Western Blot ad altissima velocità che utilizza la tecnologia di miglioramento dell'immunoreazione

Riepilogo

Una tecnica di soffiatura occidentale ad altissima velocità viene sviluppata migliorando la cinetica del legame antigene-anticorpo attraverso la tecnologia di drenaggio e rifornimento ciclico (CDR) in combinazione con un agente che migliora l'immunoreazione.

Abstract

Una macchia occidentale (nota anche come immunoblot) è un metodo canonico per la ricerca biomedica. È comunemente usato per determinare la dimensione relativa e l'abbondanza di proteine specifiche e le modifiche delle proteine post-traslazionali. Questa tecnica ha una ricca storia e rimane ampiamente utilizzata per la sua semplicità. Tuttavia, la procedura di gonfiore occidentale richiede notoriamente ore, anche giorni, per essere completata, con un collo di bottiglia critico che sono i lunghi tempi di incubazione che ne limitano la produttività. Questi passaggi di incubazione sono necessari a causa della lenta diffusione degli anticorpi dalla soluzione sfusa agli antigeni immobilizzati sulla membrana: la concentrazione di anticorpi vicino alla membrana è molto inferiore alla concentrazione di massa. Qui presentiamo un'innovazione che riduce drasticamente questi intervalli di incubazione migliorando il legame dell'antigene attraverso il drenaggio ciclico e il rifornimento (CDR) della soluzione anticorpale. Abbiamo anche utilizzato una tecnologia di miglioramento dell'immunoreazione per preservare la sensibilità del saggio. Una combinazione del metodo CDR con un agente di miglioramento dell'immunoreazione commerciale ha aumentato il segnale di uscita e ridotto sostanzialmente il tempo di incubazione degli anticorpi. La macchia occidentale ad altissima velocità risultante può essere eseguita in 20 minuti senza alcuna perdita di sensibilità. Questo metodo può essere applicato alle macchie occidentali utilizzando sia il rilevamento chemiluminescente che fluorescente. Questo semplice protocollo consente ai ricercatori di esplorare meglio l'analisi dell'espressione proteica in molti campioni.

Introduzione

Una macchia occidentale (nota anche come immunoblot) è una tecnica potente e fondamentale in un'ampia gamma di discipline scientifiche e cliniche. Questa tecnica è usata per esaminare la presenza, l'abbondanza relativa, la massa molecolare relativa e le modifiche post-tras traslizionali delle proteine¹. Combinato con l'analisi digitale delle immagini, questo metodo può analizzare in modo affidabile l'abbondanza di proteine e modifiche^{proteiche 2}. Sebbene la macchia occidentale sia eseguita regolarmente, è un metodo dispendioso in termini di tempo e manodopera. Sono necessarie lunghe incubazioni dell'anticorpo con membrane. Qui descriviamo una modifica del metodo di incubazione che supera questa limitazione senza sacrificare la sensibilità.

Durante l'incubazione della membrana, gli anticorpi galleggiano in soluzione mentre gli antigeni vengono immobilizzati sulla membrana. A causa della loro elevata affinità, il tasso di legame degli anticorpi all'antigene è più veloce della diffusione degli anticorpi dalla soluzione sfusa alla membrana. In questo modo si crea un "livello di esaurimento" a bassa concentrazione (Figura 1). Potrebbero essere necessario ore prima che anticorpi più distanti raggiungano la membrana attraverso la diffusione passiva, che è il principale fattore responsabile dei lunghi tempi di incubazione in questa tecnica. Questo effetto è chiamato limitazione del trasporto di massa (MTL)³. È stato proposto che il drenaggio ripetitivo e il rifornimento della soluzione contenente anticorpi possano interrompere lo strato di esaurimento e superare l'MTL⁴. Qui, abbiamo ideato una tecnica unica che implementa questo concetto ciclico di drenaggio e rifornimento (CDR) per diminuire l'effetto dell'MTL in un tradizionale protocollo di soffiatura occidentale e ridurre notevolmente il periodo di incubazione richiesto.

Al fine di mantenere la sensibilità di rilevamento con un breve tempo di incubazione, abbiamo fatto uso di una tecnologia di miglioramento dell'immunoreazione che accelera la reazione antigene-anticorpo, migliorando così il rapporto segnale-rumore⁵. Molti agenti di miglioramento dell'immunoreazione disponibili in commercio (IRE) sono costituiti da 2 componenti (soluzione 1 e 2, vedi Tabella dei materiali). La composizione proprietaria o il meccanismo d'azione dell'IRE non è stato divulgato, ma abbiamo precedentemente scoperto che IRE ha diminuito la costante di dissociazione tra l'antigene e l'anticorpo nei test di legame in fase solida, indicando che una maggiore affinità è, almeno in parte, responsabile dell'effetto di miglioramento dell'IRE⁶. La combinazione di CDR e IRE produce un protocollo western blotting ad altissima velocità che riduce l'intero tempo di procedura senza sacrificare la sensibilità.

