Tache occidentale à très grande vitesse utilisant la technologie d’amélioration de l’immunoréaction

Résumé

Une technique de ballonnement occidental à très grande vitesse est développée en améliorant la cinétique de la liaison antigène-anticorps grâce à la technologie cyclique de drainage et de réapprovisionnement (CDR) en conjonction avec un agent améliorant l’immunoréaction.

Résumé

Une tache occidentale (également connue sous le nom d’immunoblot) est une méthode canonique pour la recherche biomédicale. Il est couramment utilisé pour déterminer la taille relative et l’abondance de protéines spécifiques ainsi que les modifications des protéines post-translationnelles. Cette technique a une histoire riche et reste largement utilisée en raison de sa simplicité. Cependant, la procédure occidentale de ballonnement prend des heures, voire des jours, pour terminer, avec un goulot d’étranglement critique étant les longs temps d’incubation qui limitent son débit. Ces étapes d’incubation sont nécessaires en raison de la lente diffusion des anticorps de la solution en vrac aux antigènes immobilisés sur la membrane : la concentration d’anticorps près de la membrane est beaucoup plus faible que la concentration en vrac. Ici, nous présentons une innovation qui réduit considérablement ces intervalles d’incubation en améliorant la liaison antigène par drainage cyclique et réapprovisionnement (CDR) de la solution d’anticorps. Nous avons également utilisé une technologie d’amélioration de l’immunoréaction pour préserver la sensibilité de l’essai. Une combinaison de la méthode CDR avec un agent d’amélioration de l’immunoréaction commerciale a stimulé le signal de sortie et considérablement réduit le temps d’incubation des anticorps. La tache occidentale à très grande vitesse qui en résulte peut être réalisée en 20 minutes sans aucune perte de sensibilité. Cette méthode peut être appliquée aux taches occidentales en utilisant à la fois la détection chemiluminescente et fluorescente. Ce protocole simple permet aux chercheurs de mieux explorer l’analyse de l’expression des protéines dans de nombreux échantillons.

Introduction

Une tache occidentale (également connue sous le nom d’immunoblot) est une technique puissante et fondamentale dans un large éventail de disciplines scientifiques et cliniques. Cette technique est utilisée pour examiner la présence, l’abondance relative, la masse moléculaire relative et les modifications post-translationnelles des protéines¹. Combinée à l’analyse d’images numériques, cette méthode peut analyser de manière fiable l’abondance des protéines et des modifications^{protéiques 2}. Bien que la tache occidentale soit exécutée régulièrement, c’est une méthode longue et laborique. De longues incubations de l’anticorps avec membranes sont nécessaires. Ici, nous décrivons une modification de la méthode d’incubation qui surmonte cette limitation sans sacrifier la sensibilité.

Pendant l’incubation de la membrane, les anticorps flottent en solution tandis que les antigènes sont immobilisés sur la membrane. En raison de leur affinité élevée, le taux d’anticorps se liant à l’antigène est plus rapide que la diffusion d’anticorps de la solution en vrac à la membrane. Cela crée une « couche d’épuisement » à faible concentration (figure 1). Il peut prendre des heures pour que des anticorps plus éloignés atteignent la membrane par diffusion passive, qui est le principal facteur responsable des longs temps d’incubation dans cette technique. Cet effet est appelé la limitation de transport de masse (MTL)³. Il a été proposé que le drainage répétitif et le réapprovisionnement de la solution contenant des anticorps puissent perturber la couche d’épuisement et surmonter le MTL⁴. Ici, nous avons conçu une technique unique qui met en œuvre ce concept cyclique de drainage et de réapprovisionnement (CDR) pour diminuer l’effet du MTL dans un protocole traditionnel de ballonnement occidental et raccourcir de façon remarquée la période d’incubation requise.

Afin de maintenir la sensibilité à la détection avec un temps d’incubation court, nous avons utilisé une technologie d’amélioration de l’immunoréaction qui accélère la réaction antigène-anticorps, améliorant ainsi le rapport signal-bruit⁵. De nombreux agents d’amélioration de l’immunoréaction disponibles dans le commerce (IRE) se composent de 2 composants (solution 1 et 2, voir tableau des matériaux). La composition propriétaire ou le mécanisme d’action de l’IRE n’a pas été divulgué, mais nous avons déjà constaté que l’IRE a diminué la constante de dissociation entre l’antigène et l’anticorps dans les essais de liaison de phase solide, indiquant que l’affinité accrue est, au moins en partie, responsable de l’effet d’amélioration de l’IRE⁶. La combinaison du CDR et de l’IRE donne un protocole de ballonnement occidental à très grande vitesse qui réduit tout le temps de procédure sans sacrifier la sensibilité.

