Dissezione microchirurgica e pulizia dei tessuti per l'imaging ad alta risoluzione dell'intera retina intatta e del vitreo

Riepilogo

Qui viene presentato un protocollo per l'imaging dell'intera retina intatta in cui gli strati esterni opachi/pigmentati del bulbo oculare vengono rimossi chirurgicamente e viene applicata la pulizia ottica per rendere trasparente la retina, consentendo la visualizzazione della retina periferica e della vascolarizzazione ialoide nella retina intatta utilizzando la microscopia fluorescente a foglio di luce.

Abstract

Le strutture neuronali e vascolari della retina in condizioni fisiologiche e patologiche possono essere meglio visualizzate e caratterizzate utilizzando tecniche di imaging dell'intera retina intatta rispetto alle preparazioni e alle sezioni retiniche flat mount convenzionali. Tuttavia, l'imaging immunofluorescente dell'intera retina intatta è ostacolato dai rivestimenti opachi del bulbo oculare, cioè la sclera, la coroide e l'epitelio pigmentato retinico (RPE) e dalle proprietà di diffusione della luce degli strati retinici che impediscono l'imaging ottico ad alta risoluzione a tutto spessore. Lo sbiancamento chimico degli strati pigmentati e i protocolli di pulizia dei tessuti sono stati descritti per affrontare questi ostacoli; tuttavia, i metodi attualmente descritti non sono adatti per l'imaging di molecole fluorescenti endogene come la proteina fluorescente verde (GFP) nell'intera retina intatta. Altri approcci hanno aggirato questa limitazione rimuovendo chirurgicamente gli strati pigmentati e il segmento anteriore del bulbo oculare consentendo l'imaging oculare intatto, sebbene la retina periferica e le strutture ialoidi fossero interrotte. Qui viene presentato un protocollo di imaging di immunofluorescenza della retina intera e del vitreo integro che combina la dissezione chirurgica degli strati di epitelio pigmentato sclera/coroide/retina (RPE) con un metodo di pulizia dei tessuti modificato e la microscopia fluorescente a foglio di luce (LSFM). Il nuovo approccio offre una visione senza precedenti degli elementi vascolari e neuronali imperturbati della retina, nonché del sistema vascolare vitreo e ialoide in condizioni patologiche.

Introduzione

L'interazione tra gli elementi retinici, neuronali e vascolari in stati sani e patologici è tradizionalmente esplorata mediante studi di immunofluorescenza su sezioni fisiche di tessuto retinico paraffina o crio-fissato o su preparazioni piatte della retina¹. Tuttavia, il sezionamento dei tessuti interrompe la continuità neuronale e vascolare della retina e, sebbene la ricostruzione tridimensionale delle sezioni retiniche adiacenti sia suggerita come possibile soluzione, è ancora soggetta a errori e artefatti. Le preparazioni a montaggio piatto della retina disturbano anche notevolmente l'integrità degli elementi vascolari e neuronali retinici e la connessione geografica tra aree retiniche adiacenti². In alternativa, è stato recentemente introdotto l'imaging della retina intera integra per visualizzare le proiezioni tridimensionali delle componenti neuronali e vascolari retiniche nella loro posizione anatomica naturale 2,3,4,5.