Protocollo

1. SDS-PAGE e trasferimento a una membrana PVDF

1. Eseguire SDS-PAGE per separare le proteine in base alle dimensioni relative.
   NOTA: Qualsiasi sistema di gel commerciale o fatto in casa va bene. Si prega di seguire il protocollo del produttore.
2. Trasferire proteine separate da un gel su una membrana PVDF.
   NOTA: Sono adatti metodi di trasferimento comuni (trasferimento semi-secco o umido). Si prega di seguire il protocollo del produttore.

2. Blocco delle membrane PVDF

1. Incubare le membrane in apposita tampone di blocco per 1 h con agitazione a temperatura ambiente.
   NOTA: A seconda dell'anticorpo primario e del sistema di rilevamento, deve essere selezionato un buffer di blocco appropriato. Ad esempio, i bloccanti più tipici sono BSA, latte secco non grasso, caseina e polimeri sintetici commerciali. PBS e/o TBS con 0,1% Tween20 sono i buffer più comunemente utilizzati. Questo passaggio di blocco può essere fatto durante la notte a 4 °C.

3. Incubazione con anticorpo primario

1. Preparare una soluzione agente-1 per il miglioramento dell'immunoreazione al 10% (IRE-1) con acqua distillata. Vortice bene.
2. Preparare l'anticorpo primario diluito con il 10% di IRE-1. Mescolare delicatamente e accuratamente.
3. Se si utilizza una membrana più grande (4 cm x 8 cm - 8 cm x 8 cm), aggiungere 8 ml della soluzione anticorpale in tubi di centrifuga conica da 50 ml. Se si utilizza una membrana più piccola (2 cm x 8 cm - 4 cm x 8 cm), aggiungere 3 ml della soluzione anticorpale in un tubo di polipropilene a fondo rotondo da 14 ml(tabella dei materiali).
4. Raccogliere la membrana PVDF con una pinzetta e drenare brevemente la soluzione di blocco. Inserire la membrana PVDF in questo tubo con le dita guantate e assicurarsi che l'intera membrana aderisca alla parete del tubo. Quando la membrana PVDF viene inserita in un tubo, affrontare il "lato proteico" della membrana che era originariamente a contatto con il gel verso l'interno. Chiudere saldamente il cappuccio.
5. Inserire il tubo da 50 ml in una bottiglia di vetro per il forno di ibridazione.
   NOTA: Quando per questa incubazione vengono utilizzati tubi da 14 ml, inserire un tubo da 14 ml nel tubo da 50 mL, utilizzando un paio di supporti ad anello di plastica per mantenere la camera d'aria al centro del tubo da 50 ml.
6. Accendere il forno di ibridazione.
7. Incubare la membrana con rotazione di 6 giri/min per almeno 5 minuti.
   NOTA: Assicurarsi che la membrana aderisca alla parete in ogni momento e che il tubo (interno) sia orizzontale per coprire la membrana con la soluzione anticorpale in modo uniforme. Calibrare la diluizione dell'anticorpo e il tempo di incubazione prima dell'esperimento effettivo.

4. Lavaggio a membrana

1. Interrompere la rotazione.
2. Rimuovere con cura la membrana PVDF dal tubo con una pinzetta e posizionare la membrana in un contenitore con 50 ml di PBS-T.
3. Risciacquare brevemente la membrana con PBS-T.
4. Risciacquare la membrana nel contenitore con acqua distillata fino a quando non compaiono bolle. Questo per rimuovere la maggior parte dell'anticorpo.
5. Trasferire la membrana PVDF dal contenitore allo spinner per insalate che contiene 250 mL di PBS-T.
6. Posizionare il cestello del filtro nello spinner. Assicurarsi che il coperchio sia stato messo su in modo sicuro.
7. Attivare lo spinner ed eseguito per circa 20-30 s.
8. Scartare la soluzione e sciacquare brevemente l'interno dello spinner con acqua distillata.
9. Aggiungere nuovamente 250 mL di PBS-T nello spinner.
10. Ripetere i passaggi 4.6 e 4.7.

5. Incubazione con l'anticorpo secondario

1. Preparare una soluzione agente-2 che migliora l'immunoreazione al 10% (IRE-2) con acqua distillata. Vortice bene.
2. Preparare l'anticorpo secondario diluito con il 10% di IRE-2. Mescolare delicatamente e accuratamente.
3. Selezionare il volume della soluzione anticorpale e del tubo come indicato al passaggio 3.3.
4. Raccogliere la membrana PVDF con una pinzetta e scolare brevemente la soluzione. Inserire la membrana PVDF nel tubo come indicato al passaggio 3.4.
5. Inserire il tubo da 50 ml in una bottiglia di vetro per il forno di ibridazione.
6. Accendere il forno di ibridazione.
7. Incubare la membrana con rotazione di 6 giri/min per almeno 5 minuti. Assicurarsi che la membrana aderisca alla parete in ogni momento e che il tubo (interno) sia orizzontale per coprire uniformemente la membrana con la soluzione anticorpale.
   NOTA: Calibrare il tempo di incubazione prima dell'esperimento effettivo. Quando l'anticorpo secondario è coniugato fluorescentmente, eseguire l'incubazione al buio.

