Blot occidental de ultra alta velocidad usando tecnología de mejora de la inmunorreacción

Resumen

Una técnica de distensión occidental de ultra alta velocidad se desarrolla mejorando la cinética de la unión antígeno-anticuerpo a través de la tecnología de drenaje cíclico y reposición (CDR) junto con un agente que mejora la inmunorreacción.

Resumen

Una mancha occidental (también conocida como inmunoblot) es un método canónico para la investigación biomédica. Se utiliza comúnmente para determinar el tamaño relativo y la abundancia de proteínas específicas, así como modificaciones de proteínas post-traslacionales. Esta técnica tiene una rica historia y permanece en uso generalizado debido a su simplicidad. Sin embargo, el procedimiento de hinchazón occidental famosamente toma horas, incluso días, para completar, con un cuello de botella crítico siendo los largos tiempos de incubación que limitan su rendimiento. Estos pasos de incubación son necesarios debido a la lenta difusión de anticuerpos de la solución a granel a los antígenos inmovilizados en la membrana: la concentración de anticuerpos cerca de la membrana es mucho menor que la concentración a granel. Aquí, presentamos una innovación que reduce drásticamente estos intervalos de incubación mediante la mejora de la unión de antígenos a través del drenaje cíclico y la reposición (CDR) de la solución de anticuerpos. También utilizamos una tecnología de mejora de la inmunorreacción para preservar la sensibilidad del ensayo. Una combinación del método CDR con un agente comercial de mejora de la inmunorreacción aumentó la señal de salida y redujo sustancialmente el tiempo de incubación de anticuerpos. La mancha occidental de ultra alta velocidad resultante se puede lograr en 20 minutos sin ninguna pérdida de sensibilidad. Este método se puede aplicar a las manchas occidentales utilizando detección quimioluminiscente y fluorescente. Este sencillo protocolo permite a los investigadores explorar mejor el análisis de la expresión proteica en muchas muestras.

Introducción

Una mancha occidental (también conocida como inmunoblot) es una técnica poderosa y fundamental en una amplia gama de disciplinas científicas y clínicas. Esta técnica se utiliza para examinar la presencia, la abundancia relativa, la masa molecular relativa y las modificaciones post-traslacionales de las proteínas^1. Combinado con el análisis de imágenes digitales, este método puede analizar de forma fiable la abundancia de proteínas y modificaciones de proteínas^2. Aunque la mancha occidental se realiza de forma rutinaria, es un método que consume mucho tiempo y requiere mucho trabajo. Se requieren largas incubaciones del anticuerpo con membranas. Aquí, describimos una modificación del método de incubación que supera esta limitación sin sacrificar la sensibilidad.

Durante la incubación de la membrana, los anticuerpos flotan en solución mientras que los antígenos se inmovilizan en la membrana. Debido a su alta afinidad, la tasa de unión de anticuerpos al antígeno es más rápida que la difusión de anticuerpos de la solución a granel a la membrana. Esto crea una "capa de agotamiento" de baja concentración (Figura 1). Los anticuerpos más distantes pueden tardar horas en llegar a la membrana a través de la difusión pasiva, que es el principal factor responsable de los largos tiempos de incubación en esta técnica. Este efecto se denomina limitación de transporte masivo (MTL)³. Se ha propuesto que el drenaje repetitivo y la reposición de la solución que contiene anticuerpos puedan interrumpir la capa de agotamiento y superar el MTL^4. Aquí, hemos ideado una técnica única que implementa este concepto cíclico de drenaje y reposición (CDR) para disminuir el efecto de MTL en un protocolo tradicional de hinchazón occidental y acortar notablemente el período de incubación requerido.

Con el fin de mantener la sensibilidad de detección con un corto tiempo de incubación, hicimos uso de una tecnología de mejora de la inmunorreacción que acelera la reacción antígeno-anticuerpo, mejorando así la relación señal-ruido^5. Muchos agentes de mejora de inmunorreacción disponibles comercialmente (IRE) constan de 2 componentes (Solución 1 y 2, véase Tabla de Materiales). La composición o mecanismo de acción patentado de la IRE no se ha divulgado, pero hemos encontrado previamente que la IRE disminuyó la constante de disociación entre el antígeno y el anticuerpo en ensayos de unión de fase sólida, lo que indica que el aumento de la afinidad es, al menos en parte, responsable del efecto de mejora del IRE^6. La combinación de CDR con IRE produce un protocolo de distensión occidental de ultra alta velocidad que reduce todo el tiempo de procedimiento sin sacrificar la sensibilidad.

Protocolo

1. SDS-PAGE y transferir a una membrana PVDF

1. Realice SDS-PAGE para separar las proteínas en función del tamaño relativo.
   NOTA: Cualquier sistema de gel comercial o casero está bien. Por favor, siga el protocolo del fabricante.
2. Transfiera proteínas separadas de un gel a una membrana PVDF.
   NOTA: Los métodos de transferencia comunes (transferencia semi-seca o húmeda) son adecuados. Por favor, siga el protocolo del fabricante.

2. Bloqueo de membranas PVDF

1. Incubar las membranas en amortiguadores de bloqueo adecuados durante 1 h con agitación a temperatura ambiente.
   NOTA: Dependiendo del anticuerpo principal y del sistema de detección, se debe seleccionar un búfer de bloqueo adecuado. Por ejemplo, los bloqueadores más típicos son BSA, leche seca sin grasa, caseína y polímeros sintéticos comerciales. PBS y/o TBS con 0,1% Tween20 son los búferes más utilizados. Este paso de bloqueo se puede realizar durante la noche a 4 °C.

3. Incubación con anticuerpo primario

1. Prepare una solución agente-1 que mejore la inmunorreacción al 10% (IRE-1) con agua destilada. Vórtice bien.
2. Prepare el anticuerpo primario diluido con un 10% IRE-1. Mézclalo suave y a fondo.
3. Si utiliza una membrana más grande (4 cm x 8 cm – 8 cm x 8 cm), agregue 8 ml de la solución de anticuerpos en tubos centrífugas cónicos de 50 ml. Si utiliza una membrana más pequeña (2 cm x 8 cm – 4 cm x 8 cm), agregue 3 ml de la solución de anticuerpos en tubo de polipropileno de fondo redondo de 14 ml (Tabla de materiales).
4. Recoja la membrana PVDF con pinzas y escurra brevemente la solución de bloqueo. Inserte la membrana PVDF en este tubo con los dedos enguantados y asegúrese de que toda la membrana se adhiere a la pared del tubo. Cuando la membrana PVDF se inserta en un tubo, se enfrenta al "lado proteico" de la membrana que originalmente estaba en contacto con el gel hacia adentro. Cierre bien la tapa.
5. Inserte el tubo de 50 ml en una botella de vidrio para el horno de hibridación.
   NOTA: Cuando se utilicen tubos de 14 ml para esta incubación, inserte un tubo de 14 ml en el tubo de 50 ml, utilizando un par de soportes de anillo de plástico para mantener el tubo interno en el centro del tubo de 50 ml.
6. Encienda el horno de hibridación.
7. Incubar la membrana con rotación de 6 rpm durante al menos 5 minutos.
   NOTA: Asegúrese de que la membrana se adhiere a la pared en todo momento y de que el tubo (interno) es horizontal para cubrir la membrana con la solución de anticuerpos uniformemente. Calibrar la dilución del anticuerpo y el tiempo de incubación antes del experimento real.

4. Lavado de membrana

1. Detenga la rotación.
2. Retire cuidadosamente la membrana PVDF del tubo con pinzas y coloque la membrana en un recipiente con 50 ml de PBS-T.
3. Enjuague brevemente la membrana con PBS-T.
4. Enjuague la membrana del recipiente con agua destilada hasta que no aparezcan burbujas. Esto es para eliminar la mayoría del anticuerpo.
5. Transfiera la membrana PVDF del recipiente al hilandero de ensalada que contiene 250 ml de PBS-T.
6. Coloque la cesta del colador en el spinner. Asegúrese de que la tapa se haya puesto de forma segura.
7. Activa el spinner y corre durante unos 20-30 s.
8. Deseche la solución y enjuague brevemente el interior del hilandero con agua destilada.
9. Agregue 250 mL de PBS-T en el spinner otra vez.
10. Repita los pasos 4.6 y 4.7.

5. Incubación con el anticuerpo secundario

1. Prepare una solución agente-2 que mejore la inmunorreacción al 10% (IRE-2) con agua destilada. Vórtice bien.
2. Prepare el anticuerpo secundario diluido con un 10% IRE-2. Mézclalo suave y a fondo.
3. Seleccione el volumen de la solución de anticuerpos y el tubo como se indica en el paso 3.3.
4. Recoja la membrana PVDF con pinzas y escurra la solución brevemente. Inserte la membrana PVDF en el tubo como se indica en el paso 3.4.
5. Inserte el tubo de 50 ml en una botella de vidrio para el horno de hibridación.
6. Encienda el horno de hibridación.
7. Incubar la membrana con rotación de 6 rpm durante al menos 5 minutos. Asegúrese de que la membrana se adhiere a la pared en todo momento y de que el tubo (interno) es horizontal para cubrir uniformemente la membrana con la solución de anticuerpos.
   NOTA: Calibrar el tiempo de incubación antes del experimento real. Cuando el anticuerpo secundario esté conjugado fluorescentemente, realice la incubación en la oscuridad.

