כתם מערבי במהירות גבוהה במיוחד באמצעות טכנולוגיית שיפור Immunoreaction

Summary

טכניקת סופג מערבית במהירות גבוהה במיוחד מפותחת על ידי שיפור הקינטיקה של אנטיגן-נוגדנים מחייב באמצעות ניקוז מחזורי וחידוש (CDR) טכנולוגיה בשילוב עם סוכן שיפור immunoreaction.

Abstract

כתם מערבי (באנגלית: Western blot) היא שיטה קנונית למחקר ביו-רפואי. הוא משמש בדרך כלל כדי לקבוע את הגודל היחסי ואת השפע של חלבונים ספציפיים, כמו גם שינויים בחלבון שלאחר התרגום. טכניקה זו יש היסטוריה עשירה ונשאר בשימוש נרחב בשל הפשטות שלה. עם זאת, הליך הבליעה המערבי המפורסם לוקח שעות, אפילו ימים, כדי להשלים, עם צוואר בקבוק קריטי להיות זמני הדגירה הארוכים המגבילים את התפוקה שלה. צעדי דגירה אלה נדרשים עקב דיפוזיה איטית של נוגדנים מהתמיסה בתפזורת לאנטיגנים משותקים על הממברנה: ריכוז הנוגדנים ליד הממברנה נמוך בהרבה מהריכוז בצובר. כאן, אנו מציגים חידוש המפחית באופן דרמטי מרווחי דגירה אלה על ידי שיפור כריכת אנטיגן באמצעות ניקוז מחזורי וחידוש (CDR) של פתרון הנוגדנים. השתמשנו גם בטכנולוגיה לשיפור האימונוריאציה כדי לשמר את הרגישות של ההסתעפות. שילוב של שיטת CDR עם סוכן שיפור אימונוריאציה מסחרי הגביר את אות הפלט והפחית באופן משמעותי את זמן הדגירה של הנוגדנים. הכתם המערבי במהירות גבוהה במיוחד יכול להתבצע בתוך 20 דקות ללא כל אובדן רגישות. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כתמים מערביים באמצעות זיהוי chemiluminescent ו פלואורסצנטי. פרוטוקול פשוט זה מאפשר לחוקרים לחקור טוב יותר את הניתוח של ביטוי חלבון בדגימות רבות.

Introduction

כתם מערבי (ידוע גם בשם immunoblot) היא טכניקה חזקה ויסודית על פני מגוון רחב של דיסציפלינות מדעיות וקליניות. טכניקה זו משמשת לבחינת הנוכחות, השפע היחסי, המסה המולקולרית היחסית והשינויים שלאחר התרגום של חלבונים¹. בשילוב עם ניתוח תמונה דיגיטלית, שיטה זו יכולה לנתח באופן אמין את שפע החלבונים ושינויי החלבון². למרות כתם המערבי מבוצע באופן שגרתי, היא שיטה זמן רב ועבודה אינטנסיבית. דגירה ארוכה של הנוגדן עם ממברנות נדרשים. כאן, אנו מתארים שינוי בשיטת הדגירה המתגברת על מגבלה זו מבלי להקריב רגישות.

במהלך הדגירה של הממברנה, נוגדנים צפים בתמיסה בעוד אנטיגנים משותקים על הממברנה. בגלל הזיקה הגבוהה שלהם, שיעור הנוגדנים המחייבים את האנטיגן מהיר יותר מפיזור הנוגדנים מהתמיסה בתפזורת לקרום. פעולה זו יוצרת "שכבת דלדול" בריכוז נמוך (איור 1). זה עלול לקחת שעות עבור נוגדנים רחוקים יותר להגיע לקרום באמצעות דיפוזיה פסיבית, שהוא הגורם העיקרי האחראי על זמני דגירה ארוכים בטכניקה זו. אפקט זה נקרא הגבלת הסעת המונים (MTL)³. הוצע כי ניקוז חוזר ונשנה וחידוש הפתרון המכיל נוגדנים עלול לשבש את שכבת הדלדול ולהתגבר על MTL⁴. כאן, פיתחנו טכניקה ייחודית המיישמת את המושג הזה ניקוז מחזורי וחידוש (CDR) כדי להפחית את ההשפעה של MTL בפרוטוקול סופג מערבי מסורתי ולקצר באופן הערות את תקופת הדגירה הנדרשת.

