فائق السرعة الغربية لطخة باستخدام تقنية تحسين رد المناعة

Summary

يتم تطوير تقنية النشاف الغربية فائقة السرعة من خلال تحسين حركية الأجسام المضادة المضادة المضادة الملزمة من خلال تقنية تجفيف الدوريات وتجديدها (CDR) بالاقتران مع عامل تعزيز رد المناعة.

Abstract

البقعة الغربية (المعروفة أيضا باسم مناعي) هي طريقة متعارف عليها لأبحاث الطب الحيوي. ويستخدم عادة لتحديد الحجم النسبي ووفرة بروتينات محددة، فضلا عن تعديلات البروتين بعد الترجمة. هذه التقنية لها تاريخ غني وتبقى في الاستخدام على نطاق واسع بسبب بساطتها. ومع ذلك ، فإن إجراء النشاف الغربي يستغرق ساعات ، حتى أيام ، لإكمال ، مع اختناق حرج هو أوقات الحضانة الطويلة التي تحد من الإنتاجية. هذه الخطوات الحضانة مطلوبة بسبب الانتشار البطيء للأجسام المضادة من المحلل السائبة إلى المستضدات المُشلّة على الغشاء: تركيز الأجسام المضادة بالقرب من الغشاء أقل بكثير من التركيز الأكبر. هنا، نقدم ابتكاراً يقلل بشكل كبير من فترات الحضانة هذه من خلال تحسين الربط المستضدي عن طريق استنزاف دوري وتجديد (CDR) من محلول الأجسام المضادة. كما استخدمنا تقنية تعزيز رد الفعل المناعي للحفاظ على حساسية الفحص. عزز مزيج من طريقة CDR مع عامل تحسين المناعة التجارية إشارة الإخراج وخفض بشكل كبير وقت حضانة الأجسام المضادة. يمكن إنجاز البقعة الغربية فائقة السرعة الناتجة في 20 دقيقة دون أي خسارة في الحساسية. ويمكن تطبيق هذه الطريقة على البقع الغربية باستخدام كل من chemiluminescent والكشف الفلورسنت. يسمح هذا البروتوكول البسيط للباحثين باستكشاف تحليل تعبير البروتين بشكل أفضل في العديد من العينات.

Introduction

البقعة الغربية (المعروفة أيضا باسم مناعي) هي تقنية قوية وأساسية عبر مجموعة واسعة من التخصصات العلمية والسريرية. وتستخدم هذه التقنية لدراسة وجود, وفرة النسبية, كتلة جزيئية نسبية, والتعديلات بعد تحويل البروتينات¹. جنبا إلى جنب مع تحليل الصور الرقمية، يمكن لهذه الطريقة تحليل موثوق وفرة من البروتينات والتعديلات البروتين². على الرغم من أن يتم تنفيذ لطخة الغربية بشكل روتيني، بل هو وسيلة تستغرق وقتا طويلا والعمل المكثف. يتطلب حضانة طويلة من الأجسام المضادة مع الأغشية. هنا، نحن وصف تعديل طريقة الحضانة التي تتغلب على هذا القيد دون التضحية الحساسية.

أثناء حضانة الغشاء ، تطفو الأجسام المضادة في محلول بينما يتم تثبيت المستضدات على الغشاء. بسبب تقاربها عالية، ومعدل للجسم المضاد ملزمة المستضد هو أسرع من انتشار الأجسام المضادة من المحلل السائبة إلى الغشاء. وهذا يخلق تركيز منخفض "طبقة استنزاف"(الشكل 1). قد يستغرق ساعات للأجسام المضادة أكثر بعدا للوصول إلى الغشاء عن طريق الانتشار السلبي، الذي هو العامل الرئيسي المسؤول عن أوقات الحضانة الطويلة في هذه التقنية. هذا التأثير يسمى قيود النقل الجماعي (MTL)³. وقد اقترح أن استنزاف المتكررة وتجديد حل الأجسام المضادة التي تحتوي على قد تعطل طبقة الاستنفاد والتغلب على MTL⁴. هنا ، قمنا بتصميم تقنية فريدة من نوعها تنفذ هذا المفهوم استنزاف وتجديد دوري (CDR) لتقليل تأثير MTL في بروتوكول النشاف الغربي التقليدي وتقصير فترة الحضانة المطلوبة بشكل ملاحظ.

