JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يقدم هذا البروتوكول مقايسة المشيمية التي تنبت ، وهو نموذج سابق vivo للانتشار الأوعية الدموية الدقيقة. ويمكن استخدام هذا الفحص لتقييم المسارات التي تشارك في انتشار الأوعية الدقيقة المشيمية وتقييم العلاجات الدوائية باستخدام النوع البري وأنسجة الفئران المعدلة وراثياً.

Abstract

إن تولد الأوعية المشيمية المرضي، وهو سمة بارزة من الضمور البقعي المرتبط بالعمر، يؤدي إلى ضعف البصر والعمى. تستخدم فحوصات الانتشار في الخلايا البطانية (EC) باستخدام خلايا البطايخ البطانية الدقيقة (HRMECs) أو الخلايا الإلكترونية الأولية المعزولة للشبكية (EC) على نطاق واسع في نماذج المختبر لدراسة تكوين الأوعية الدموية في الشبكية. ومع ذلك، فإن عزل الخلايا البطانية النقية في شبكية العين هو أمر صعب تقنيًا وقد يكون لدى الخلايا الإلكترونية للشبكية استجابات مختلفة لانتشار الخلايا البطانية المشيمية وتفاعلات الخلايا/الخلايا المختلفة. تم تطوير مقايسة المشيمية السابقة القابلة للاستنساخ للغاية كنموذج لانتشار الأوعية الدموية الدقيقة المشيمية. يتضمن هذا النموذج التفاعل بين الأوعية الدموية المشيمية (EC، الضامة، الضم) وظهارة صبغ الشبكية (RPE). يتم عزل الماوس RPE / choroid / explants Scleral واحتضانها في مستخرج الغشاء القاعدي الذي يقل عن عامل النمو (BME) (يوم 0). يتم تغيير المتوسطة كل يوم والآخر ويتم تحديد كمي براعم المشيمية في اليوم 6. يتم التقاط صور من إبتلول المشيمية الفردية مع مجهر المرحلة المقلوبة ويتم قياس مساحة تنبت باستخدام ماكرو شبه مؤتمتة المكونات في لبرنامج ImageJ المتقدمة في هذا المختبر. ويمكن استخدام هذا الاختبار التنبّعي السابق المستنسخ من الجسم الحي في تقييم المركبات للعلاج المحتمل وبحوث الأمراض الوعائية الدقيقة لتقييم المسارات المشاركة في انتشار السفن الدقيقة المشيمية باستخدام النوع البري وأنسجة الماوس المعدلة وراثياً.

Introduction

يرتبط خلل التشتت الوعائي المشيرويدي مع الضمور البقعي المرتبط بالعمر النيوفياز (AMD)1. المشيمية هي عبارة عن سرير الأوعية الدموية الدقيقة الموجود تحت ظهارة صبغ الشبكية (RPE). وقد تبين أن انخفاض تدفق الدم في المشيمية يرتبط مع تطور AMD2. العلاقة المعقدة بين بطانة الأوعية الدموية، RPE، الضامة، التحلل والخلايا الأخرى هي المسؤولة عن التوازن للأنسجة3،4،5. ولذلك، فإن وجود مقايسة مستنسخة النمذجة المشيمية microenvironment أمر بالغ الأهمية لدراسة أيه أمد neovascular.

يمكن أن تكمل فحوصات الخلايا الوعائية السابقة في الجسم وثقافات الخلايا البطانية في المختبر دراسات السلوك الجرع الوعائي الدقيق في الجسم الحي ، لاختبار الأدوية الجديدة والدراسات المتعلقة بالأمراض. الخلايا البطانية مثل الخلايا البطانية الدقيقة الأوعية الدموية البشرية (HRMECs)، الخلايا البطانية الوريدية البشرية (HUVEC)، الدماغ الحيوانية الأولية المعزولة أو ECs الشبكية وغالبا ما تستخدم في الدراسات المختبرية لأبحاث تكوين الأوعية الدموية بالعين6،7،8. وقد استخدمت على نطاق واسع HRMECs على وجه الخصوص كنموذج في المختبرية المشيمية neovascularization (CNV)9 عن طريق تقييم انتشار البطانية، والهجرة، وتشكيل أنبوبي، وتسرب الأوعية الدموية لتقييم التدخلات6،10. ومع ذلك، ECs في الثقافة محدودة كنموذج ل CNV بسبب عدم وجود تفاعلات مع أنواع الخلايا الأخرى الموجودة في المشيمية ولأن معظم EC المستخدمة في هذه المقايسات لا تنشأ من المشيمية. الماوس المشيمية ECs من الصعب عزل والحفاظ عليها في الثقافة.