6. Lavado de membrana

1. Siga los pasos 4.1 a 4.10.

7. Adquisición de imágenes

1. Detección de quimioluminiscentes
   1. Coloque una pieza de película flexible semi-trasplantada (10 cm x 15 cm) sobre una superficie plana.
   2. Mezcle 2 componentes del sustrato quimioluminiscente en un tubo de 5 ml.
   3. Transfiera inmediatamente 1,5 ml del sustrato mixto a la película flexible semi-trasplante y coloque la membrana PVDF sobre ella. A continuación, transfiera el resto de la solución de sustrato a la membrana.
   4. Incubar la membrana PVDF con el sustrato mixto en una película flexible semitransparente durante 1 min.
   5. Recoja la membrana PVDF con pinzas y escurra brevemente la solución de sustrato.
   6. Empareje la membrana entre un par de películas de transparencia.
   7. Adquiera la imagen bajo modo quimioluminiscente.
2. Detección fluorescente
   1. Recoja la membrana PVDF con pinzas y escurra la solución brevemente.
   2. Empareje la membrana entre un par de películas de transparencia.
   3. Adquiera la imagen en modo fluorescente.
      NOTA: Los pasos 7.1 y 7.2 deben realizarse cerca de la máquina de imágenes para garantizar la máxima sensibilidad.
   4. Cuando la señal de fondo es alta, realice un paso de lavado en un recipiente con 80-100 ml de PBS-T: 10 minutos de enjuague 3 veces para el anticuerpo primario y 5 minutos de enjuague 6 veces para el anticuerpo secundario.
      NOTA: Los anticuerpos primarios y secundarios diluidos con soluciones IRE del 10% se pueden utilizar hasta 8-10 veces sin pérdida de sensibilidad⁶. La solución debe mantenerse a 4 °C durante un mes.

Resultados

Este ejemplo ilustra la eficacia del método CDR junto con la tecnología de inmunoenhancing en western blot. La incubación estática se realizó en una película flexible semitransparente donde las membranas PVDF fueron incubadas con la solución de anticuerpos, mientras que la incubación de CDR fue en un horno de hibridación mediante tubos giratorios que contenían las membranas y la solución de anticuerpos (Movie). La Figura 2 mostró cantidades de antígeno y anticuerpos, respectivam...

Discusión

Western blot es una técnica analítica ampliamente utilizada para detectar proteínas específicas que se desarrolló ~Hace 40 años^7,8. Desde entonces, la técnica ha seguido evolucionando, con innovaciones posteriores mejorando la sensibilidad, velocidad y cuantificación de la técnica^{2,9,10,11,12,}...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, Graduated, with Snap Cap	Falcon	352059
Apollo Transparency Film for Laser Printers	N/A	N/A	Any kinds of Laser Printer Transparency Film are fine.
Azure Imaging System 600	Azure Biosystems	Azure 600	Any kind of Image Acquiring Sytem is fine for chemiluminescent and/or fluorescent detection.
Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution	TOYOBO	NKB-101
CARNATION Instant Nonfat Dry Milk	Carnation	N/A
ECL anti-mouse IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from sheep	GE Healthcare	NA9310V
ECL anti-rabbit IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from donkey	GE Healthcare	NA9340V
HYBAID Micro-4	N/A	N/A	Any hybridization oven is fine as long as the tubes are rotated evenly at a horizontal position.
Immobilon-P PVDF Membrane, 0.45 µm pore size	Millipore Sigma	IPVH304F0
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody	LICOR	926-68070
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody	LICOR	926-32211
KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate	seracare	5430-0049
Mouse anti-ß actin antibody	Millipore Sigma	A5316
Odyssey Blocking Buffer (PBS)	LICOR	927-40100	Blocking Buffer for fluorescent detection
OXO Salad Spinner	OXO	32480V2B	Any salad spinner is fine as long as the PVDF membranes are rinsed vigorously without tear.
Parafilm Sealing Film	Bemis	Parafilm M PM996	semi-transparent flexible film
Polyethylene Flat-Top Screw Caps for 50 mL Conical Bottom Centrifuge Tubes	Falcon	352070
Rings to hold 14 ml tube in the center of 50 ml tube	N/A	N/A	Prepared in a machine shop
Rabbit anti-6X His tag antibody	Abcam	ab9108
Tween20	Millipore Sigma	P2287