A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
يقدم هذا البروتوكول مقايسة المشيمية التي تنبت ، وهو نموذج سابق vivo للانتشار الأوعية الدموية الدقيقة. ويمكن استخدام هذا الفحص لتقييم المسارات التي تشارك في انتشار الأوعية الدقيقة المشيمية وتقييم العلاجات الدوائية باستخدام النوع البري وأنسجة الفئران المعدلة وراثياً.
إن تولد الأوعية المشيمية المرضي، وهو سمة بارزة من الضمور البقعي المرتبط بالعمر، يؤدي إلى ضعف البصر والعمى. تستخدم فحوصات الانتشار في الخلايا البطانية (EC) باستخدام خلايا البطايخ البطانية الدقيقة (HRMECs) أو الخلايا الإلكترونية الأولية المعزولة للشبكية (EC) على نطاق واسع في نماذج المختبر لدراسة تكوين الأوعية الدموية في الشبكية. ومع ذلك، فإن عزل الخلايا البطانية النقية في شبكية العين هو أمر صعب تقنيًا وقد يكون لدى الخلايا الإلكترونية للشبكية استجابات مختلفة لانتشار الخلايا البطانية المشيمية وتفاعلات الخلايا/الخلايا المختلفة. تم تطوير مقايسة المشيمية السابقة القابلة للاستنساخ للغاية كنموذج لانتشار الأوعية الدموية الدقيقة المشيمية. يتضمن هذا النموذج التفاعل بين الأوعية الدموية المشيمية (EC، الضامة، الضم) وظهارة صبغ الشبكية (RPE). يتم عزل الماوس RPE / choroid / explants Scleral واحتضانها في مستخرج الغشاء القاعدي الذي يقل عن عامل النمو (BME) (يوم 0). يتم تغيير المتوسطة كل يوم والآخر ويتم تحديد كمي براعم المشيمية في اليوم 6. يتم التقاط صور من إبتلول المشيمية الفردية مع مجهر المرحلة المقلوبة ويتم قياس مساحة تنبت باستخدام ماكرو شبه مؤتمتة المكونات في لبرنامج ImageJ المتقدمة في هذا المختبر. ويمكن استخدام هذا الاختبار التنبّعي السابق المستنسخ من الجسم الحي في تقييم المركبات للعلاج المحتمل وبحوث الأمراض الوعائية الدقيقة لتقييم المسارات المشاركة في انتشار السفن الدقيقة المشيمية باستخدام النوع البري وأنسجة الماوس المعدلة وراثياً.
يرتبط خلل التشتت الوعائي المشيرويدي مع الضمور البقعي المرتبط بالعمر النيوفياز (AMD)1. المشيمية هي عبارة عن سرير الأوعية الدموية الدقيقة الموجود تحت ظهارة صبغ الشبكية (RPE). وقد تبين أن انخفاض تدفق الدم في المشيمية يرتبط مع تطور AMD2. العلاقة المعقدة بين بطانة الأوعية الدموية، RPE، الضامة، التحلل والخلايا الأخرى هي المسؤولة عن التوازن للأنسجة3،4،5. ولذلك، فإن وجود مقايسة مستنسخة النمذجة المشيمية microenvironment أمر بالغ الأهمية لدراسة أيه أمد neovascular.
يمكن أن تكمل فحوصات الخلايا الوعائية السابقة في الجسم وثقافات الخلايا البطانية في المختبر دراسات السلوك الجرع الوعائي الدقيق في الجسم الحي ، لاختبار الأدوية الجديدة والدراسات المتعلقة بالأمراض. الخلايا البطانية مثل الخلايا البطانية الدقيقة الأوعية الدموية البشرية (HRMECs)، الخلايا البطانية الوريدية البشرية (HUVEC)، الدماغ الحيوانية الأولية المعزولة أو ECs الشبكية وغالبا ما تستخدم في الدراسات المختبرية لأبحاث تكوين الأوعية الدموية بالعين6،7،8. وقد استخدمت على نطاق واسع HRMECs على وجه الخصوص كنموذج في المختبرية المشيمية neovascularization (CNV)9 عن طريق تقييم انتشار البطانية، والهجرة، وتشكيل أنبوبي، وتسرب الأوعية الدموية لتقييم التدخلات6،10. ومع ذلك، ECs في الثقافة محدودة كنموذج ل CNV بسبب عدم وجود تفاعلات مع أنواع الخلايا الأخرى الموجودة في المشيمية ولأن معظم EC المستخدمة في هذه المقايسات لا تنشأ من المشيمية. الماوس المشيمية ECs من الصعب عزل والحفاظ عليها في الثقافة.