Nell'imaging dell'intera retina intatta, i segnali fluorescenti provenienti dagli elementi vascolari e neuronali delle aree retiniche adiacenti (piastrelle) di un'intera retina intatta vengono catturati utilizzando un microscopio a foglio ottico; Queste tessere vengono poi "cucite" insieme per ricostruire una visione tridimensionale dell'intera retina^intera 2,3,4,5,6. L'imaging dell'intera retina intatta fornisce una visione senza precedenti della retina per lo studio della patogenesi delle malattie vascolari, degenerative e infiammatorie retiniche 2,3,4,5,6. Ad esempio, Prahst et al. hanno rivelato una morfologia annodata precedentemente "non apprezzata" a ciuffi vascolari patologici, motilità cellulare anormale e dinamica dei filopodi alterata in un modello di retinopatia indotta da ossigeno (OIR) utilizzando l'imaging dal vivo di un'intera retina intatta². Allo stesso modo, Henning et al., Singh et al. e Chang et al. hanno dimostrato la complessa rete vascolare retinica tridimensionale in retine intere intatte ^3,4,6. Vigouroux et al. hanno utilizzato un metodo di imaging dell'intero occhio intatto per mostrare l'organizzazione della retina e le proiezioni visive nel periodo perinatale⁵. Al fine di essere in grado di creare tali viste tridimensionali senza precedenti della retina, i protocolli di imaging dell'intera retina intatta hanno superato due principali limitazioni: 1) la presenza di rivestimenti opachi e pigmentati del bulbo oculare (sclera, coroide e RPE) e 2) la limitata penetrazione della luce attraverso l'intero spessore della retina causata dalle proprietà di diffusione della luce degli strati nucleari e plessiformi della retina. Henning et al. e Vigouroux et al. hanno applicato lo sbiancamento H₂O₂ dei pigmenti coroidi/RPE in modo da poter visualizzare una retina intatta ^3,5. Tuttavia, lo sbiancamento non è adatto per ceppi animali con fluorofori endogeni come la proteina fluorescente verde (GFP) o dopo colorazioni immunofluorescenti in vivo ^3,5,7. Inoltre, il metodo di trattamento con H₂O₂ di Henning et al. è stato eseguito in condizioni acquose che possono generare microbolle che provocano il distacco della retina. Inoltre, il trattamento con H₂O₂ è stato eseguito a 55 °C, una condizione che deteriora ulteriormente l'affinità anticorpale tissutale. Inoltre, lo sbiancamento può introdurre una forte autofluorescenza originata dalla melanina⁸ ossidata. Altri protocolli di depigmentazione per sezioni oculari che utilizzano permanganato di potassio e acido ossalico sono stati in grado di rimuovere i pigmenti RPE nelle sezioni embrionali, ma questo metodo di depigmentazione ha anche dimostrato di ridurre l'efficacia dell'immunomarcatura ^9,10. In alternativa allo sbiancamento, Prahst et al., Singh et al. e Chang et al. hanno rimosso la sclera, la coroide e la cornea per rendere un'intera retina raggiungibile alla luce del microscopio ^2,4,6. Tuttavia, la rimozione della cornea, del cristallino e della retina periferica può distorcere e interrompere la retina periferica e i vasi ialoidi, rendendo questi metodi inadatti allo studio della retina periferica e del sistema vascolare ialoide.

Tutti i protocolli di imaging dell'intero occhio intatto attualmente disponibili includono l'uso di un passaggio di pulizia ottica dei tessuti per superare le proprietà di diffusione della luce degli strati retinici 2,3,4,5. La pulizia ottica dei tessuti rende la retina trasparente alla luce del microscopio equalizzando l'indice di rifrazione di un dato tessuto, in questo caso la retina, in tutti i suoi elementi cellulari e intercellulari per ridurre al minimo la dispersione e l'assorbimento della luce¹¹. La coroide e l'EPR devono essere rimosse o sbiancate prima che la pulizia ottica dei tessuti venga applicata alla retina poiché i rivestimenti pigmentati del bulbo oculare (coroide e RPE) non possono essere sufficientemente eliminati 6,12,13,14,15,16,17,18.

La partecipazione e i contributi del sistema vascolare vitreo e ialoide in condizioni patologiche come la retinopatia del prematuro (ROP), la vascolarizzazione fetale persistente (PFV), la malattia di Norrie e la malattia di Stickler sono meglio studiati quando la retina e i vasi ialoidi non vengono interrotti nella preparazione del tessuto 19,20,21,22,23. I metodi esistenti per l'imaging dell'intera retina intatta rimuovono il segmento anteriore dell'occhio, che interrompe naturalmente il vitreo e la sua vascolarizzazione, oppure applicano agenti sbiancanti, che possono rimuovere i fluorofori endogeni. Mancano i metodi pubblicati per visualizzare il corpo vitreo e il sistema vascolare nella loro condizione intatta e intatta. Descriviamo qui un metodo di imaging dell'intera retina e del vitreo che consiste nella dissezione chirurgica di rivestimenti pigmentati e opachi del bulbo oculare, una pulizia ottica del tessuto modificata ottimizzata per la retina e la microscopia fluorescente a foglio di luce. Di seguito sono descritte in dettaglio la preparazione del campione, la pulizia ottica dei tessuti, la microscopia a foglio ottico e le fasi di elaborazione delle immagini.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC) dell'Università del Texas. L'uso e la cura degli animali sono stati conformi alla dichiarazione dell'Associazione per la ricerca sulla visione e l'oftalmologia (ARVO) per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e sulla vista. Tutti i materiali necessari per eseguire questa procedura sono elencati nella Tabella dei Materiali. Indossare guanti senza polvere durante l'esecuzione di ogni passaggio. Per i passaggi 6 e 7, fare riferimento anche al manuale operativo ufficiale del microscopio.

1. Preparazione degli animali

1. Eutanasia dei topi sperimentali in conformità con il protocollo approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (qui è stata utilizzata l'anestesia con una combinazione di ketamina 60 mg/kg e dexmedetomidina 0,5 mg/kg seguita da lussazione cervicale). Procedere immediatamente alla stabilizzazione dell'animale su una piattaforma per la dissezione e la perfusione cardiaca.
   NOTA: Gli animali da esperimento vengono scelti in base al disegno dello studio individuale.
2. Seziona l'addome e il torace per esporre il cuore. Eseguire la perfusione cardiaca trasfondendo il cuore tramite un ago da 27 G posizionato nel ventricolo sinistro e creare una piccola incisione (~1 mm) nell'atrio destro per consentire l'uscita del sangue²⁴.
   1. In primo luogo, trasfondere 30-50 ml di soluzione salina bilanciata con fosfato ghiacciato (PBS) e poi 30-50 ml di paraformaldeide (PFA) al 4% preparata di recente.
   2. Per verificare la presenza di una trasfusione di PFA riuscita, verificare la presenza di contrazioni muscolari visibili in tutto il corpo e nella coda. Procedi alla fase di enucleazione.

2. Enucleazione e fissazione del bulbo oculare

1. Usa una pinza da gioielliere curva per spingere delicatamente sulla palpebra superiore o inferiore per forzare il bulbo oculare fuori dalla sua orbita. Usa un altro set di pinze da gioielliere o simili per perforare la congiuntiva dal lato e tenere il globo dal lato del nervo ottico. Sollevare lentamente il globo dalla sua sede fino a quando non viene reciso dal nervo ottico.
2. Trasferire il globo in un tubo contenente PFA ghiacciato al 4% appena preparato. Etichettare il tubo di conseguenza. Lasciare che il globo rimanga in PFA al 4% in frigorifero a 4 °C per 12 ore (tutta la notte).
   NOTA: Utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica con una punta tagliata per trasferire il globo. Allargare l'apertura della punta tagliata con una seconda punta per pipetta per evitare di danneggiare il campione con spigoli vivi.

3. Dissezione del campione (Figura 1 e Figura 2)

1. Al microscopio, individuare la giunzione cornea-sclera (Figura 1A) e utilizzare la punta affilata di un ago da 30 G per eseguire un taglio molto superficiale sulla sclera a circa 0,5-1 mm dietro la giunzione cornea-sclera (Figura 1B).
2. Far avanzare una delle lame di una punta affilata con le forbici da dissezione attraverso l'incisione appena praticata nello spazio potenziale tra la sclera/coroide/RPE e la retina (Figura 1C). Far avanzare le forbici e tagliare circonferenzialmente fino a quando la sclera/coroide/RPE può essere staccata dalla superficie esterna della retina (Figura 1D,E).
   NOTA: È importante eseguire questo passaggio lentamente e delicatamente per evitare di perforare la retina. I primi tagli sono particolarmente critici per evitare di tagliare la retina.
3. Se necessario, eseguire tagli rilassanti radiali sulla sclera/coroide/RPE per facilitare il processo di taglio circonferenziale e il successivo peeling del nervo ottico e della sclera/coroide/RPE. Rimuovere piccole macchie di RPE (Figura 1F) utilizzando un pennello da pittura di misura 1 imbevuto di PBS.
4. Trasferire l'intero bulbo oculare intatto in una provetta contenente PBS. Procedere immediatamente alla fase successiva o conservare a 4 °C per l'immunomarcatura.
   NOTA: I segni possono essere posizionati sul bulbo oculare dopo l'enucleazione e poi, dopo la dissezione, per preservare l'orientamento dell'occhio, se necessario. Il protocollo può essere messo in pausa e i campioni possono essere conservati per una notte in un frigorifero a 4 °C prima di procedere con le fasi successive.

