İmmünreaksiyon Arttırıcı Teknoloji Kullanan Ultra Yüksek Hızlı Batı Blot

Özet

Ultra yüksek hızlı batı şişkinlik tekniği, bir immünoreaksiyon arttırıcı madde ile birlikte döngüsel drenaj ve ikmal (CDR) teknolojisi ile antijen-antikor bağlama kinetiğinin iyileştirilmesi ile geliştirilmiştir.

Özet

Batı lekesi (immünoblot olarak da bilinir) biyomedikal araştırmalar için kurallı bir yöntemdir. Genellikle belirli proteinlerin bağıl boyutunu ve bolluğunu ve çeviri sonrası protein modifikasyonlarını belirlemek için kullanılır. Bu teknik zengin bir geçmişe sahiptir ve sadeliği nedeniyle yaygın kullanımda kalır. Bununla birlikte, batı şişkinlik prosedürünün tamamlanması saatler, hatta günler alır ve kritik bir darboğaz, verimini sınırlayan uzun kuluçka süreleridir. Bu inkübasyon adımları, antikorların toplu çözeltiden membran üzerindeki hareketsiz antijenlere kadar yavaşça yayılması nedeniyle gereklidir: zarın yakınındaki antikor konsantrasyonu, toplu konsantrasyondan çok daha düşüktür. Burada, antikor çözeltisinin döngüsel drenajı ve yenilenmesi (CDR) yoluyla antijen bağlanmasını iyileştirerek bu kuluçka aralıklarını önemli ölçüde azaltan bir yenilik sunuyoruz. Ayrıca tahlil hassasiyetini korumak için bir immünoreaksiyon arttırıcı teknoloji kullandık. CDR yönteminin ticari bir immünoreaksiyon arttırıcı madde ile kombinasyonu çıkış sinyalini artırdı ve antikor inkübasyon süresini önemli ölçüde azalttı. Elde edilen ultra yüksek hızlı batı lekesi, hassasiyet kaybı olmadan 20 dakikada gerçekleştirilebilir. Bu yöntem hem chemiluminescent hem de floresan tespiti kullanılarak batı lekelerine uygulanabilir. Bu basit protokol, araştırmacıların birçok örnekte protein ekspresyonunun analizini daha iyi keşfetmelerini sağlar.

Giriş

Batı lekesi (immünoblot olarak da bilinir), çok çeşitli bilimsel ve klinik disiplinlerde güçlü ve temel bir tekniktir. Bu teknik, proteinlerin varlığını, bağıl bolluğunu, bağıl moleküler kütlesini ve çeviri sonrası modifikasyonlarını incelemek için kullanılır¹. Dijital görüntü analizi ile birlikte, bu yöntem proteinlerin bolluğunu ve protein modifikasyonlarını güvenilir bir şekilde analiz edebilir². Batı lekesi rutin olarak yapılsa da zaman alan ve emek yoğun bir yöntemdir. Antikorun membranlarla uzun inkübasyonları gereklidir. Burada, duyarlılıktan ödün vermeden bu sınırlamanın üstesinden gelen kuluçka yönteminin bir değişikliğini açıklıyoruz.

Membran inkübasyonu sırasında, antikorlar çözelti içinde yüzerken, antijenler membran üzerinde hareketsiz hale getirilir. Yüksek benzeşimleri nedeniyle, antijene antikor bağlanma hızı, antikorların dökme çözeltiden zara yayılmasından daha hızlıdır. Bu, düşük konsantrasyonda bir "tükenme katmanı" oluşturur (Şekil 1). Bu teknikte uzun kuluçka sürelerinin ana faktörü olan pasif difüzyon yoluyla daha uzak antikorların zara ulaşması saatler alabilir. Bu etkiye toplu taşıma sınırlaması (MTL)³denir. Antikor içeren çözeltinin tekrar tekrar boşaltılması ve yenilenmesinin tükenme tabakasını bozabileceği ve MTL^4'ünüstesinden gelebileceği önerilmiştir. Burada, geleneksel bir batı blotting protokolünde MTL'nin etkisini azaltmak ve gerekli kuluçka süresini kısaltmak için bu döngüsel drenaj ve ikmal (CDR) kavramını uygulayan benzersiz bir teknik tasarladık.

Algılama hassasiyetini kısa bir kuluçka süresiyle korumak için, antijen-antikor reaksiyonunu hızlandıran ve böylece sinyal-gürültü oranını artıran bir immünoreaksiyon arttırıcı teknoloji kullandık⁵. Piyasada bulunan birçok immünoreaksiyon arttırıcı madde (IRE) 2 bileşenden oluşur (Çözüm 1 ve 2, bkz. Malzeme Tablosu). IRE'nin tescilli bileşimi veya etki mekanizması açıklanmadı, ancak daha önce IRE'nin katı faz bağlama testlerinde antijen ve antikor arasındaki ayrışma sabitini azalttığını bulduk, bu da artan benzeşimin en azından kısmen IRE^6'nınarttırıcı etkisinden sorumlu olduğunu gösteriyor. CDR'nin IRE ile kombinasyonu, hassasiyettan ödün vermeden tüm prosedür süresini azaltan ultra yüksek hızlı bir batı blotting protokolü verir.

Protokol

1. SDS-PAGE ve bir PVDF membran aktarın

1. Proteinleri göreli boyuta göre ayırmak için SDS-PAGE gerçekleştirin.
   NOT: Herhangi bir ticari veya ev yapımı jel sistemi iyidir. Lütfen üreticinin protokolüne uyun.
2. Ayrılmış proteinleri bir jelden PVDF zarına aktarın.
   NOT: Yaygın transfer yöntemleri (yarı kuru veya ıslak transfer) uygundur. Lütfen üreticinin protokolüne uyun.

2. PVDF membranlarının engellenmesi

1. Membranları oda sıcaklığında ajitasyon ile 1 saat boyunca uygun engelleme tamponlarında kuluçkaya yatırın.
   NOT: Birincil antikor ve algılama sistemine bağlı olarak uygun bir blokaj tamponu seçilmelidir. Örneğin, en tipik blokerler BSA, yağsız kuru süt, kazein ve ticari sentetik polimerlerdir. %0,1 Ara20 ile PBS ve/veya TBS en sık kullanılan arabelleklerdir. Bu engelleme adımı 4 °C'de bir gecede yapılabilir.

3. Primer antikor ile inkübasyon

1. Damıtılmış su ile %10 immünoreaksiyon arttırıcı ajan-1 çözeltisi (IRE-1) hazırlayın. Girdap iyi.
2. Seyreltilmiş primer antikoru% 10 IRE-1 ile hazırlayın. Hafifçe ve iyice karıştırın.
3. Daha büyük bir membran (4 cm x 8 cm – 8 cm x 8 cm) kullanıyorsanız, 50 mL konik santrifüj tüplerine 8 mL antikor çözeltisi ekleyin. Daha küçük bir membran (2 cm x 8 cm – 4 cm x 8 cm) kullanıyorsanız, 14 mL yuvarlak tabanlı polipropilen tüpe(Malzeme Tablası)3 mL antikor çözeltisi ekleyin.
4. PVDF membranını cımbızla alın ve engelleme solüsyonunu kısa bir süre boşaltın. PVDF zarını eldivenli parmaklarla bu tüpe yerleştirin ve tüm zarın tüpün duvarına yapıştığından emin olun. PVDF membran bir tüpe yerleştirildiğinde, başlangıçta jel ile içe doğru temas eden zarın "protein tarafı" ile yüzleşin. Kapağı sıkıca kapatın.
5. 50 mL'lik tüpü hibridizasyon fırını için bir cam şişeye yerleştirin.
   NOT: Bu inkübasyon için 14 mL tüp kullanıldığında, iç tüpü 50 mL tüpün ortasında tutmak için bir çift plastik halka tutucu kullanarak 50 mL'lik tüpe 14 mL'lik bir tüp yerleştirin.
6. Hibridizasyon fırınını açın.
7. Membranı en az 5 dakika boyunca 6 rpm dönüşle kuluçkaya yatırın.
   NOT: Membranın her zaman duvara yapıştığından ve (iç) tüpün membranı antikor çözeltisi ile eşit şekilde kaplayacak şekilde yatay olduğundan emin olun. Gerçek deneyden önce antikorun seyreltilmesini ve kuluçka süresini kalibre edin.

4. Membran yıkama

1. Dönüşü durdurun.
2. PVDF membranını cımbızla tüpten dikkatlice çıkarın ve membranı 50 mL PBS-T içeren bir kaba yerleştirin.
3. Membranı PBS-T ile kısa bir süre durulayın.
4. Zarı kabarmış su ile kabarcık görününe kadar durulayın. Bu antikorun çoğunluğunu çıkarmaktır.
5. PVDF membranını kaptan 250 mL PBS-T içeren salata spinner'a aktarın.
6. Süzgeç sepetini spinner'a yerleştirin. Kapağın güvenli bir şekilde takıldığından emin olun.
7. Spinner'ı etkinleştirin ve yaklaşık 20-30 s boyunca çalıştırın.
8. Çözeltiyi atın ve spinner'ın içini damıtılmış suyla kısa bir süre durulayın.
9. Spinner'a tekrar 250 mL PBS-T ekleyin.
10. 4.6 ve 4.7 adımlarını yineleyin.

5. İkincil antikor ile inkübasyon

1. Damıtılmış su ile %10 immünoreaksiyon arttırıcı ajan-2 çözeltisi (IRE-2) hazırlayın. Girdap iyi.
2. Seyreltilmiş ikincil antikorun %10 IRE-2 ile hazırlanması. Hafifçe ve iyice karıştırın.
3. Adım 3.3'te belirtildiği gibi antikor çözeltisinin ve tüpün hacmini seçin.
4. PVDF zarını cımbızla alın ve çözeltiyi kısaca boşaltın. 3.4. adımda belirtildiği gibi PVDF membranını tüpe yerleştirin.
5. 50 mL'lik tüpü hibridizasyon fırını için bir cam şişeye yerleştirin.
6. Hibridizasyon fırınını açın.
7. Membranı en az 5 dakika boyunca 6 rpm dönüşle kuluçkaya yatırın. Zarın her zaman duvara yapıştığından ve (iç) tüpün membranı antikor çözeltisi ile eşit şekilde kaplayacak şekilde yatay olduğundan emin olun.
   NOT: Gerçek denemeden önceki kuluçka süresini kalibre edin. İkincil antikor floresan konjuge edildiğinde, inkübasyonu karanlıkta gerçekleştirin.