ويستخدم على نطاق واسع في فحص عصابة الأبهر كنموذج لانتشار الأوعية الدموية الماكرو. وتشمل براعم الأوعية الدموية من الإكراميات الأبهرية ECs، والعمىوالضمة 11. نموذج فحص حلقة الأبهر كبيرة الأوعية الأوعية بشكل جيد12،13،14. ومع ذلك ، لديها قيود كنموذج ل neovascularization المشيمية كما الحلقات الأبهري هي الأنسجة الأوعية الدموية الماكرو تفتقر إلى البيئة المشيمية microvascular مميزة ، وبراعم من الأوعية الكبيرة قد تختلف عن براعم من شبكات الشعيرات الدموية المشاركة في علم الأمراض الأوعية الدموية الدقيقة. في الآونة الأخيرة نشرت مجموعة فحص الشبكية السابق vivo15,16. على الرغم من أنه مناسب لمرض الشبكية النوفية ، إلا أنه ليس مناسبًا للنيوفاسكولارسال المشيمية كما رأينا في AMD.
تم تطوير مقايسة التنبّه المشيمية باستخدام الماوس RPE، المشيمية، والأنسجة المسامية المُزرعة إلى أفضل نموذج لـ CNV. يمكن بسهولة أن تكون معزولة عن الأنسجة الماوس (أو أنواع أخرى) عيون17. هذا الاختبار يسمح التقييم استنساخها من الموالية والمضادة للأوعية المحتملة من المركبات الدوائية وتقييم دور مسارات محددة في neovascularization choroidal باستخدام أنسجة من الفئران المعدلة وراثيا والضوابط18. وقد تمت الإشارة إلى هذا المقايسة تنبت المشيمية في العديد من المنشورات اللاحقة9,10,18,19,20. هنا ، يتم عرض الطريقة المشاركة في استخدام هذا الفحص.
تمت الموافقة على جميع التجارب الحيوانية الموصوفة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في مستشفى بوسطن للأطفال (ARCH البروتوكول رقم 19-04-3913R).
1- الإعداد
2. الخطوات التجريبية (الشكل 1)
3.SWIFT-Choroid طريقة القياس الكميالمحوسبة 17 (الشكل 2)
ملاحظة: استخدمت طريقة محوسبة لقياس المساحة التي تغطيها السفن المتنامية. هناك حاجة إلى البرنامج المساعد الماكرو لبرنامج ImageJ قبل القياس الكمي (انظر معلومات تكميلية لمزيد من التفاصيل).
مقارنة بين النمو المشيمية التي تنبت في اليوم
نحن تشريح المشيمية مع صلبرة، جزءا لا يتجزأ من BME واستزراع لهم لمدة 6 أيام (الشكل 1). تم فحص المشيمية التي تنبت في فئران C57BL/6J من اليوم الثالث إلى اليوم السادس باستخدام المجهر وتم تحديد كمي مع SWIFT-Choroid طريقة تك?...
وsprosay تنبت المشيمية المساعدات البحوث في AMD neovascular9,10,18,19,20. يمكن عزل explants choroid من الفئران وكذلك الفئران والبشر17،21. وتشمل explant choroid ECs، الضامة، و pericytes17. في هذا ?...
ولا يملك أصحاب البلاغ أي إقرارات مالية. والطريقة المحوسبة متاحة مجانا للمؤسسات الأكاديمية من خلال المؤلفين.
تم دعم العمل من قبل المنح من مؤسسة مانبي سوزوكي السكري (YT)، مستشفى بوسطن للأطفال OFD/BTREC/CTREC كلية منحة التطوير الوظيفي، بوسطن مستشفى الأطفال مؤسسة طب العيون، جائزة تجريبية BCH، BCH مانتون مركز الزمالة، ومؤسسة الزرافة الصغيرة، ومؤسسة البحوث الألمانية (DFG؛ إلى BC [CA1940/1-1])، NIH R24EY024868، EY017017، R01EY01717-13S1، EY030904-01، BCH IDDRC (1U54HD090255)، مؤسسة ماساتشوستس ليونز العين (LEHS).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
AnaSed (Xylazine) | AKORN | 59339-110-20 | |
Basal membrane extract (BME) Matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
Cell culture dish | NEST | 704001 | 10cm |
Complete classic medium with serum and CultureBoost | Cell systems | 4Z0-500 | |
Ethyl alcohol 200 Proof | Pharmco | 111000200 | use for 70% |
Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666 | |
Microscope | ZEISS | Axio Observer Z1 | |
Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140 | 10000 U/mL |
Tissue culture plate (24-well) | Olympus | 25-107 | |
VetaKet CIII (Ketamine) | AKORN | 59399-114-10 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved