Tache occidentale à très grande vitesse utilisant la technologie d’amélioration de l’immunoréaction

Résumé

Une technique de ballonnement occidental à très grande vitesse est développée en améliorant la cinétique de la liaison antigène-anticorps grâce à la technologie cyclique de drainage et de réapprovisionnement (CDR) en conjonction avec un agent améliorant l’immunoréaction.

Résumé

Une tache occidentale (également connue sous le nom d’immunoblot) est une méthode canonique pour la recherche biomédicale. Il est couramment utilisé pour déterminer la taille relative et l’abondance de protéines spécifiques ainsi que les modifications des protéines post-translationnelles. Cette technique a une histoire riche et reste largement utilisée en raison de sa simplicité. Cependant, la procédure occidentale de ballonnement prend des heures, voire des jours, pour terminer, avec un goulot d’étranglement critique étant les longs temps d’incubation qui limitent son débit. Ces étapes d’incubation sont nécessaires en raison de la lente diffusion des anticorps de la solution en vrac aux antigènes immobilisés sur la membrane : la concentration d’anticorps près de la membrane est beaucoup plus faible que la concentration en vrac. Ici, nous présentons une innovation qui réduit considérablement ces intervalles d’incubation en améliorant la liaison antigène par drainage cyclique et réapprovisionnement (CDR) de la solution d’anticorps. Nous avons également utilisé une technologie d’amélioration de l’immunoréaction pour préserver la sensibilité de l’essai. Une combinaison de la méthode CDR avec un agent d’amélioration de l’immunoréaction commerciale a stimulé le signal de sortie et considérablement réduit le temps d’incubation des anticorps. La tache occidentale à très grande vitesse qui en résulte peut être réalisée en 20 minutes sans aucune perte de sensibilité. Cette méthode peut être appliquée aux taches occidentales en utilisant à la fois la détection chemiluminescente et fluorescente. Ce protocole simple permet aux chercheurs de mieux explorer l’analyse de l’expression des protéines dans de nombreux échantillons.

Introduction

Une tache occidentale (également connue sous le nom d’immunoblot) est une technique puissante et fondamentale dans un large éventail de disciplines scientifiques et cliniques. Cette technique est utilisée pour examiner la présence, l’abondance relative, la masse moléculaire relative et les modifications post-translationnelles des protéines¹. Combinée à l’analyse d’images numériques, cette méthode peut analyser de manière fiable l’abondance des protéines et des modifications^{protéiques 2}. Bien que la tache occidentale soit exécutée régulièrement, c’est une méthode longue et laborique. De longues incubations de l’anticorps ....

Protocole

1. SDS-PAGE et transfert vers une membrane PVDF

1. Effectuez SDS-PAGE pour séparer les protéines en fonction de la taille relative.
   REMARQUE : Tout système de gel commercial ou fait maison est très bien. Veuillez suivre le protocole du fabricant.
2. Transférer les protéines séparées d’un gel sur une membrane PVDF.
   REMARQUE : Les méthodes de transfert courantes (transfert semi-sec ou humide) conviennent. Veuillez suivre le protocole du fabricant.

2. Blocage des membranes PVDF

1. Incuber les membranes dans des tampons de blocage appropriés pendant 1 h avec agitation à température ambiante.
   REMARQUE : Selon ....

Résultats

Cet exemple illustre l’efficacité de la méthode CDR ainsi que la technologie d’immunoenhancing sur la tache occidentale. L’incubation statique a été effectuée sur un film flexible semi-transparent où les membranes PVDF ont été incubées avec la solution d’anticorps, tandis que l’incubation du CDR était dans un four d’hybridation par des tubes rotatifs qui contenaient les membranes et la solution d’anticorps (Movie). La figure 2 a montré des quantités d’antigène et.......

Discussion

Tache occidentale est une technique d’analyse largement utilisée pour détecter des protéines spécifiques qui a été développé ~ il ya 40 ans^7,8. Depuis lors, la technique a continué d’évoluer, avec des innovations ultérieures améliorant la sensibilité, la vitesse et la quantitation de la technique^2,9,10,11,

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, Graduated, with Snap Cap	Falcon	352059
Apollo Transparency Film for Laser Printers	N/A	N/A	Any kinds of Laser Printer Transparency Film are fine.
Azure Imaging System 600	Azure Biosystems	Azure 600	Any kind of Image Acquiring Sytem is fine for chemiluminescent and/or fluorescent detection.
Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution	TOYOBO	NKB-101
CARNATION Instant Nonfat Dry Milk	Carnation	N/A
ECL anti-mouse IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from sheep	GE Healthcare	NA9310V
ECL anti-rabbit IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from donkey	GE Healthcare	NA9340V
HYBAID Micro-4	N/A	N/A	Any hybridization oven is fine as long as the tubes are rotated evenly at a horizontal position.
Immobilon-P PVDF Membrane, 0.45 µm pore size	Millipore Sigma	IPVH304F0
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody	LICOR	926-68070
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody	LICOR	926-32211
KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate	seracare	5430-0049
Mouse anti-ß actin antibody	Millipore Sigma	A5316
Odyssey Blocking Buffer (PBS)	LICOR	927-40100	Blocking Buffer for fluorescent detection
OXO Salad Spinner	OXO	32480V2B	Any salad spinner is fine as long as the PVDF membranes are rinsed vigorously without tear.
Parafilm Sealing Film	Bemis	Parafilm M PM996	semi-transparent flexible film
Polyethylene Flat-Top Screw Caps for 50 mL Conical Bottom Centrifuge Tubes	Falcon	352070
Rings to hold 14 ml tube in the center of 50 ml tube	N/A	N/A	Prepared in a machine shop
Rabbit anti-6X His tag antibody	Abcam	ab9108
Tween20	Millipore Sigma	P2287