4. Colorazione vascolare

1. Permeabilizzare il tessuto immergendolo in PBS contenente lo 0,2% di Tween-20 a temperatura ambiente per 20 minuti.
2. Lavare il campione con PBS 3 volte su un agitatore per 10 minuti.
3. Incubare il campione con il 5% di siero normale di capra (NGS) in PBS contenente lo 0,25% di Triton X-100 a temperatura ambiente per 1 ora.
4. Incubare con l'anticorpo primario a 4 °C per una notte. In questo caso, è stato utilizzato un anticorpo anti-collagene IV di topo (la concentrazione finale è stata preparata in PBS contenente lo 0,2% di Tween-20).
5. Lavare 3 volte con PBS, per 5 minuti per lavaggio.
6. Incubare il campione con anticorpi secondari marcati con fluorescenza. In questo caso, un Alexa Fluor 568 anti-coniglio è stato utilizzato per 12 ore a 4 °C (diluizione 1:200 in PBS contenente lo 0,2% di Tween-20).
7. Lavare con PBS 3 volte, per 1 ora ciascuna, e poi procedere con le fasi di pulizia dei tessuti.

5. Pulizia ottica con 2,2′-tiodietanolo (TDE)

1. Preparare le concentrazioni di TDE di lavoro utilizzando la soluzione madre di TDE con PBS per una concentrazione finale del 10%, 20%, 30%, 40%, 50% e 60% da volume a volume (v/v). Preparare almeno 2 mL di soluzione per ciascun campione oculare in modo da consentire un volume in eccesso sufficiente a penetrare nel tessuto.
2. Incubare i campioni in un pozzetto a 6 o 12 pozzetti a concentrazione crescente di TDE. Iniziare immergendo i bulbi oculari interi intatti in una soluzione di TDE al 10% per 2-4 ore su un agitatore a temperatura ambiente. Successivamente, trasferire il campione a una concentrazione di TDE più elevata per 2-4 ore in ciascuna concentrazione di TDE (Figura 2C).
   NOTA: La retina inizia a schiarirsi a concentrazioni del 40%-50%, ma la massima schiaritura si verifica dopo l'incubazione in una soluzione al 60%. La retina diventa meno trasparente a concentrazioni del 70% e superiori (Figura 2D).
3. Interrompere il processo di compensazione durante la notte, se necessario, in una qualsiasi delle successive fasi di scambio della compensazione.

6. Imaging dell'intero occhio utilizzando una microscopia a foglio di luce

1. Montare i campioni di occhio interi intatti considerando la configurazione della piattaforma del microscopio a foglio luminoso in uso. Seguire le istruzioni del microscopio e del software di acquisizione per impostare i parametri di acquisizione, tra cui l'allineamento del foglio luminoso e l'illuminazione e il rilevamento dei percorsi ottici.
   NOTA: I campioni utilizzati in questo esperimento sono stati incollati dal lato della cornea alla punta di un ago ipodermico su una siringa da insulina (Figura 2E). Il campione è stato poi sospeso all'interno della camera del microscopio.
2. Riempire la camera del microscopio con il 60% di TDE come soluzione di pulizia.
3. Immergere il campione all'interno della camera del microscopio a foglio luminoso in una soluzione di TDE al 60% (la concentrazione finale di clearing).
4. Immagini dell'occhio schiarito per mezzo di una varietà di microscopi confocali e a foglio di luce commerciali o personalizzati. In questo protocollo, viene utilizzato un microscopio a foglio luminoso a doppia illuminazione laterale.
5. Utilizza l'imaging a bassa risoluzione e basso ingrandimento (5x, NA 0,16) per visualizzare la morfologia cellulare e il tracciamento dei processi cellulari, soprattutto se combinato con la piastrellatura. Utilizza l'imaging ad alta risoluzione e ingrandimento (20x, NA 1.0) per visualizzare sia la morfologia cellulare che i grandi organelli subcellulari come nuclei e cluster mitocondriali.