من أجل الحفاظ على حساسية الكشف مع فترة حضانة قصيرة ، قمنا باستخدام تقنية تعزيز رد المناعة التي تسرع تفاعل مستضد الأجسام ، وبالتالي تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء^5. العديد من العوامل المتاحة تجاريا تعزيز رد الفعل المناعي (IRE) تتكون من 2 مكونات (الحل 1 و 2، انظر جدول المواد). لم يتم الكشف عن تكوين الملكية أو آلية عمل IRE ، ولكننا وجدنا سابقا أن IRE انخفض ثابت الانفصام بين المستضد والأجسام المضادة في مرحلة صلبة ملزمة المستويات ، مما يدل على زيادة تقارب ، على الأقل جزئيا ، مسؤولة عن تعزيز تأثير IRE⁶. مزيج من CDR مع IRE ينتج بروتوكول النشاف الغربية فائقة السرعة التي تقلل من الوقت الإجراء بأكمله دون التضحية الحساسية.

Protocol

1. SDS-PAGE ونقلها إلى غشاء PVDF

1. قم بإجراء SDS-PAGE لفصل البروتينات بناءً على الحجم النسبي.
   ملاحظة: أي نظام هلام التجاري أو منزلي الصنع على ما يرام. الرجاء اتباع بروتوكول الشركة المصنعة.
2. نقل البروتينات المنفصلة من هلام على غشاء PVDF.
   ملاحظة: طرق النقل الشائعة (شبه الجافة أو نقل الرطب) هي مناسبة. الرجاء اتباع بروتوكول الشركة المصنعة.

2. حجب أغشية PVDF

1. احتضان الأغشية في مخازن منع مناسبة لمدة 1 ساعة مع التحريض في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: استناداً إلى الأجسام المضادة الأولية ونظام الكشف، يجب تحديد مخزن حظر مناسب. على سبيل المثال، فإن حاصرات الأكثر نموذجية هي BSA، والحليب الجاف غير الدهني، والكاسين، والبوليمرات الاصطناعية التجارية. برنامج تلفزيوني و / أو TBS مع 0.1٪ Tween20 هي المخازن الأكثر استخداما. قد يتم هذا الحظر خطوة بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.

3. حضانة مع الأجسام المضادة الأولية

1. إعداد 10٪ من العلاج المناعي تعزيز وكيل-1 حل (IRE-1) مع الماء المقطر. دوامة جيدا.
2. إعداد الأجسام المضادة الأولية المخففة مع 10٪ IRE-1. امزجه بلطف ودقة.
3. إذا كان استخدام غشاء أكبر (4 سم × 8 سم – 8 سم × 8 سم)، أضف 8 مل من محلول الأجسام المضادة إلى أنابيب أجهزة طرد مركزي مخروطية 50 مل. إذا كان استخدام غشاء أصغر (2 سم × 8 سم – 4 سم × 8 سم)، أضف 3 مل من محلول الأجسام المضادة إلى أنبوب البولي بروبلين دائري القاع 14 مل(جدول المواد).
4. التقط غشاء PVDF مع ملاقط واستنزاف محلول الحجب لفترة وجيزة. أدخل غشاء PVDF في هذا الأنبوب بأصابع قفازة وتأكد من أن الغشاء بأكمله يتمسك بجدار الأنبوب. عندما يتم إدخال غشاء PVDF في أنبوب، وجه "الجانب البروتين" من الغشاء الذي كان في الأصل في اتصال مع هلام الداخل. أغلق الغطاء بإحكام.
5. أدخل أنبوب 50 مل في زجاجة فرن التهجين.
   ملاحظة: عندما يتم استخدام 14 مل أنابيب لهذه الحضانة، أدخل أنبوب 14 مل في أنبوب 50 مل، وذلك باستخدام زوج من أصحاب حلقة بلاستيكية للحفاظ على أنبوب الداخلية في وسط أنبوب 50 مل.
6. بدوره على فرن التهجين.
7. احتضان الغشاء مع دوران 6 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق على الأقل.
   ملاحظة: تأكد من أن الغشاء يتمسك بالجدران في جميع الأوقات وأن الأنبوب (الداخلي) أفقي لتغطية الغشاء بمحلول الأجسام المضادة بالتساوي. معايرة تخفيف الأجسام المضادة ووقت الحضانة قبل التجربة الفعلية.

4. غسل الأغشية

1. أوقفوا الدوران
2. إزالة بعناية غشاء PVDF من الأنبوب مع ملاقط، ووضع الغشاء في وعاء مع 50 مل من برنامج تلفزيوني-T.
3. شطف الغشاء لفترة وجيزة مع برنامج تلفزيوني-T.
4. شطف الغشاء في الحاوية بالماء المقطر حتى لا تظهر فقاعات. هذا هو لإزالة غالبية الأجسام المضادة.
5. نقل غشاء PVDF من الحاوية إلى سلطة الدوار التي تحتوي على 250 مل من برنامج تلفزيوني-T.
6. ضع سلة المصفاة في الدوار. تأكد من أن الغطاء قد تم وضعه بشكل آمن.
7. تفعيل الدوار وتشغيله لحوالي 20-30 s.
8. تجاهل الحل وشطف لفترة وجيزة داخل الدوار مع الماء المقطر.
9. إضافة 250 مل من برنامج تلفزيوني-T في الدوار مرة أخرى.
10. كرر الخطوات 4.6 و 4.7.

5. حضانة مع الأجسام المضادة الثانوية

1. إعداد 10٪ من العلاج المناعي تعزيز وكيل-2 حل (IRE-2) مع الماء المقطر. دوامة جيدا.
2. إعداد الأجسام المضادة الثانوية المخففة مع 10٪ IRE-2. امزجه بلطف ودقة.
3. حدد حجم محلول الأجسام المضادة وأنبوب كما هو مذكور في الخطوة 3.3.
4. التقط غشاء PVDF مع ملاقط واستنزاف المحلول لفترة وجيزة. أدخل غشاء PVDF في الأنبوب كما هو مذكور في الخطوة 3.4.
5. أدخل أنبوب 50 مل في زجاجة فرن التهجين.
6. بدوره على فرن التهجين.
7. احتضان الغشاء مع دوران 6 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق على الأقل. تأكد من أن الغشاء يتمسك الجدار في جميع الأوقات وأن الأنبوب (الداخلي) أفقي لتغطية الغشاء بالتساوي مع حل الأجسام المضادة.
   ملاحظة: معايرة وقت الحضانة قبل التجربة الفعلية. عندما يكون الجسم المضاد الثانوي مترافقاً بالفلورسنت، قم بإجراء الحضانة في الظلام.

6. غسل الأغشية

1. اتبع الخطوات 4.1 إلى 4.10.

7. الحصول على صورة

1. الكشف Chemiluminescent
   1. ضع قطعة من فيلم مرن شبه زراعة (10 سم × 15 سم) على سطح مستو.
   2. مزيج 2 مكونات الركيزة chemiluminescent في أنبوب 5 مل.
   3. نقل على الفور 1.5 مل من الركيزة المختلطة إلى فيلم مرن شبه زرع ووضع غشاء PVDF على ذلك. ثم، نقل بقية محلول الركيزة إلى الغشاء.
   4. احتضان غشاء PVDF مع الركيزة المختلطة على فيلم مرنة شبه شفافة لمدة 1 دقيقة.
   5. التقط غشاء PVDF مع ملاقط واستنزاف محلول الركيزة لفترة وجيزة.
   6. شطيرة الغشاء بين زوج من أفلام الشفافية.
   7. الحصول على الصورة تحت وضع chemiluminescent.
2. الكشف عن الفلورسنت
   1. التقط غشاء PVDF مع ملاقط واستنزاف المحلول لفترة وجيزة.
   2. شطيرة الغشاء بين زوج من أفلام الشفافية.
   3. الحصول على الصورة تحت وضع الفلورسنت.
      ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوتين 7.1 و 7.2 على مقربة من آلة التصوير لضمان أقصى حساسية.
   4. عندما تكون إشارة الخلفية عالية، قم بإجراء خطوة غسيل في حاوية مع 80-100 مل من PBS-T: 10 دقيقة شطف 3 مرات للجسم المضاد الأساسي و 5 دقائق شطف 6 مرات للجسم المضاد الثانوي.
      ملاحظة: يمكن استخدام كل من الأجسام المضادة الأولية والثانوية المخففة مع حلول IRE 10٪ ما يصل إلى 8-10 مرات دون فقدان الحساسية^6. يجب أن يبقى الحل عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر.

النتائج

يوضح هذا المثال فعالية طريقة CDR مع تقنية المناعة على البقع الغربية. تم إجراء حضانة ثابتة على فيلم مرن شبه شفاف حيث تم احتضان أغشية PVDF مع محلول الأجسام المضادة ، في حين أن حضانة CDR كانت في فرن التهجين عن طريق تدوير الأنابيب التي تحتوي على الأغشية وحل الأجسام المضادة (Movie). ويبين الش?...

Discussion

لطخة الغربية هي تقنية تحليلية تستخدم على نطاق واسع للكشف عن بروتينات محددة التي تم تطويرها ~ قبل 40 عاما^7،8. ومنذ ذلك الحين، استمرت هذه التقنية في التطور، مع الابتكارات اللاحقة تحسين حساسية وسرعة، وكمية من تقنية^2،9،

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, Graduated, with Snap Cap	Falcon	352059
Apollo Transparency Film for Laser Printers	N/A	N/A	Any kinds of Laser Printer Transparency Film are fine.
Azure Imaging System 600	Azure Biosystems	Azure 600	Any kind of Image Acquiring Sytem is fine for chemiluminescent and/or fluorescent detection.
Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution	TOYOBO	NKB-101
CARNATION Instant Nonfat Dry Milk	Carnation	N/A
ECL anti-mouse IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from sheep	GE Healthcare	NA9310V
ECL anti-rabbit IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from donkey	GE Healthcare	NA9340V
HYBAID Micro-4	N/A	N/A	Any hybridization oven is fine as long as the tubes are rotated evenly at a horizontal position.
Immobilon-P PVDF Membrane, 0.45 µm pore size	Millipore Sigma	IPVH304F0
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody	LICOR	926-68070
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody	LICOR	926-32211
KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate	seracare	5430-0049
Mouse anti-ß actin antibody	Millipore Sigma	A5316
Odyssey Blocking Buffer (PBS)	LICOR	927-40100	Blocking Buffer for fluorescent detection
OXO Salad Spinner	OXO	32480V2B	Any salad spinner is fine as long as the PVDF membranes are rinsed vigorously without tear.
Parafilm Sealing Film	Bemis	Parafilm M PM996	semi-transparent flexible film
Polyethylene Flat-Top Screw Caps for 50 mL Conical Bottom Centrifuge Tubes	Falcon	352070
Rings to hold 14 ml tube in the center of 50 ml tube	N/A	N/A	Prepared in a machine shop
Rabbit anti-6X His tag antibody	Abcam	ab9108
Tween20	Millipore Sigma	P2287