Blot occidental de ultra alta velocidad usando tecnología de mejora de la inmunorreacción

Resumen

Una técnica de distensión occidental de ultra alta velocidad se desarrolla mejorando la cinética de la unión antígeno-anticuerpo a través de la tecnología de drenaje cíclico y reposición (CDR) junto con un agente que mejora la inmunorreacción.

Resumen

Una mancha occidental (también conocida como inmunoblot) es un método canónico para la investigación biomédica. Se utiliza comúnmente para determinar el tamaño relativo y la abundancia de proteínas específicas, así como modificaciones de proteínas post-traslacionales. Esta técnica tiene una rica historia y permanece en uso generalizado debido a su simplicidad. Sin embargo, el procedimiento de hinchazón occidental famosamente toma horas, incluso días, para completar, con un cuello de botella crítico siendo los largos tiempos de incubación que limitan su rendimiento. Estos pasos de incubación son necesarios debido a la lenta difusión de anticuerpos de la solución a granel a los antígenos inmovilizados en la membrana: la concentración de anticuerpos cerca de la membrana es mucho menor que la concentración a granel. Aquí, presentamos una innovación que reduce drásticamente estos intervalos de incubación mediante la mejora de la unión de antígenos a través del drenaje cíclico y la reposición (CDR) de la solución de anticuerpos. También utilizamos una tecnología de mejora de la inmunorreacción para preservar la sensibilidad del ensayo. Una combinación del método CDR con un agente comercial de mejora de la inmunorreacción aumentó la señal de salida y redujo sustancialmente el tiempo de incubación de anticuerpos. La mancha occidental de ultra alta velocidad resultante se puede lograr en 20 minutos sin ninguna pérdida de sensibilidad. Este método se puede aplicar a las manchas occidentales utilizando detección quimioluminiscente y fluorescente. Este sencillo protocolo permite a los investigadores explorar mejor el análisis de la expresión proteica en muchas muestras.

Introducción

Una mancha occidental (también conocida como inmunoblot) es una técnica poderosa y fundamental en una amplia gama de disciplinas científicas y clínicas. Esta técnica se utiliza para examinar la presencia, la abundancia relativa, la masa molecular relativa y las modificaciones post-traslacionales de las proteínas^1. Combinado con el análisis de imágenes digitales, este método puede analizar de forma fiable la abundancia de proteínas y modificaciones de proteínas^2. Aunque la mancha occidental se realiza de forma rutinaria, es un método que consume mucho tiempo y requiere mucho trabajo. Se requieren largas incubaciones del a....

Protocolo

1. SDS-PAGE y transferir a una membrana PVDF

1. Realice SDS-PAGE para separar las proteínas en función del tamaño relativo.
   NOTA: Cualquier sistema de gel comercial o casero está bien. Por favor, siga el protocolo del fabricante.
2. Transfiera proteínas separadas de un gel a una membrana PVDF.
   NOTA: Los métodos de transferencia comunes (transferencia semi-seca o húmeda) son adecuados. Por favor, siga el protocolo del fabricante.

2. Bloqueo de membranas PVDF

1. Incubar las membranas en amortiguadores de bloqueo adecuados durante 1 h con agitación a temperatura ambiente.
   NOTA: Dependiendo del anticuerpo pri....

Resultados

Este ejemplo ilustra la eficacia del método CDR junto con la tecnología de inmunoenhancing en western blot. La incubación estática se realizó en una película flexible semitransparente donde las membranas PVDF fueron incubadas con la solución de anticuerpos, mientras que la incubación de CDR fue en un horno de hibridación mediante tubos giratorios que contenían las membranas y la solución de anticuerpos (Movie). La Figura 2 mostró cantidades de antígeno y anticuerpos, respectivam.......

Discusión

Western blot es una técnica analítica ampliamente utilizada para detectar proteínas específicas que se desarrolló ~Hace 40 años^7,8. Desde entonces, la técnica ha seguido evolucionando, con innovaciones posteriores mejorando la sensibilidad, velocidad y cuantificación de la técnica^{2,9,10,11,12,}.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, Graduated, with Snap Cap	Falcon	352059
Apollo Transparency Film for Laser Printers	N/A	N/A	Any kinds of Laser Printer Transparency Film are fine.
Azure Imaging System 600	Azure Biosystems	Azure 600	Any kind of Image Acquiring Sytem is fine for chemiluminescent and/or fluorescent detection.
Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution	TOYOBO	NKB-101
CARNATION Instant Nonfat Dry Milk	Carnation	N/A
ECL anti-mouse IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from sheep	GE Healthcare	NA9310V
ECL anti-rabbit IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from donkey	GE Healthcare	NA9340V
HYBAID Micro-4	N/A	N/A	Any hybridization oven is fine as long as the tubes are rotated evenly at a horizontal position.
Immobilon-P PVDF Membrane, 0.45 µm pore size	Millipore Sigma	IPVH304F0
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody	LICOR	926-68070
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody	LICOR	926-32211
KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate	seracare	5430-0049
Mouse anti-ß actin antibody	Millipore Sigma	A5316
Odyssey Blocking Buffer (PBS)	LICOR	927-40100	Blocking Buffer for fluorescent detection
OXO Salad Spinner	OXO	32480V2B	Any salad spinner is fine as long as the PVDF membranes are rinsed vigorously without tear.
Parafilm Sealing Film	Bemis	Parafilm M PM996	semi-transparent flexible film
Polyethylene Flat-Top Screw Caps for 50 mL Conical Bottom Centrifuge Tubes	Falcon	352070
Rings to hold 14 ml tube in the center of 50 ml tube	N/A	N/A	Prepared in a machine shop
Rabbit anti-6X His tag antibody	Abcam	ab9108
Tween20	Millipore Sigma	P2287