使用免疫增强技术的超高速西布洛特

摘要

通过循环排泄和补充 （CDR） 技术与免疫增异剂一起改进抗原抗体结合的动能，开发出一种超高速西方印迹技术。

摘要

西方的污点（也称为免疫虫）是生物医学研究的规范方法。它通常用于确定特定蛋白质的相对大小和丰度以及转化后蛋白质的修饰。这种技术具有丰富的历史，由于其简单性，仍然被广泛使用。然而，西方的印迹程序著名的需要几个小时，甚至几天，完成，一个关键的瓶颈是长期的潜伏时间，限制其吞吐量。由于抗体从散装溶液缓慢扩散到膜上的固定抗原，因此需要这些培养步骤:膜附近的抗体浓度远远低于散装浓度。在这里，我们提出了一项创新，通过循环排空和补充抗体溶液 （CDR） 来改善抗原结合，从而显著缩短这些潜伏间隔。我们还利用了增强免疫力的技术来保持检测的灵敏度。CDR方法与商业免疫增强剂相结合，提高了输出信号，大大缩短了抗体潜伏时间。由此产生的超高速西部污点可以在20分钟内完成，而不会失去任何灵敏度。该方法可同时使用化学发光和荧光检测方法应用于西方污点。这种简单的协议使研究人员能够更好地探索许多样本中蛋白质表达的分析。

引言

西方的污点（也称为免疫虫）是一种强大而基本的技术，跨越广泛的科学和临床学科。该技术用于检查蛋白质¹的存在、相对丰度、相对分子质量和转化后修饰。结合数字图像分析，该方法可以可靠地分析蛋白质的丰度和蛋白质的修饰^2。虽然西方的污点是例行公事，但它是一种耗时和劳动密集型的方法。需要用膜长期培养抗体。在这里，我们描述了对孵化方法的修改，该方法克服了这一限制，而不会牺牲灵敏度。

在膜的孵化过程中，抗体漂浮在溶液中，而抗原则固定在膜上。由于其亲和力高，抗体与抗原结合的速度比抗体从散装溶液扩散到膜的速度要快。这会产生低浓度的"消耗层"（图 1）。较远的抗体可能需要数小时才能通过被动扩散到达膜，而被动扩散是导致该技术长期潜伏的主要因素。此效果称为大众运输限制 （MTL）^3。有人提出，重复排空和补充含抗体溶液可能会破坏耗竭层，克服MTL^4。在这里，我们设计了一种独特的技术，实现这种循环排水和补充 （CDR） 概念，以减少 MTL 在传统的西方印迹协议中的影响，并显著缩短所需的潜伏期。

为了在短的潜伏时间内保持检测灵敏度，我们采用了提高免疫力增强技术，加速抗原抗体反应，从而提高了信号噪声比^5。许多市售的免疫增强剂 （IRE） 由 2 个组件组成（解决方案 1 和 2，见 材料表）。IRE的专有成分或作用机制尚未披露，但我们先前发现，IRE在固体相绑定检测中减少了抗原和抗体之间的分离常数，表明亲和力的增强至少部分地对IRE⁶的增强作用负有责任。CDR 与 IRE 的结合产生了一种超高速的西方印迹处理方案，可在不牺牲灵敏度的情况下缩短整个过程时间。

研究方案

1. SDS-PAGE 并传输到 PVDF 膜

1. 执行 SDS-PAGE，根据相对大小分离蛋白质。
   注意:任何商业或自制凝胶系统都没问题。请遵守制造商的协议。
2. 将分离的蛋白质从凝胶转移到PVDF膜上。
   注意:常见的转移方法（半干或湿转移）是合适的。请遵守制造商的协议。

2. 阻塞PVDF膜

1. 在室温下搅拌时，将膜浸泡在适当的阻塞缓冲区中1小时。
   注:根据主要抗体和检测系统，应选择适当的阻塞缓冲区。例如，最典型的阻滞剂是 BSA、脱脂干牛奶、箱蛋白和商用合成聚合物。PBS 和/或 TBS 与 0.1% Tween20 是最常用的缓冲区。此阻塞步骤可在 4 °C 下过夜完成。

3. 原发性抗体孵化

1. 用蒸馏水准备10%的免疫反应增强剂-1溶液（IRE-1）。漩涡很好。
2. 用 10% IRE-1 准备稀释的原发抗体。轻轻地和彻底地混合。
3. 如果使用较大的膜（4 厘米 x 8 厘米 - 8 厘米 x 8 厘米），将 8 mL 的抗体溶液添加到 50 mL 圆锥形离心管中。如果使用较小的膜（2 厘米 x 8 厘米 - 4 厘米 x 8 厘米），将 3 mL 的抗体溶液添加到 14 mL 圆底聚丙烯管（材料表）中。
4. 用钳子拾取PVDF膜，并短暂地排出阻塞溶液。用戴手套的手指将PVDF膜插入此管中，并确保整个膜粘附在管壁上。当PVDF膜插入管子时，面对最初与凝胶内侧接触的膜的"蛋白质侧"。紧紧地关上帽子。
5. 将 50 mL 管插入混合烤箱的玻璃瓶中。
   注:当 14 mL 管用于此孵化时，将 14 mL 管插入 50 mL 管中，使用一对塑料环架将内管保持在 50 mL 管的中心。
6. 打开混合烤箱。
7. 用 6 rpm 旋转孵化膜至少 5 分钟。
   注意:确保膜始终粘附在墙壁上，并且（内部）管水平覆盖膜，均匀地覆盖抗体溶液。在实际实验之前校准抗体的稀释和潜伏时间。