על מנת לשמור על רגישות הגילוי עם זמן דגירה קצר, עשינו שימוש בטכנולוגיה לשיפור אימונוריאציה המאיצה את תגובת האנטיגן-נוגדנים, ובכך משפרת את יחס האות לרעש⁵. סוכנים רבים לשיפור האימונו-ראציה הזמינים מסחרית (IRE) מורכבים מ-2 רכיבים (פתרון 1 ו-2, ראו טבלת חומרים). ההרכב הקנייני או מנגנון הפעולה של IRE לא נחשפו, אך מצאנו בעבר כי IRE הפחית את קבוע הדיסוציאציה בין האנטיגן והנוגדן ב מבחני כריכת פאזה מוצקים, מה שמצביע על זיקה מוגברת היא, לפחות בחלקה, אחראית לשיפור ההשפעה של IRE⁶. השילוב של CDR עם IRE מניב פרוטוקול נפיחות מערבי במהירות גבוהה במיוחד המפחית את זמן ההליך כולו מבלי להתפשר על הרגישות.

Protocol

1. SDS-PAGE והעברה לקרום PVDF

1. בצעו SDS-PAGE להפרדת חלבונים לפי גודל יחסי.
   הערה: כל מערכת ג'ל מסחרית או ביתית היא בסדר. נא פעל בהתאם לפרוטוקול היצרן.
2. מעבירים חלבונים מופרדים מג'ל לקרום PVDF.
   הערה: שיטות העברה נפוצות (העברה יבשה למחצה או רטובה) מתאימות. נא פעל בהתאם לפרוטוקול היצרן.

2. חסימת קרום PVDF

1. דגירה את הממברנות במאגרי חסימה מתאימים במשך 1 שעות עם עצבנות בטמפרטורת החדר.
   הערה: בהתאם למערכת הנוגדנים והזיהוי העיקרית, יש לבחור מאגר חסימה מתאים. לדוגמה, החוסמים האופייניים ביותר הם BSA, חלב יבש דל שומן, קזאין ופולימרים סינתטיים מסחריים. PBS ו/או TBS עם 0.1% Tween20 הם המאגרים הנפוצים ביותר. שלב חסימה זה יכול להיעשות בן לילה ב 4 מעלות צלזיוס.

3. דגירה עם נוגדן ראשוני

1. הכן 10% שיפור אימונוריאציה סוכן-1 פתרון (IRE-1) עם מים מזוקקים. וורטקס היטב.
2. הכינו את הנוגדן העיקרי המדולל עם 10% IRE-1. מערבבים אותו בעדינות וביסודיות.
3. אם משתמשים בקרום גדול יותר (4 ס"מ x 8 ס"מ – 8 ס"מ x 8 ס"מ), מוסיפים 8 מ"ל של פתרון הנוגדנים לצינורות צנטריפוגה חרוטים של 50 מ"ל. אם משתמשים בקרום קטן יותר (2 ס"מ x 8 ס"מ – 4 ס"מ x 8 ס"מ), מוסיפים 3 מ"ל של פתרון הנוגדנים לצינור פוליפרופילן עגול 14 מ"ל(שולחן החומרים).
4. להרים את קרום PVDF עם פינצטה ולנקות את פתרון החסימה לזמן קצר. הכנס את קרום PVDF לתוך צינור זה עם אצבעות כפפות ולהבטיח כי הממברנה כולה נצמדת לקיר הצינור. כאשר קרום PVDF מוכנס לתוך צינור, פנים "צד החלבון" של הממברנה כי היה במקור במגע עם הג'ל פנימה. סגור את המכסה בחוזקה.
5. הכנס את הצינור 50 מ"ל לתוך בקבוק זכוכית לתנור הכלאה.
   הערה: כאשר צינורות 14 מ"ל משמשים דגירה זו, להכניס צינור 14 מ"ל לתוך הצינור 50 מ"ל, באמצעות זוג מחזיקי טבעת פלסטיק כדי לשמור על הצינור הפנימי במרכז הצינור 50 מ"ל.
6. הפעל את תנור ההכלאה.
7. דגירה הממברנה עם סיבוב 6 סל"ד לפחות 5 דקות.
   הערה: ודא כי הממברנה נצמדת לקיר בכל עת וכי הצינור (הפנימי) הוא אופקי כדי לכסות את הממברנה עם פתרון הנוגדן באופן שווה. כייל את הדילול של זמן הנוגדן והדגירה לפני הניסוי עצמו.