Protocole

1. SDS-PAGE et transfert vers une membrane PVDF

1. Effectuez SDS-PAGE pour séparer les protéines en fonction de la taille relative.
   REMARQUE : Tout système de gel commercial ou fait maison est très bien. Veuillez suivre le protocole du fabricant.
2. Transférer les protéines séparées d’un gel sur une membrane PVDF.
   REMARQUE : Les méthodes de transfert courantes (transfert semi-sec ou humide) conviennent. Veuillez suivre le protocole du fabricant.

2. Blocage des membranes PVDF

1. Incuber les membranes dans des tampons de blocage appropriés pendant 1 h avec agitation à température ambiante.
   REMARQUE : Selon le système primaire d’anticorps et de détection, un tampon de blocage approprié doit être sélectionné. Par exemple, les bloqueurs les plus typiques sont le BSA, le lait sec non gras, la caséine et les polymères synthétiques commerciaux. PBS et/ou TBS avec 0.1% Tween20 sont les tampons les plus couramment utilisés. Cette étape de blocage peut se faire pendant la nuit à 4 °C.

3. Incubation avec anticorps primaire

1. Préparer 10% d’immunoréaction améliorant la solution agent-1 (IRE-1) avec de l’eau distillée. Vortex bien.
2. Préparez l’anticorps primaire dilué avec 10% d’IRE-1. Mélanger délicatement et bien.
3. Si vous utilisez une membrane plus grande (4 cm x 8 cm – 8 cm x 8 cm), ajoutez 8 mL de la solution d’anticorps en tubes de centrifugeuse conique de 50 mL. Si vous utilisez une membrane plus petite (2 cm x 8 cm – 4 cm x 8 cm), ajoutez 3 mL de la solution d’anticorps en tube de polypropylène rond de 14 mL(tableau des matériaux).
4. Prenez la membrane PVDF avec des pinces à épiler et égouttez brièvement la solution de blocage. Insérez la membrane PVDF dans ce tube avec des doigts gantés et assurez-vous que toute la membrane adhère à la paroi du tube. Lorsque la membrane PVDF est insérée dans un tube, faire face au « côté protéine » de la membrane qui était à l’origine en contact avec le gel vers l’intérieur. Fermez bien le bouchon.
5. Insérez le tube de 50 mL dans une bouteille en verre pour le four d’hybridation.
   REMARQUE : Lorsque des tubes de 14 mL sont utilisés pour cette incubation, insérez un tube de 14 mL dans le tube de 50 mL, à l’aide d’une paire de supports d’anneau en plastique pour maintenir le tube intérieur au centre du tube de 50 mL.
6. Allumez le four d’hybridation.
7. Incuber la membrane avec une rotation de 6 rpm pendant au moins 5 min.
   REMARQUE : Assurez-vous que la membrane adhère au mur en tout temps et que le tube (intérieur) est horizontal pour couvrir la membrane avec la solution d’anticorps uniformément. Calibrer la dilution de l’anticorps et le temps d’incubation avant l’expérience proprement dite.

4. Lavage membranaire

1. Arrêtez la rotation.
2. Retirez soigneusement la membrane PVDF du tube à l’aide d’une pince à épiler et placez la membrane dans un récipient contenant 50 mL de PBS-T.
3. Rincer brièvement la membrane avec du PBS-T.
4. Rincer la membrane dans le récipient avec de l’eau distillée jusqu’à ce qu’aucune bulle n’apparaisse. Il s’agit d’enlever la majorité de l’anticorps.
5. Transférer la membrane PVDF du récipient à l’essoreuse à salade qui contient 250 mL de PBS-T.
6. Placer le panier de passoire dans la filature. Assurez-vous que le couvercle a été mis en sécurité.
7. Activez la filature et exécutez-la pendant environ 20-30 s.
8. Jeter la solution et rincer brièvement l’intérieur de la filature avec de l’eau distillée.
9. Ajouter 250 mL de PBS-T dans la filature à nouveau.
10. Répétez les étapes 4.6 et 4.7.

5. Incubation avec l’anticorps secondaire

1. Préparer 10% d’immunoréaction améliorant la solution agent-2 (IRE-2) avec de l’eau distillée. Vortex bien.
2. Préparer l’anticorps secondaire dilué avec 10% d’IRE-2. Mélanger délicatement et bien.
3. Sélectionnez le volume de la solution et du tube d’anticorps tel qu’indiqué à l’étape 3.3.
4. Ramasser la membrane PVDF avec des pinces à épiler et égoutter la solution brièvement. Insérez la membrane PVDF dans le tube comme indiqué à l’étape 3.4.
5. Insérez le tube de 50 mL dans une bouteille en verre pour le four d’hybridation.
6. Allumez le four d’hybridation.
7. Incuber la membrane avec une rotation de 6 rpm pendant au moins 5 min. Assurez-vous que la membrane adhère au mur en tout temps et que le tube (intérieur) est horizontal pour couvrir uniformément la membrane avec la solution d’anticorps.
   REMARQUE : Calibrer le temps d’incubation avant l’expérience proprement dite. Lorsque l’anticorps secondaire est conjugué fluorescent, effectuez l’incubation dans l’obscurité.

