Blot ocidental de alta velocidade usando tecnologia de aprimoramento de imunoreaction

Resumo

Uma técnica de mancha ocidental de ultra-alta velocidade é desenvolvida melhorando a cinética da ligação antígeno-anticorpo através da tecnologia de drenagem e reposição cíclica (CDR) em conjunto com um agente de aumento de imunoreaction.

Resumo

Uma mancha ocidental (também conhecida como imunoblot) é um método canônico para pesquisa biomédica. É comumente usado para determinar o tamanho relativo e abundância de proteínas específicas, bem como modificações de proteína pós-translacional. Esta técnica tem uma rica história e permanece em uso generalizado devido à sua simplicidade. No entanto, o procedimento de mancha ocidental leva horas, até dias, para ser concluído, com um gargalo crítico sendo os longos tempos de incubação que limitam seu rendimento. Estas etapas de incubação são necessárias devido à lenta difusão de anticorpos da solução a granel para os antígenos imobilizados na membrana: a concentração de anticorpos perto da membrana é muito menor do que a concentração a granel. Aqui, apresentamos uma inovação que reduz drasticamente esses intervalos de incubação, melhorando a ligação de antígeno através da drenagem cíclica e reposição (CDR) da solução de anticorpos. Também utilizamos uma tecnologia de aprimoramento da imunoreação para preservar a sensibilidade do ensaio. Uma combinação do método CDR com um agente de aumento de imunoreaction comercial aumentou o sinal de saída e reduziu substancialmente o tempo de incubação de anticorpos. A mancha ocidental de ultra-alta velocidade resultante pode ser realizada em 20 minutos sem qualquer perda de sensibilidade. Este método pode ser aplicado a manchas ocidentais usando a detecção de chemiluminescente e fluorescente. Este protocolo simples permite que os pesquisadores explorem melhor a análise da expressão proteica em muitas amostras.

Introdução

Uma mancha ocidental (também conhecida como imunoblot) é uma técnica poderosa e fundamental em uma ampla gama de disciplinas científicas e clínicas. Esta técnica é usada para examinar a presença, abundância relativa, massa molecular relativa e modificações pós-translacionais de proteínas¹. Combinado com a análise digital de imagens, este método pode analisar de forma confiável a abundância de proteínas e modificações proteicas². Embora a mancha ocidental seja realizada rotineiramente, é um método demorado e intensivo em mão-de-obra. São necessárias longas incubações do anticorpo com membranas. Aqui, descrevemos uma modificação do método de incubação que supera essa limitação sem sacrificar a sensibilidade.

Durante a incubação da membrana, os anticorpos flutuam em solução enquanto os antígenos são imobilizados na membrana. Devido à sua alta afinidade, a taxa de ligação de anticorpos ao antígeno é mais rápida do que a difusão de anticorpos da solução a granel para a membrana. Isso cria uma baixa concentração "camada de esgotamento"(Figura 1). Pode levar horas para anticorpos mais distantes chegarem à membrana por meio da difusão passiva, que é o principal fator responsável por longos tempos de incubação nesta técnica. Esse efeito é chamado de limitação de transporte de massa (MTL)³. Foi proposto que a drenagem repetitiva e a reposição da solução contendo anticorpos podem interromper a camada de esgotamento e superar o MTL⁴. Aqui, elaboramos uma técnica única que implementa este conceito de drenagem e reposição cíclica (CDR) para diminuir o efeito do MTL em um protocolo tradicional de manchas ocidentais e comentou encurtar o período de incubação necessário.

Para manter a sensibilidade de detecção com um curto tempo de incubação, fizemos uso de uma tecnologia de aprimoramento da imunoreaction que acelera a reação de anticorpos de antígeno, melhorando assim a relação sinal-ruído⁵. Muitos agentes de imunoreação disponíveis comercialmente (IRE) consistem em 2 componentes (Solução 1 e 2, ver Tabela de Materiais). A composição proprietária ou mecanismo de ação do IRE não foi divulgada, mas descobrimos anteriormente que o IRE diminuiu a constante de dissociação entre o antígeno e o anticorpo em ensaios de ligação de fase sólida, indicando que o aumento da afinidade é, pelo menos em parte, responsável pelo efeito de aumento do IRE⁶. A combinação de CDR com IRE produz um protocolo de manchas ocidentais de ultra-alta velocidade que reduz todo o tempo de procedimento sem sacrificar a sensibilidade.

Protocolo

1. SDS-PAGE e transferência para uma membrana PVDF

1. Execute o SDS-PAGE para separar proteínas com base no tamanho relativo.
   NOTA: Qualquer sistema de gel comercial ou caseiro está bem. Por favor, siga o protocolo do fabricante.
2. Transfira proteínas separadas de um gel para uma membrana PVDF.
   NOTA: Os métodos comuns de transferência (transferência semi-seca ou úmida) são adequados. Por favor, siga o protocolo do fabricante.

2. Bloqueio de membranas PVDF

1. Incubar as membranas em tampões de bloqueio apropriados por 1h com agitação à temperatura ambiente.
   NOTA: Dependendo do sistema de anticorpos e detecção primário, um buffer de bloqueio apropriado deve ser selecionado. Por exemplo, os bloqueadores mais típicos são BSA, leite seco sem gordura, caseína e polímeros sintéticos comerciais. PBS e/ou TBS com 0,1% Tween20 são os buffers mais utilizados. Esta etapa de bloqueio pode ser feita durante a noite a 4 °C.

3. Incubação com anticorpo primário

1. Prepare 10% de imunoreaction melhorando a solução agent-1 (IRE-1) com água destilada. Vórtice bem.
2. Prepare o anticorpo primário diluído com 10% de IRE-1. Misture-o suavemente e bem.
3. Se usar uma membrana maior (4 cm x 8 cm – 8 cm x 8 cm), adicione 8 mL da solução de anticorpos em tubos de centrífuga cônica de 50 mL. Se utilizar uma membrana menor (2 cm x 8 cm – 4 cm x 8 cm), adicione 3 mL da solução de anticorpos em tubo de polipropileno de fundo redondo de 14 mL(Tabela de Materiais).
4. Pegue a membrana PVDF com pinças e drene brevemente a solução de bloqueio. Insira a membrana PVDF neste tubo com os dedos enluvados e certifique-se de que toda a membrana adere à parede do tubo. Quando a membrana PVDF é inserida em um tubo, encare o "lado proteico" da membrana que estava originalmente em contato com o gel para dentro. Feche a tampa com força.
5. Insira o tubo de 50 mL em uma garrafa de vidro para o forno de hibridização.
   NOTA: Quando forem utilizados tubos de 14 mL para esta incubação, insira um tubo de 14 mL no tubo de 50 mL, utilizando um par de suportes de anel plástico para manter o tubo interno no centro do tubo de 50 mL.
6. Ligue o forno de hibridização.
7. Incubar a membrana com rotação de 6 rpm por pelo menos 5 min.
   NOTA: Certifique-se de que a membrana adere à parede o tempo todo e que o tubo (interno) esteja horizontal para cobrir a membrana uniformemente com a solução de anticorpos. Calibrar a diluição do anticorpo e o tempo de incubação antes do experimento real.

4. Lavagem de membrana

1. Pare a rotação.
2. Remova cuidadosamente a membrana PVDF do tubo com pinças e coloque a membrana em um recipiente com 50 mL de PBS-T.
3. Enxágüe a membrana brevemente com PBS-T.
4. Enxágüe a membrana no recipiente com água destilada até que não apareçam bolhas. Isto é para remover a maioria do anticorpo.
5. Transfira a membrana PVDF do recipiente para o rotador de salada que contém 250 mL de PBS-T.
6. Coloque a cesta de coador no rotador. Certifique-se de que a tampa foi colocada com segurança.
7. Ative o rotador e execute-o por cerca de 20-30 s.
8. Descarte a solução e enxágue brevemente o interior do rotador com água destilada.
9. Adicione 250 mL de PBS-T no spinner novamente.
10. Repita as etapas 4.6 e 4.7.

5. Incubação com o anticorpo secundário

1. Prepare 10% de imunoreaction melhorando a solução agent-2 (IRE-2) com água destilada. Vórtice bem.
2. Prepare o anticorpo secundário diluído com 10% de IRE-2. Misture-o suavemente e bem.
3. Selecione o volume da solução de anticorpos e do tubo conforme indicado na etapa 3.3.
4. Pegue a membrana PVDF com pinças e drene a solução brevemente. Insira a membrana PVDF no tubo conforme indicado na etapa 3.4.
5. Insira o tubo de 50 mL em uma garrafa de vidro para o forno de hibridização.
6. Ligue o forno de hibridização.
7. Incubar a membrana com rotação de 6 rpm por pelo menos 5 min. Certifique-se de que a membrana adere à parede o tempo todo e que o tubo (interno) esteja horizontal para cobrir uniformemente a membrana com a solução de anticorpos.
   NOTA: Calibrar o tempo de incubação antes do experimento real. Quando o anticorpo secundário for fluorescentemente conjugado, realize a incubação no escuro.