4. שטיפת ממברנות

1. עצור את הסיבוב.
2. בזהירות להסיר את קרום PVDF מהצינור עם פינצטה, ומניחים את הממברנה לתוך מיכל עם 50 מ"ל של PBS-T.
3. יש לשטוף את הממברנה לזמן קצר באמצעות PBS-T.
4. יש לשטוף את הממברנה במיכל במים מזוקקים עד שלא יופיעו בועות. זה כדי להסיר את רוב הנוגדן.
5. מעבירים את קרום ה-PVDF מהמכל לטווח הסלט המכיל 250 מ"ל של PBS-T.
6. מניחים את סל מסננת ספינר. ודא שהמכסה הונח בצורה מאובטחת.
7. הפעל את ספינר ולהפעיל אותו במשך כ 20-30 שניות.
8. להשליך את הפתרון ולשטוף בקצרה את החלק הפנימי של ספינר עם מים מזוקקים.
9. הוסף 250 מ"ל של PBS-T לתוך ספינר שוב.
10. חזור על שלבים 4.6 ו- 4.7.

5. דגירה עם הנוגדן המשני

1. הכן 10% שיפור אימונוריאציה סוכן-2 פתרון (IRE-2) עם מים מזוקקים. וורטקס היטב.
2. הכינו את הנוגדן המשני המדולל עם 10% IRE-2. מערבבים אותו בעדינות וביסודיות.
3. בחר את נפח פתרון הנוגדנים והצינור כאמור בשלב 3.3.
4. להרים את קרום PVDF עם פינצטה ולנקות את הפתרון בקצרה. הכנס את קרום PVDF לתוך הצינור כאמור בשלב 3.4.
5. הכנס את הצינור 50 מ"ל לתוך בקבוק זכוכית לתנור הכלאה.
6. הפעל את תנור ההכלאה.
7. דגירה הממברנה עם סיבוב 6 סל"ד לפחות 5 דקות. ודא כי הממברנה נצמדת לקיר בכל עת וכי הצינור (הפנימי) הוא אופקי כדי לכסות באופן שווה את הממברנה עם פתרון הנוגדן.
   הערה: כייל את זמן הדגירה לפני הניסוי עצמו. כאשר הנוגדן המשני מצומד באופן פלואורסצנטי, בצע את הדגירה בחושך.

6. שטיפת ממברנות

1. בצע את שלבים 4.1 עד 4.10.

7. רכישת תמונה

1. זיהוי צ'מילומינסנטי
   1. מניחים חתיכת סרט גמיש חצי השתלה (10 ס"מ x 15 ס"מ) על משטח שטוח.
   2. מערבבים 2 מרכיבים של המצע המלומינסנטי בצינור 5 מ"ל.
   3. להעביר מיד 1.5 מ"ל של המצע המעורב לסרט חצי השתלה גמיש ומניחים את קרום PVDF על זה. לאחר מכן, להעביר את שאר פתרון המצע על הממברנה.
   4. דגירה קרום PVDF עם מצע מעורב על סרט גמיש שקוף למחצה במשך 1 דקות.
   5. להרים את קרום PVDF עם פינצטה ולנקות את פתרון המצע בקצרה.
   6. כריך הממברנה בין זוג סרטי שקיפות.
   7. לרכוש את התמונה תחת מצב chemiluminescent.
2. זיהוי פלואורסצנטי
   1. להרים את קרום PVDF עם פינצטה ולנקות את הפתרון בקצרה.
   2. כריך הממברנה בין זוג סרטי שקיפות.
   3. רכוש את התמונה במצב פלואורסצנטי.
      הערה: יש לבצע את שלבים 7.1 ו- 7.2 בסמיכות למכונת ההדמיה כדי להבטיח רגישות מרבית.
   4. כאשר אות הרקע גבוה, בצע שלב כביסה במיכל עם 80-100 מ"ל של PBS-T: 10 דקות לשטוף 3 פעמים עבור הנוגדן העיקרי 5 דקות לשטוף 6 פעמים עבור הנוגדן המשני.
      הערה: הן נוגדנים ראשוניים והן משניים מדוללים עם 10% פתרונות IRE ניתן להשתמש עד 8-10 פעמים ללא אובדן רגישות⁶. הפתרון צריך להישמר ב 4 מעלות צלזיוס עד 1 חודש.

תוצאות

דוגמה זו ממחישה את האפקטיביות של שיטת CDR יחד עם טכנולוגיית אימונוהאנסינג על כתם מערבי. הדגירה הסטטית בוצעה על סרט גמיש שקוף למחצה שבו קרום PVDF דגירה עם פתרון הנוגדנים, ואילו דגירה CDR היה בתנור הכלאה על ידי סיבוב צינורות שהכילו את הממברנות ואת פתרון הנוגדנים (סרט). איור 2 הראה כ...

Discussion

כתם מערבי הוא טכניקה אנליטית בשימוש נרחב כדי לזהות חלבונים ספציפיים שפותחו ~ לפני 40 שנה^7,8. מאז, הטכניקה המשיכה להתפתח, עם חידושים הבאים לשפר את הרגישות, המהירות, ואת הכמות של הטכניקה^2,9,10,11

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, Graduated, with Snap Cap	Falcon	352059
Apollo Transparency Film for Laser Printers	N/A	N/A	Any kinds of Laser Printer Transparency Film are fine.
Azure Imaging System 600	Azure Biosystems	Azure 600	Any kind of Image Acquiring Sytem is fine for chemiluminescent and/or fluorescent detection.
Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution	TOYOBO	NKB-101
CARNATION Instant Nonfat Dry Milk	Carnation	N/A
ECL anti-mouse IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from sheep	GE Healthcare	NA9310V
ECL anti-rabbit IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from donkey	GE Healthcare	NA9340V
HYBAID Micro-4	N/A	N/A	Any hybridization oven is fine as long as the tubes are rotated evenly at a horizontal position.
Immobilon-P PVDF Membrane, 0.45 µm pore size	Millipore Sigma	IPVH304F0
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody	LICOR	926-68070
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody	LICOR	926-32211
KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate	seracare	5430-0049
Mouse anti-ß actin antibody	Millipore Sigma	A5316
Odyssey Blocking Buffer (PBS)	LICOR	927-40100	Blocking Buffer for fluorescent detection
OXO Salad Spinner	OXO	32480V2B	Any salad spinner is fine as long as the PVDF membranes are rinsed vigorously without tear.
Parafilm Sealing Film	Bemis	Parafilm M PM996	semi-transparent flexible film
Polyethylene Flat-Top Screw Caps for 50 mL Conical Bottom Centrifuge Tubes	Falcon	352070
Rings to hold 14 ml tube in the center of 50 ml tube	N/A	N/A	Prepared in a machine shop
Rabbit anti-6X His tag antibody	Abcam	ab9108
Tween20	Millipore Sigma	P2287