6. Lavaggio a membrana

1. Seguire i passaggi da 4.1 a 4.10.

7. Acquisizione di immagini

1. Rilevamento chemiluminescente
   1. Posizionare un pezzo di pellicola flessibile semi-trapianto (10 cm x 15 cm) su una superficie piana.
   2. Mescolare 2 componenti del substrato chemiluminescente in un tubo da 5 ml.
   3. Trasferire immediatamente 1,5 mL del substrato misto nella pellicola flessibile semi-trapianto e posizionarla su di essa. Quindi, trasferire il resto della soluzione di substrato sulla membrana.
   4. Incubare la membrana PVDF con il substrato misto su un film flessibile semitrasparente per 1 minuto.
   5. Raccogliere la membrana PVDF con una pinzetta e drenare brevemente la soluzione del substrato.
   6. Incastro la membrana tra un paio di pellicole di trasparenza.
   7. Acquisire l'immagine in modalità chemiluminescente.
2. Rilevamento fluorescente
   1. Raccogliere la membrana PVDF con una pinzetta e scolare brevemente la soluzione.
   2. Incastro la membrana tra un paio di pellicole di trasparenza.
   3. Acquisire l'immagine in modalità fluorescente.
      NOTA: I passaggi 7.1 e 7.2 devono essere eseguiti in prossimità della macchina per immagini per garantire la massima sensibilità.
   4. Quando il segnale di fondo è alto, eseguire una fase di lavaggio in un contenitore con 80-100 mL di PBS-T: risciacquo di 10 minuti 3 volte per l'anticorpo primario e risciacquo di 5 minuti 6 volte per l'anticorpo secondario.
      NOTA: Sia gli anticorpi primari che secondari diluiti con soluzioni IRE al 10% possono essere utilizzati fino a 8-10 volte senza perdita di sensibilità⁶. La soluzione deve essere mantenuta a 4 °C per un massimo di 1 mese.

Risultati

Questo esempio illustra l'efficacia del metodo CDR insieme alla tecnologia di immunoenhancing sulla macchia occidentale. L'incubazione statica è stata eseguita su un film flessibile semitrasparente in cui le membrane PVDF sono state incubate con la soluzione anticorpale, mentre l'incubazione CDR era in un forno di ibridazione da tubi rotanti che contenevano le membrane e la soluzione anticorpale (Movie). La figura 2 ha mostrato quantità di antigene e anticorpo, rispettivamente, necessarie ...

Discussione

Western blot è una tecnica analitica ampiamente utilizzata per rilevare proteine specifiche che è stata sviluppata ~ 40 anni^{fa 7,8}. Da allora, la tecnica ha continuato ad evolversi, con successive innovazioni che migliorano la sensibilità, la velocità e la quantificazione^{della tecnica 2,9,10,11,12,}...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, Graduated, with Snap Cap	Falcon	352059
Apollo Transparency Film for Laser Printers	N/A	N/A	Any kinds of Laser Printer Transparency Film are fine.
Azure Imaging System 600	Azure Biosystems	Azure 600	Any kind of Image Acquiring Sytem is fine for chemiluminescent and/or fluorescent detection.
Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution	TOYOBO	NKB-101
CARNATION Instant Nonfat Dry Milk	Carnation	N/A
ECL anti-mouse IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from sheep	GE Healthcare	NA9310V
ECL anti-rabbit IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from donkey	GE Healthcare	NA9340V
HYBAID Micro-4	N/A	N/A	Any hybridization oven is fine as long as the tubes are rotated evenly at a horizontal position.
Immobilon-P PVDF Membrane, 0.45 µm pore size	Millipore Sigma	IPVH304F0
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody	LICOR	926-68070
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody	LICOR	926-32211
KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate	seracare	5430-0049
Mouse anti-ß actin antibody	Millipore Sigma	A5316
Odyssey Blocking Buffer (PBS)	LICOR	927-40100	Blocking Buffer for fluorescent detection
OXO Salad Spinner	OXO	32480V2B	Any salad spinner is fine as long as the PVDF membranes are rinsed vigorously without tear.
Parafilm Sealing Film	Bemis	Parafilm M PM996	semi-transparent flexible film
Polyethylene Flat-Top Screw Caps for 50 mL Conical Bottom Centrifuge Tubes	Falcon	352070
Rings to hold 14 ml tube in the center of 50 ml tube	N/A	N/A	Prepared in a machine shop
Rabbit anti-6X His tag antibody	Abcam	ab9108
Tween20	Millipore Sigma	P2287