6. Lavagem de membrana

1. Siga os passos 4.1 às 4:10.

7. Aquisição de imagens

1. Detecção de chemiluminescente
   1. Coloque um pedaço de filme flexível semi-transplante (10 cm x 15 cm) em uma superfície plana.
   2. Misture 2 componentes do substrato chemiluminescente em um tubo de 5 mL.
   3. Transfira imediatamente 1,5 mL do substrato misto para a filmagem flexível semi-transplante e coloque a membrana PVDF sobre ele. Em seguida, transfira o resto da solução do substrato para a membrana.
   4. Incubar a membrana PVDF com o substrato misto em uma película flexível semi-transparente por 1 min.
   5. Pegue a membrana PVDF com pinças e escorra brevemente a solução do substrato.
   6. Sanduíche a membrana entre um par de filmes de transparência.
   7. Adquira a imagem sob o modo chemiluminescent.
2. Detecção fluorescente
   1. Pegue a membrana PVDF com pinças e drene a solução brevemente.
   2. Sanduíche a membrana entre um par de filmes de transparência.
   3. Adquira a imagem sob o modo fluorescente.
      NOTA: As etapas 7.1 e 7.2 devem ser realizadas nas proximidades da máquina de imagem para garantir a máxima sensibilidade.
   4. Quando o sinal de fundo estiver alto, realize um passo de lavagem em um recipiente com 80-100 mL de PBS-T: 10 min enxágue 3 vezes para o anticorpo primário e 5 min enxágue 6 vezes para o anticorpo secundário.
      NOTA: Tanto os anticorpos primários quanto secundários diluídos com soluções IRE de 10% podem ser usados até 8-10 vezes sem perda de sensibilidade⁶. A solução deve ser mantida em 4 °C por até 1 mês.

Resultados

Este exemplo ilustra a eficácia do método CDR juntamente com a tecnologia de imunoenhancing na mancha ocidental. A incubação estática foi realizada em uma película flexível semi-transparente onde as membranas PVDF foram incubadas com a solução de anticorpos, enquanto a incubação da CDR estava em um forno de hibridização por tubos rotativos que continham as membranas e a solução de anticorpos (Movie). A Figura 2 mostrou quantidades de antígeno e anticorpo, respectivamente, nec...

Discussão

A mancha ocidental é uma técnica analítica amplamente utilizada para detectar proteínas específicas que foram desenvolvidas ~40 anos atrás^7,8. Desde então, a técnica continuou a evoluir, com inovações subsequentes melhorando a sensibilidade, velocidade e quantitação da técnica^2,9,10,11,12<...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, Graduated, with Snap Cap	Falcon	352059
Apollo Transparency Film for Laser Printers	N/A	N/A	Any kinds of Laser Printer Transparency Film are fine.
Azure Imaging System 600	Azure Biosystems	Azure 600	Any kind of Image Acquiring Sytem is fine for chemiluminescent and/or fluorescent detection.
Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution	TOYOBO	NKB-101
CARNATION Instant Nonfat Dry Milk	Carnation	N/A
ECL anti-mouse IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from sheep	GE Healthcare	NA9310V
ECL anti-rabbit IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from donkey	GE Healthcare	NA9340V
HYBAID Micro-4	N/A	N/A	Any hybridization oven is fine as long as the tubes are rotated evenly at a horizontal position.
Immobilon-P PVDF Membrane, 0.45 µm pore size	Millipore Sigma	IPVH304F0
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody	LICOR	926-68070
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody	LICOR	926-32211
KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate	seracare	5430-0049
Mouse anti-ß actin antibody	Millipore Sigma	A5316
Odyssey Blocking Buffer (PBS)	LICOR	927-40100	Blocking Buffer for fluorescent detection
OXO Salad Spinner	OXO	32480V2B	Any salad spinner is fine as long as the PVDF membranes are rinsed vigorously without tear.
Parafilm Sealing Film	Bemis	Parafilm M PM996	semi-transparent flexible film
Polyethylene Flat-Top Screw Caps for 50 mL Conical Bottom Centrifuge Tubes	Falcon	352070
Rings to hold 14 ml tube in the center of 50 ml tube	N/A	N/A	Prepared in a machine shop
Rabbit anti-6X His tag antibody	Abcam	ab9108
Tween20	Millipore Sigma	P2287