ويستخدم على نطاق واسع في فحص عصابة الأبهر كنموذج لانتشار الأوعية الدموية الماكرو. وتشمل براعم الأوعية الدموية من الإكراميات الأبهرية ECs، والعمىوالضمة 11. نموذج فحص حلقة الأبهر كبيرة الأوعية الأوعية بشكل جيد12،13،14. ومع ذلك ، لديها قيود كنموذج ل neovascularization المشيمية كما الحلقات الأبهري هي الأنسجة الأوعية الدموية الماكرو تفتقر إلى البيئة المشيمية microvascular مميزة ، وبراعم من الأوعية الكبيرة قد تختلف عن براعم من شبكات الشعيرات الدموية المشاركة في علم الأمراض الأوعية الدموية الدقيقة. في الآونة الأخيرة نشرت مجموعة فحص الشبكية السابق vivo15,16. على الرغم من أنه مناسب لمرض الشبكية النوفية ، إلا أنه ليس مناسبًا للنيوفاسكولارسال المشيمية كما رأينا في AMD.

تم تطوير مقايسة التنبّه المشيمية باستخدام الماوس RPE، المشيمية، والأنسجة المسامية المُزرعة إلى أفضل نموذج لـ CNV. يمكن بسهولة أن تكون معزولة عن الأنسجة الماوس (أو أنواع أخرى) عيون17. هذا الاختبار يسمح التقييم استنساخها من الموالية والمضادة للأوعية المحتملة من المركبات الدوائية وتقييم دور مسارات محددة في neovascularization choroidal باستخدام أنسجة من الفئران المعدلة وراثيا والضوابط18. وقد تمت الإشارة إلى هذا المقايسة تنبت المشيمية في العديد من المنشورات اللاحقة9,10,18,19,20. هنا ، يتم عرض الطريقة المشاركة في استخدام هذا الفحص.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب الحيوانية الموصوفة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في مستشفى بوسطن للأطفال (ARCH البروتوكول رقم 19-04-3913R).

1- الإعداد

  1. إضافة 5 مل من البنسلين / ستريبتوميسين (10000 U/mL) و 5 مل و 10 مل من المكملات الغذائية المتاحة تجاريا إلى 500 مل من المتوسط الكلاسيكي الكامل مع المصل. Aliquot 50 مل من المتوسط في البداية.
    ملاحظة: لا ترجع أي وسيط إلى المخزون لتجنب التلوث.
  2. وضع aliquot من الوسط الكلاسيكي الكامل على الجليد.
  3. استخدام 70٪ الإيثانول لتنظيف المجهر تشريح، ملقط، ومقص.
  4. إعداد طبقين لثقافة الخلية (10 سم)، أحدهما على مجهر التشريح، واحد على الجليد؛ وضع 10 مل من المتوسط الكلاسيكي الكامل في كل طبق.

2. الخطوات التجريبية (الشكل 1)

  1. تضحية C57BL/6J الفئران حول ما بعد الولادة (ف) 20 باستخدام 75-100 ملغ / كغ الكيتامين و 7.5 -10 ملغ / كغ xylazine حقن intraperitoneally. إبقاء العينين في وسط الكلاسيكية كاملة على الجليد قبل تشريح.
  2. إزالة النسيج الضام (العضلات والأنسجة الدهنية) والعصب البصري على العين.
  3. استخدام مقص صغير لقطع محيط 0.5 مم الخلفي إلى أطراف القرنية. إزالة القرنية / قزحية مجمع، الزجاجي والعدسة.
  4. جعل شق 1 مم عمودي على حافة قطع نحو العصب البصري وقطع الفرقة الظرفية من 1 مم العرض. فصل المناطق الوسطى والمحيطية للمجمع. استخدام ملقط لتقشير قبالة شبكية العين من RPE / choroid / Sclera المعقدة.
  5. الحفاظ على الفرقة المشيمية الطرفية في وسط كلاسيكي كامل على الجليد؛ عزل العين الأخرى وتكرار عملية لقطع الفرقة الثانية.
  6. قطع الفرقة الدائرية إلى 6 ~ متساوية قطعة مربعة (~ 1 مم × 1 ملم).
    ملاحظة: لا تلمس أي حافة.
  7. ذوبان مستخلص الغشاء القاعدي (BME) في تعليمات التصنيع. إضافة 30 ميكرولتر /بئر من BME في مركز كل بئر من 24 بئرا النسيج لوحة. تأكد من أن قطرة BME تشكل قبة محدبة في الجزء السفلي من لوحة دون لمس حواف.
    ملاحظة: اذيب BME بين عشية وضحاها في الثلاجة. يجب أن يكون BME على الجليد في أي وقت بعد ذوبان الجليد.
  8. ضع الأنسجة في منتصف BME.
    ملاحظة: لا تسطيح explant choroid; عموما، والسماح لتوسيع الأنسجة داخل BME. لا يؤثر اتجاه الأنسجة (الجانبصلي صعودا أو أسفل) على النتيجة التجريبية.
  9. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة للسماح للجل ترسيخ.
  10. إضافة 500 μL من الكلاسيكية كاملة المتوسطة / جيدا.
  11. تغيير الوسط الكلاسيكي كل يومين (500 ميكرولتر). يمكن ملاحظة التنبّه المشيرويد بعد 3 أيام باستخدام المجهر.
    ملاحظة: لعلاج عامل النمو، تجويع الأنسجة لمدة 4 ساعات. تخفيف مركب تجريبي في متوسط عامل النمو المنخفض (1:200 زيادة بدلا من 1:50).

3.SWIFT-Choroid طريقة القياس الكميالمحوسبة 17 (الشكل 2)

ملاحظة: استخدمت طريقة محوسبة لقياس المساحة التي تغطيها السفن المتنامية. هناك حاجة إلى البرنامج المساعد الماكرو لبرنامج ImageJ قبل القياس الكمي (انظر معلومات تكميلية لمزيد من التفاصيل).

  1. فتح صورة تنبتة المشيمية مع ImageJ وتحقق من "صورة | نوع| 8 بت" مع مقياس رمادي.
  2. انتقل إلى "صورة | ضبط | السطوع / التباين (السيطرة / التحول / C)" وتحسين التباين.
  3. استخدام وظيفة عصا سحرية لتحديد وإزالة من الصورة النسيج المشيمية التي هي موجودة في وسط براعم (باستخدام مفتاح الاختصار "F1") (الشكل 2A, B).
    ملاحظة: تعيين معدل التسامح من عصا سحرية إلى 20-30٪.
  4. إزالة خلفية الصورة مع أدوات اختيار الحرة (الشكل 2C). انتقل إلى "صورة | ضبط | عتبة (السيطرة/التحول/T)". استخدام الدالة عتبة لتحديد براعم الأوعية الدموية الدقيقة على خلفية والأطراف (الشكل 2D).
  5. انقر على"F2"وسوف يظهر ملخص. حفظ صورة من المنطقة المحددة عن طريق النقر على "حفظ". حفظ في نفس المجلد مثل الصورة الأصلية للرجوع إليها في المستقبل.
  6. بعد قياس مجموعة من العينات، نسخ المسجلة لتحليل البيانات.
    ملاحظة: من الممكن أيضاً قياس المساحة (μm²) بواسطة"تحليل | تعيين مقياس" باستخدام الصور مع أشرطة مقياس.

النتائج

مقارنة بين النمو المشيمية التي تنبت في اليوم

نحن تشريح المشيمية مع صلبرة، جزءا لا يتجزأ من BME واستزراع لهم لمدة 6 أيام (الشكل 1). تم فحص المشيمية التي تنبت في فئران C57BL/6J من اليوم الثالث إلى اليوم السادس باستخدام المجهر وتم تحديد كمي مع SWIFT-Choroid طريقة تك?...

Discussion

وsprosay تنبت المشيمية المساعدات البحوث في AMD neovascular9,10,18,19,20. يمكن عزل explants choroid من الفئران وكذلك الفئران والبشر17،21. وتشمل explant choroid ECs، الضامة، و pericytes17. في هذا ?...

Disclosures

ولا يملك أصحاب البلاغ أي إقرارات مالية. والطريقة المحوسبة متاحة مجانا للمؤسسات الأكاديمية من خلال المؤلفين.

Acknowledgements

تم دعم العمل من قبل المنح من مؤسسة مانبي سوزوكي السكري (YT)، مستشفى بوسطن للأطفال OFD/BTREC/CTREC كلية منحة التطوير الوظيفي، بوسطن مستشفى الأطفال مؤسسة طب العيون، جائزة تجريبية BCH، BCH مانتون مركز الزمالة، ومؤسسة الزرافة الصغيرة، ومؤسسة البحوث الألمانية (DFG؛ إلى BC [CA1940/1-1])، NIH R24EY024868، EY017017، R01EY01717-13S1، EY030904-01، BCH IDDRC (1U54HD090255)، مؤسسة ماساتشوستس ليونز العين (LEHS).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AnaSed (Xylazine)AKORN59339-110-20
Basal membrane extract (BME) MatrigelBD Biosciences354230
Cell culture dishNEST70400110cm
Complete classic medium with serum and CultureBoostCell systems4Z0-500
Ethyl alcohol 200 ProofPharmco111000200use for 70%
KimwipesKimberly-Clark06-666
MicroscopeZEISSAxio Observer Z1
Penicillin/StreptomycinGIBCO1514010000 U/mL
Tissue culture plate (24-well)Olympus25-107
VetaKet CIII (Ketamine)AKORN59399-114-10

References

  1. Zarbin, M. A. Current concepts in the pathogenesis of age-related macular degeneration. Arch Ophthalmol. 122 (4), 598-614 (2004).
  2. Pemp, B., Schmetterer, L. Ocular blood flow in diabetes and age-related macular degeneration. Canadian Journal of Ophthalmology. 43 (3), 295-301 (2008).
  3. Murakami, Y., Ishikawa, K., Nakao, S., Sonoda, K. H. Innate immune response in retinal homeostasis and inflammatory disorders. Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100778 (2020).
  4. Fu, Z., et al. Dyslipidemia in retinal metabolic disorders. EMBO Molecular Medicine. 11 (10), 10473 (2019).
  5. Daruich, A., et al. Mechanisms of macular edema: Beyond the surface. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 20-68 (2018).
  6. Tomita, Y., et al. Long-Acting FGF21 Inhibits Retinal Vascular Leakage in In Vivo and In Vitro Models. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 21041188 (2020).
  7. Maisto, R., et al. ARPE-19-derived VEGF-containing exosomes promote neovascularization in HUVEC: the role of the melanocortin receptor 5. Cell Cycle. 18 (4), 413-424 (2019).
  8. Mazzoni, J., et al. The Wnt Inhibitor Apcdd1 Coordinates Vascular Remodeling and Barrier Maturation of Retinal Blood Vessels. Neuron. 96 (5), 1055-1069 (2017).
  9. Fu, Z., et al. Adiponectin Mediates Dietary Omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acid Protection Against Choroidal Neovascularization in Mice. Investigative Ophthalmology and Visual Sciences. 58 (10), 3862-3870 (2017).
  10. Gong, Y., et al. Cytochrome P450 Oxidase 2C Inhibition Adds to omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acids Protection Against Retinal and Choroidal Neovascularization. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 36 (9), 1919-1927 (2016).
  11. Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model. International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).
  12. Bellacen, K., Lewis, E. C. Aortic ring assay. Journal of Visulaized Experiments. (33), e1564 (2009).
  13. Masson, V. V., et al. Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis. Biological Procedures Online. 4, 24-31 (2002).
  14. Katakia, Y. T., et al. Ex vivo model for studying endothelial tip cells: Revisiting the classical aortic-ring assay. Microvascular Research. 128, 103939 (2020).
  15. Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
  16. Rezzola, S., et al. A novel ex vivo murine retina angiogenesis (EMRA) assay. Experimental Eye Research. 112, 51-56 (2013).
  17. Shao, Z., et al. Choroid sprouting assay: an ex vivo model of microvascular angiogenesis. PLoS One. 8 (7), 69552 (2013).
  18. Tomita, Y., et al. Free fatty acid receptor 4 activation protects against choroidal neovascularization in mice. Angiogenesis. 23, 385-394 (2020).
  19. Li, J., et al. Endothelial TWIST1 promotes pathological ocular angiogenesis. Investigative Ophthalmology and Vision Science. 55 (12), 8267-8277 (2014).
  20. Liu, C. H., et al. Endothelial microRNA-150 is an intrinsic suppressor of pathologic ocular neovascularization. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (39), 12163-12168 (2015).
  21. Zhou, Q., et al. LncEGFL7OS regulates human angiogenesis by interacting with MAX at the EGFL7/miR-126 locus. Elife. 8, 40470 (2019).
  22. Kobayashi, S., Fukuta, M., Kontani, H., Yanagita, S., Kimura, I. A quantitative assay for angiogenesis of cultured choroidal tissues in streptozotocin-diabetic Wistar and spontaneously diabetic GK rats. Japanese Journal of Pharmacology. 78 (4), 471-478 (1998).
  23. Kobayashi, S., et al. Inhibitory effects of tetrandrine and related synthetic compounds on angiogenesis in streptozotocin-diabetic rodents. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 22 (4), 360-365 (1999).
  24. Kobayashi, S., Shinohara, H., Tsuneki, H., Nagai, R., Horiuchi, S. N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine proliferated CD34(+) cells from rat choroidal explant in culture. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (9), 1382-1387 (2004).
  25. Kobayashi, S., et al. Overproduction of N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine-induced neovascularization in cultured choroidal explant of streptozotocin-diabetic rat. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (10), 1565-1571 (2004).
  26. Bergers, G., Song, S. The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance. Neuro-Oncology. 7 (4), 452-464 (2005).
  27. Browning, A. C., Stewart, E. A., Amoaku, W. M. Reply to: Phenotypic plasticity of human umbilical vein endothelial cells. British Journal of Ophthalmology. 96 (9), 1275-1276 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

162 RPE neovascularization AMD vivo

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved