travers l’incision qui vient d’être pratiquée dans l’espace potentiel entre la sclère/choroïde/EPR et la rétine (Figure 1C). Avancez les ciseaux et coupez circonférentiellement jusqu’à ce que la sclère/choroïde/EPR puisse être décollée de la surface externe de la rétine (Figure 1D,E).
   REMARQUE : Il est important d’effectuer cette étape lentement et doucement pour éviter de percer la rétine. Les premières coupures sont particulièrement critiques pour éviter de couper la rétine.
3. Si nécessaire, faites des coupes radiales relaxantes sur la sclère/choroïde/EPR pour faciliter le processus de coupe circonférentielle et le pelage ultérieur du nerf optique et de la sclérotique/choroïde/EPR. Retirez les petites taches d’EPR (figure 1F) à l’aide d’un pinceau de taille 1 imbibé de PBS.
4. Transférez l’ensemble du globe oculaire intact dans un tube contenant du PBS. Passer immédiatement à l’étape suivante ou conserver à 4 °C pour l’immunomarquage.
   REMARQUE : Des marques peuvent être placées sur le globe oculaire après l’énucléation, puis après la dissection pour préserver l’orientation de l’œil si nécessaire. Le protocole peut être interrompu ici, et les échantillons peuvent être conservés toute la nuit dans un réfrigérateur à 4 °C avant de passer aux étapes suivantes.

4. Coloration vasculaire

1. Perméabiliser le tissu en l’immergeant dans du PBS contenant 0,2 % de Tween-20 à température ambiante pendant 20 min.
2. Lavez l’échantillon avec du PBS 3 fois sur un agitateur pendant 10 min.
3. Incuber l’échantillon avec 5 % de sérum de chèvre normal (NGS) dans du PBS contenant 0,25 % de Triton X-100 à température ambiante pendant 1 h.
4. Incuber avec l’anticorps primaire à 4 °C pendant la nuit. Ici, un anticorps anti-collagène IV de souris a été utilisé (la concentration finale a été préparée dans du PBS contenant 0,2 % de Tween-20).
5. Laver 3 fois avec du PBS, pendant 5 min par lavage.
6. Incuber l’échantillon avec des anticorps secondaires marqués par fluorescence. Ici, un anti-lapin Alexa Fluor 568 a été utilisé pendant 12 h à 4 °C (dilution 1:200 dans du PBS contenant 0,2 % de Tween-20).
7. Lavez avec du PBS 3 fois, pendant 1 h chacune, puis procédez aux étapes de nettoyage des tissus.

5. Compensation optique avec du 2,2′-thiodiéthanol (TDE)

1. Préparer les concentrations de TDE de travail en utilisant une solution mère de TDE avec du PBS pour une concentration finale de 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 % et 60 % de volume à volume (v/v). Préparez au moins 2 ml de solution pour chaque échantillon d’œil afin de permettre à l’excès de volume de pénétrer dans le tissu.
2. Incuber les échantillons dans une plaque à 6 ou 12 puits à une concentration croissante de TDE. Commencez par immerger les globes oculaires entiers intacts dans une solution de TDE à 10 % pendant 2 à 4 h sur un agitateur à température ambiante. Transférer successivement l’échantillon à une concentration plus élevée de TDE pendant 2 à 4 h pour chaque concentration de TDE (figure 2C).
   REMARQUE : La rétine commence à s’éclaircir à des concentrations de 40 à 50 %, mais l’éclaircissement maximal se produit après l’incubation dans une solution à 60 %. La rétine devient moins transparente à des concentrations de 70 % et plus (figure 2D).
3. Arrêtez le processus de compensation pendant la nuit, si nécessaire, à l’une des étapes successives d’échange de compensation.