6. Membran yıkama

1. 4.1 ile 4.10 arasında olan adımları izleyin.

7. Görüntü alımı

1. Chemiluminescent algılama
   1. Düz bir yüzeye bir parça yarı nakil esnek film (10 cm x 15 cm) yerleştirin.
   2. Chemiluminescent substratının 2 bileşenini 5 mL'lik bir tüpte karıştırın.
   3. Karışık substratın 1,5 mL'sini hemen yarı nakil esnek filme aktarın ve üzerine PVDF zarını yerleştirin. Daha sonra, substrat çözeltisinin geri kalanını zara aktarın.
   4. PVDF membranı, yarı saydam esnek bir film üzerindeki karışık substrat ile 1 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
   5. PVDF membranını cımbızla alın ve substrat çözeltisini kısa bir süre boşaltın.
   6. Membranı bir çift şeffaflık filmi arasına sıkıştırın.
   7. Görüntüyü chemiluminescent modu altında alın.
2. Floresan algılama
   1. PVDF zarını cımbızla alın ve çözeltiyi kısaca boşaltın.
   2. Membranı bir çift şeffaflık filmi arasına sıkıştırın.
   3. Görüntüyü floresan modunda elde edin.
      NOT: Maksimum hassasiyet sağlamak için 7.1 ve 7.2 adımları görüntüleme makinesine yakın bir yerde yapılmalıdır.
   4. Arka plan sinyali yüksek olduğunda, 80-100 mL PBS-T içeren bir kapta yıkama adımı gerçekleştirin: birincil antikor için 3 kez 10 dakika durulayın ve ikincil antikor için 5 dakika durulayın.
      NOT: %10 IRE çözeltileri ile seyreltilmiş hem birincil hem de ikincil antikorlar hassasiyet kaybı olmadan 8-10 kata kadar kullanılabilir⁶. Çözelti 1 aya kadar 4 °C'de tutulmalıdır.

Sonuçlar

Bu örnek, CDR yönteminin batı blot üzerindeki immünoenhancing teknolojisi ile birlikte etkinliğini göstermektedir. Statik inkübasyon, PVDF membranlarının antikor çözeltisi ile inkübe edildiği yarı saydam esnek bir film üzerinde yapılırken, CDR inkübasyonu membranları ve antikor çözeltisini (Film) içeren tüpleri döndürerek hibridizasyon fırınında yapıldı. Şekil 2'de batı lekelerinde chemiluminescent tespiti için gerekli olan antijen ve antikor miktarları gö...

Tartışmalar

Batı blotu, ~40 yıl önce^7,8. O zamandan beri, teknik gelişmeye devam etti, sonraki yenilikler tekniğin hassasiyetini, hızını ve niceliğini geliştirdi², 9^,10,11,12,13. Burada sunulan gelişmiş ultra yüksek hızlı batı şişkinlik protokolü, mevcut teknik...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, Graduated, with Snap Cap	Falcon	352059
Apollo Transparency Film for Laser Printers	N/A	N/A	Any kinds of Laser Printer Transparency Film are fine.
Azure Imaging System 600	Azure Biosystems	Azure 600	Any kind of Image Acquiring Sytem is fine for chemiluminescent and/or fluorescent detection.
Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution	TOYOBO	NKB-101
CARNATION Instant Nonfat Dry Milk	Carnation	N/A
ECL anti-mouse IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from sheep	GE Healthcare	NA9310V
ECL anti-rabbit IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from donkey	GE Healthcare	NA9340V
HYBAID Micro-4	N/A	N/A	Any hybridization oven is fine as long as the tubes are rotated evenly at a horizontal position.
Immobilon-P PVDF Membrane, 0.45 µm pore size	Millipore Sigma	IPVH304F0
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody	LICOR	926-68070
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody	LICOR	926-32211
KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate	seracare	5430-0049
Mouse anti-ß actin antibody	Millipore Sigma	A5316
Odyssey Blocking Buffer (PBS)	LICOR	927-40100	Blocking Buffer for fluorescent detection
OXO Salad Spinner	OXO	32480V2B	Any salad spinner is fine as long as the PVDF membranes are rinsed vigorously without tear.
Parafilm Sealing Film	Bemis	Parafilm M PM996	semi-transparent flexible film
Polyethylene Flat-Top Screw Caps for 50 mL Conical Bottom Centrifuge Tubes	Falcon	352070
Rings to hold 14 ml tube in the center of 50 ml tube	N/A	N/A	Prepared in a machine shop
Rabbit anti-6X His tag antibody	Abcam	ab9108
Tween20	Millipore Sigma	P2287