7. Elaborazione delle immagini post-acquisizione

NOTA: L'elaborazione post-acquisizione dipende dal tipo di file e dal software compatibile con i file di immagine.

1. Applica la rimozione della sfocatura o la deconvoluzione per aumentare ulteriormente le immagini raw prima di unire le tessere dell'immagine. È possibile applicare un filtro Weiner per sfocare le immagini. In alternativa, le immagini possono essere deconvolute iterativamente dopo il denoising con la deconvoluzione di Richardson-Lucy e una PSF teorica o misurata sperimentalmente utilizzando strumenti di modellazione come il plug-in²⁵ del generatore PSF di ImageJ.
2. Esegui lo stitching di z-stack pre-elaborati e trasformazioni di volume affini e non rigide seguite dalla registrazione e fusione del volume multi-view utilizzando una varietà di pacchetti software commerciali o di pubblico dominio (ImageJ – plug-in BigStitcher)²⁶.

Risultati

Una proiezione ad angolo zero della rete vascolare peripapillare e della microglia è mostrata nella Figura 3A. Inoltre, la Figura 3B presenta la distribuzione intatta dell'intera microglia retinica in un topo CX3CR1-GFP. Uno dei principali vantaggi del metodo qui presentato è la sua capacità di visualizzare i fluorofori innati. La Figura 3C,D mostra le microglia in pro...

Discussione

Lo sviluppo e le patologie della retina e del vitreo sono studiati al meglio con tecniche di imaging della retina intera integra in cui la retina non viene tagliata per sezioni o per preparazioni a montaggio piatto. I metodi di imaging dell'intero occhio intatto esistenti incorporano lo sbiancamento del pigmento, che rimuove i fluorofori innati, o comportano la rimozione fisica dei rivestimenti opachi del bulbo oculare (RPE, coroide e sclera) insieme al segmento anteriore dell'occhio, ch...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Experimental animal
CX3CR1-GFP Mouse	The Jackson Laboratory	5582
Anesthetic
Dexmedetomidine	Par Pharmaceutical	42023-146-25
Ketamine	Fresenius Kabi
Tissue harvesting, fixation, and sample dissection
cardiac perfusion pump	Fisher scientific	NC9069235
Cyanoacrylate superglue	amazon.com
Fine scissors-sharp	Fine Science Tools	14160-10
Fine tweezers	Fine Science Tools	11412-11
Paraformaldehyde (PFA)	Electrone microscopy sciences	15710-S
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	10010049
size 1 painting brush	dickblick.com
straight spring scissors	Fine Science Tools	15000-03
syringe, needle tip, 27 gauge x 1.25"	BD
Tubes 1.5 ml, 15 ml, 50 ml	Thermo sceintific
Tween-20	ThermoFisher	85114
Immunofluorescent staining
Anti-mouse collagen IV antibody	Abcam	ab19808	1:200 dilution
Anti-rabbit Alexa Fluor 568	Invitreogen	A-11011	1:200 dilution
Normal goat serum	ThermoFisher	50062Z	10% concentration
Tissue clearing
2,2′-thiodiethanol (TDE)	Fluka analytica	STBD7772V
Rocking shaker	Fisher scientific	02-217-765
Microscopy
Fluorescent microspheres	TetraSpeck	T14792
Light sheet fluorescent microscope (LSFM)	Zeiss	Z1
Microglia enumeration
ImageJ	National Institue of Health