6. Imagerie de l’œil entier à l’aide d’une microscopie à feuillet de lumière

1. Monter les échantillons entiers intacts en tenant compte de la configuration de la plate-forme de microscope à feuillet de lumière utilisée. Suivez les instructions du microscope et du logiciel d’acquisition pour configurer les paramètres d’acquisition, y compris l’alignement de la feuille de lumière, l’éclairage et la détection des chemins optiques.
   REMARQUE : Les échantillons utilisés dans cette expérience ont été collés du côté de la cornée à l’extrémité d’une aiguille hypodermique sur une seringue à insuline (figure 2E). L’échantillon a ensuite été suspendu à l’intérieur de la chambre du microscope.
2. Remplissez la chambre du microscope avec 60 % de TDE comme solution de clarification.
3. Immerger l’échantillon dans la chambre du microscope à feuillet de lumière dans une solution TDE à 60 % (concentration finale de clarification).
4. Imagez l’œil dégagé au moyen d’une variété de microscopes confocaux et à feuillet de lumière commerciaux ou personnalisés. Dans ce protocole, un microscope à feuillet de lumière à éclairage double face est utilisé.
5. Utilisez l’imagerie à faible résolution et à faible grossissement (5x, NA 0,16) pour imager la morphologie cellulaire et le traçage des processus cellulaires, en particulier lorsqu’elle est associée à la mosaïque. Utilisez l’imagerie à haute résolution et à grossissement (20x, NA 1.0) pour imager à la fois la morphologie cellulaire et les grands organites subcellulaires tels que les noyaux et les amas mitochondriaux.

7. Traitement d’image post-acquisition

REMARQUE : Le traitement post-acquisition dépend du type de fichier et du logiciel compatible avec les fichiers imagés.

1. Appliquez un floutage ou une déconvolution pour augmenter davantage les images brutes avant d’assembler les tuiles imagées. Un filtre Weiner peut être appliqué pour déflouter les images. Alternativement, les images peuvent être déconvolutées de manière itérative après débruitage avec la déconvolution de Richardson-Lucy et une PSF théorique ou mesurée expérimentalement à l’aide d’outils de modélisation tels que le plugin ImageJ PSF^{generator 25}.
2. Effectuez l’assemblage de piles z prétraitées et des transformations de volumes affines et non rigides, suivies de l’enregistrement et de la fusion de volumes multi-vues à l’aide d’une variété de progiciels commerciaux ou du domaine public (ImageJ – plug-in BigStitcher⁾²⁶.

Résultats

Une projection à angle zéro du réseau vasculaire péripapillaire et de la microglie est illustrée à la figure 3A. De plus, la distribution intacte de la microglie de la rétine entière chez une souris CX3CR1-GFP est présentée à la figure 3B. Un avantage majeur de la méthode présentée ici, est sa capacité à imager des fluorophores innés. Les figures 3C, D mo...

Discussion

Le développement et les pathologies de la rétine et du vitré sont mieux étudiés avec des techniques d’imagerie de la rétine entière intacte dans lesquelles la rétine n’est pas coupée pour des coupes ou pour des préparations à montage plat. Les méthodes d’imagerie de l’œil entier intactes existantes intègrent soit le blanchiment pigmentaire, qui élimine les fluorophores innés, soit l’élimination physique des revêtements opaques du globe oculaire (EPR, choroïde...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Experimental animal
CX3CR1-GFP Mouse	The Jackson Laboratory	5582
Anesthetic
Dexmedetomidine	Par Pharmaceutical	42023-146-25
Ketamine	Fresenius Kabi
Tissue harvesting, fixation, and sample dissection
cardiac perfusion pump	Fisher scientific	NC9069235
Cyanoacrylate superglue	amazon.com
Fine scissors-sharp	Fine Science Tools	14160-10
Fine tweezers	Fine Science Tools	11412-11
Paraformaldehyde (PFA)	Electrone microscopy sciences	15710-S
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	10010049
size 1 painting brush	dickblick.com
straight spring scissors	Fine Science Tools	15000-03
syringe, needle tip, 27 gauge x 1.25"	BD
Tubes 1.5 ml, 15 ml, 50 ml	Thermo sceintific
Tween-20	ThermoFisher	85114
Immunofluorescent staining
Anti-mouse collagen IV antibody	Abcam	ab19808	1:200 dilution
Anti-rabbit Alexa Fluor 568	Invitreogen	A-11011	1:200 dilution
Normal goat serum	ThermoFisher	50062Z	10% concentration
Tissue clearing
2,2′-thiodiethanol (TDE)	Fluka analytica	STBD7772V
Rocking shaker	Fisher scientific	02-217-765
Microscopy
Fluorescent microspheres	TetraSpeck	T14792
Light sheet fluorescent microscope (LSFM)	Zeiss	Z1
Microglia enumeration
ImageJ	National Institue of Health