4. 膜洗涤

1. 停止旋转。
2. 小心地用钳子从管子中取出PVDF膜，并将膜放入一个装有50 mL PBS-T的容器中。
3. 用 PBS-T 短暂地冲洗膜。
4. 用蒸馏水冲洗容器中的膜，直到没有气泡出现。这是为了去除大部分抗体。
5. 将PVDF膜从容器转移到含有250 mL PBS-T的沙拉微调器。
6. 将过滤器篮放入微调器中。确保盖子安全放置。
7. 激活微调器并运行大约 20-30 s。
8. 丢弃溶液，用蒸馏水短暂冲洗微调器内部。
9. 再次将 250 mL 的 PBS-T 添加到微调器中。
10. 重复步骤 4.6 和 4.7。

5. 与二次抗体一起孵育

1. 用蒸馏水准备10%的免疫反应增强剂-2溶液（IRE-2）。漩涡很好。
2. 用 10% IRE-2 准备稀释的次要抗体。轻轻地和彻底地混合。
3. 选择第 3.3 步中注述的抗体溶液和管的体积。
4. 用钳子拾取PVDF膜，并短暂地排干溶液。将 PVDF 膜插入第 3.4 步所述的管子中。
5. 将 50 mL 管插入混合烤箱的玻璃瓶中。
6. 打开混合烤箱。
7. 用 6 rpm 旋转孵化膜至少 5 分钟。确保膜始终粘附在墙壁上，并且（内部）管水平，以便用抗体溶液均匀地覆盖膜。
   注:在实际实验之前校准孵化时间。当次要抗体被荧光结合时，在黑暗中进行孵化。

6. 膜洗涤

1. 按照步骤 4.1 到 4.10。

7. 图像采集

1. 化学发光检测
   1. 将一块半移植柔性薄膜（10厘米×15厘米）放在平坦的表面上。
   2. 在 5 mL 管中混合化疗基板的 2 个组件。
   3. 立即将混合基板的1.5 mL转移到半移植柔性薄膜上，并将PVDF膜放在它身上。然后，将基板溶液的其余部分转移到膜上。
   4. 在半透明柔性薄膜上用混合基板孵化PVDF膜1分钟。
   5. 用钳子拾取PVDF膜，并短暂地排出基板溶液。
   6. 将膜夹在一对透明胶片之间。
   7. 在化学发光模式下获取图像。
2. 荧光检测
   1. 用钳子拾取PVDF膜，并短暂地排干溶液。
   2. 将膜夹在一对透明胶片之间。
   3. 在荧光模式下获取图像。
      注:步骤 7.1 和 7.2 应在成像机附近执行，以确保最大灵敏度。
   4. 当背景信号高时，在装有 80-100 mL PBS-T 的容器中执行洗涤步骤:10 分钟冲洗 3 次用于原发抗体，5 分钟冲洗 6 次用于次要抗体。
      注:用10%IRE溶液稀释的原辅抗体可使用8-10次，而不会失去灵敏度^6。解决方案应保持在4°C长达1个月。

结果

这个例子说明了CDR方法以及免疫增强技术对西方污点的有效性。静态孵化是在半透明的柔性薄膜上进行的，其中PVDF膜与抗体溶液一起孵育，而CDR孵化则通过含有膜和抗体溶液（电影）的旋转管在混合烤箱中。 图2 显示的抗原和抗体数量分别为西斑化学发光检测所必需的。在静态和 CDR 孵化中，使用 IRE 溶液提高了灵敏度:IRE 将检测 é actin 所需的最低细胞溶解物 （抗原） 数量...

讨论

西方污点是一种广泛使用的分析技术，用于检测40年前^7、8年前开发的特定蛋白质。此后，该技术不断发展，随后的创新提高了技术^{2、9、10、11、12、13}的灵敏度^、速度和定量。此处介绍的增强型超高速西?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, Graduated, with Snap Cap	Falcon	352059
Apollo Transparency Film for Laser Printers	N/A	N/A	Any kinds of Laser Printer Transparency Film are fine.
Azure Imaging System 600	Azure Biosystems	Azure 600	Any kind of Image Acquiring Sytem is fine for chemiluminescent and/or fluorescent detection.
Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution	TOYOBO	NKB-101
CARNATION Instant Nonfat Dry Milk	Carnation	N/A
ECL anti-mouse IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from sheep	GE Healthcare	NA9310V
ECL anti-rabbit IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from donkey	GE Healthcare	NA9340V
HYBAID Micro-4	N/A	N/A	Any hybridization oven is fine as long as the tubes are rotated evenly at a horizontal position.
Immobilon-P PVDF Membrane, 0.45 µm pore size	Millipore Sigma	IPVH304F0
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody	LICOR	926-68070
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody	LICOR	926-32211
KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate	seracare	5430-0049
Mouse anti-ß actin antibody	Millipore Sigma	A5316
Odyssey Blocking Buffer (PBS)	LICOR	927-40100	Blocking Buffer for fluorescent detection
OXO Salad Spinner	OXO	32480V2B	Any salad spinner is fine as long as the PVDF membranes are rinsed vigorously without tear.
Parafilm Sealing Film	Bemis	Parafilm M PM996	semi-transparent flexible film
Polyethylene Flat-Top Screw Caps for 50 mL Conical Bottom Centrifuge Tubes	Falcon	352070
Rings to hold 14 ml tube in the center of 50 ml tube	N/A	N/A	Prepared in a machine shop
Rabbit anti-6X His tag antibody	Abcam	ab9108
Tween20	Millipore Sigma	P2287