6. Lavage membranaire

1. Suivez les étapes 4.1 à 4.10.

7. Acquisition d’images

1. Détection chemiluminescente
   1. Placez un morceau de film flexible semi-transplant (10 cm x 15 cm) sur une surface plane.
   2. Mélanger 2 composants du substrat chimioluminescent dans un tube de 5 mL.
   3. Transférez immédiatement 1,5 mL du substrat mélangé au film flexible semi-transplanté et placez la membrane PVDF dessus. Ensuite, transférez le reste de la solution de substrat sur la membrane.
   4. Incuber la membrane PVDF avec le substrat mélangé sur un film flexible semi-transparent pendant 1 min.
   5. Ramassez la membrane PVDF avec des pinces à épiler et égouttez brièvement la solution de substrat.
   6. Sandwich la membrane entre une paire de films de transparence.
   7. Acquérir l’image en mode chemiluminescent.
2. Détection fluorescente
   1. Ramasser la membrane PVDF avec des pinces à épiler et égoutter la solution brièvement.
   2. Sandwich la membrane entre une paire de films de transparence.
   3. Acquérir l’image en mode fluorescent.
      REMARQUE : Les étapes 7.1 et 7.2 doivent être effectuées à proximité de la machine d’imagerie afin d’assurer une sensibilité maximale.
   4. Lorsque le signal d’arrière-plan est élevé, effectuez une étape de lavage dans un récipient avec 80-100 mL de PBS-T: 10 min rincer 3 fois pour l’anticorps primaire et 5 min rincer 6 fois pour l’anticorps secondaire.
      REMARQUE : Les anticorps primaires et secondaires dilués avec des solutions IRE à 10 % peuvent être utilisés jusqu’à 8 à 10 fois sans perte de sensibilité⁶. La solution doit être maintenue à 4 °C jusqu’à 1 mois.

Résultats

Cet exemple illustre l’efficacité de la méthode CDR ainsi que la technologie d’immunoenhancing sur la tache occidentale. L’incubation statique a été effectuée sur un film flexible semi-transparent où les membranes PVDF ont été incubées avec la solution d’anticorps, tandis que l’incubation du CDR était dans un four d’hybridation par des tubes rotatifs qui contenaient les membranes et la solution d’anticorps (Movie). La figure 2 a montré des quantités d’antigène et...

Discussion

Tache occidentale est une technique d’analyse largement utilisée pour détecter des protéines spécifiques qui a été développé ~ il ya 40 ans^7,8. Depuis lors, la technique a continué d’évoluer, avec des innovations ultérieures améliorant la sensibilité, la vitesse et la quantitation de la technique^2,9,10,11,

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, Graduated, with Snap Cap	Falcon	352059
Apollo Transparency Film for Laser Printers	N/A	N/A	Any kinds of Laser Printer Transparency Film are fine.
Azure Imaging System 600	Azure Biosystems	Azure 600	Any kind of Image Acquiring Sytem is fine for chemiluminescent and/or fluorescent detection.
Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution	TOYOBO	NKB-101
CARNATION Instant Nonfat Dry Milk	Carnation	N/A
ECL anti-mouse IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from sheep	GE Healthcare	NA9310V
ECL anti-rabbit IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from donkey	GE Healthcare	NA9340V
HYBAID Micro-4	N/A	N/A	Any hybridization oven is fine as long as the tubes are rotated evenly at a horizontal position.
Immobilon-P PVDF Membrane, 0.45 µm pore size	Millipore Sigma	IPVH304F0
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody	LICOR	926-68070
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody	LICOR	926-32211
KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate	seracare	5430-0049
Mouse anti-ß actin antibody	Millipore Sigma	A5316
Odyssey Blocking Buffer (PBS)	LICOR	927-40100	Blocking Buffer for fluorescent detection
OXO Salad Spinner	OXO	32480V2B	Any salad spinner is fine as long as the PVDF membranes are rinsed vigorously without tear.
Parafilm Sealing Film	Bemis	Parafilm M PM996	semi-transparent flexible film
Polyethylene Flat-Top Screw Caps for 50 mL Conical Bottom Centrifuge Tubes	Falcon	352070
Rings to hold 14 ml tube in the center of 50 ml tube	N/A	N/A	Prepared in a machine shop
Rabbit anti-6X His tag antibody	Abcam	ab9108
Tween20	Millipore Sigma	P2287