Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מציג בדיקה נבטי choroid, מודל vivo לשעבר של התפשטות מיקרוווסקולרית. בדיקה זו יכולה לשמש כדי להעריך מסלולים המעורבים בהתרבות כלי מיקרו choroidal ולהעריך טיפולים תרופתיים באמצעות סוג פראי רקמת עכבר מהונדסים גנטית.

Abstract

אנגיוגנזה פתולוגית choroidal, תכונה בולטת של ניוון מקולרי הקשור לגיל, מוביל ליקוי ראייה ועיוורון. בדיקות התפשטות תאי אנדותל (EC) באמצעות תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ברשתית אנושית (HRMECs) או ECs רשתית ראשונית מבודדת נמצאים בשימוש נרחב במודלים במבחנה לחקר אנגיוגנזה ברשתית. עם זאת, בידוד טהור מורין תאי אנדותל רשתית הוא מאתגר מבחינה טכנית ECs רשתית עשוי להיות תגובות התפשטות שונות מאשר תאי אנדותל choroidal ואינטראקציות תאים / תאים שונים. מאוד לשכפל לשעבר vivo choroidal נבטים בדיקה כמודל של התפשטות כלי דם microvascular choroidal פותחה. מודל זה כולל את האינטראקציה בין כלי דם choroid (EC, מקרופאגים, pericytes) ו אפיתל פיגמנט רשתית (RPE). עכבר RPE/ choroid / מתפוצצים scleral מבודדים דגירה תמצית קרום בסיס מופחת גורם גדילה (BME) (יום 0). מדיום משתנה כל יומיים ונבט choroid הוא כימת ביום 6. התמונות של explant choroid בודדים נלקחים עם מיקרוסקופ פאזה הפוך ואת האזור נבט הוא לכמת באמצעות תוסף מאקרו אוטומטי למחצה לתוכנת ImageJ שפותחה במעבדה זו. בדיקה זו להתרבות לשכפל לשעבר vivo choroidal נבטים ניתן להשתמש כדי להעריך תרכובות לטיפול פוטנציאלי עבור מחקר מחלות מיקרוווסקולריות כדי להעריך מסלולים המעורבים התפשטות כלי מיקרו choroidal באמצעות סוג הבר רקמת עכבר מהונדסים גנטית.

Introduction

Dysregulation אנגיוגנזה Choroidal קשורה ניוון מקולרי הקשורות לגיל neovascular (AMD)1. הצ'רואיד היא מיטה מיקרוווסקולרית מתחת לאפיתל הפיגמנט הרשתית (RPE). הוכח כי זרימת דם מופחתת choroid קשורה להתקדמות של AMD2. הקשר המורכב בין אנדותל כלי דם, RPE, מקרופאגים, קרום הלב ותאים אחרים אחראי על הונוסטזיסשל הרקמה 3,4,5. לכן, בדיקה לשחזור מידול microenvironment choroidal הוא קריטי לחקר AMD neovascular.

Ex vivo angiogenesis בדיקות ותרבויות תאים אנדותל במבחנה יכול להשלים מחקרים של התנהגות microvascular ב vivo, לבדיקת תרופות חדשות למחקרים של פתוגנזה. תאים אנדותל כגון תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של רשתית אנושית (HRMECs), תאי אנדותל ורידים טבורים אנושיים (HUVEC), מוח ראשוני מבודד של בעלי חיים או ECs רשתית משמשים לעתים קרובות במחקרים במבחנה למחקר אנגיוגנזהעינית 6,7,8. HRMECs בפרט שימשו באופן נרחב כמודל של ניאו-וסקולריזציה במבחנה (CNV)9 על ידי הערכת התפשטות אנדותל, הגירה, היווצרות צינורית, דליפה כלי דם כדי להעריךהתערבויות 6,10. עם זאת, ECs בתרבות מוגבלים כמודל של CNV בגלל חוסר אינטראקציות עם סוגי תאים אחרים שנמצאו choroid ומכיוון שרוב EC בשימוש ב- assays אלה אינם מקורם choroid. עכבר choroidal ECs קשה לבודד ולשמור בתרבות.

הערכה טבעת האאורטיק נעשה שימוש נרחב כמודל של התפשטות כלי דם מאקרו. נבטים של כלי דם מאקסים של מפתחי הדם כוללים מחשבים אלקטרוניים, פריציטים ומאקרופאגים11. מרשם טבעת האאורטיק מדגים היטב אנגיוגנזה כלי גדול12,13,14. עם זאת, יש לו מגבלות כמודל של neovascularization choroidal כמו טבעות גוף העורקים הם רקמה macrovascular חסר את הסביבה המיקרו-וסקולרית choroidal אופייני, נבטים מכלי גדולים עשויים להיות שונים נבטים מרשתות נימי מעורב פתולוגיה מיקרוווסקולרית. לאחרונה פרסמה קבוצה את ההתדגם הרשתית לשעבר Vivo15,16. אמנם, הוא מתאים למחלות neovascular רשתית, זה לא מתאים עבור neovascularization choroidal כפי שניתן לראות ב- AMD.

המדגימה הנבטת choroidal באמצעות העכבר RPE, choroid, ואת הרקמה explanted scleral פותחה כדי מודל טוב יותר CNV. הרקמה יכולה בקלות להיות מבודדת מעכבר (או מינים אחרים)עיניים 17. בדיקה זו מאפשרת הערכה לשחזור של פוטנציאל פרו ואנטי אנגיוגני של תרכובות פרמקולוגיות והערכת התפקיד של מסלולים ספציפיים neovascularization choroidal באמצעות רקמה מעכברים מהונדסים גנטיתשולט 18. זה נביעה ניצנים choroidal כבר התייחס בפרסומים רביםהבאים 9,10,18,19,20. כאן, השיטה המעורבת בשימוש בהוכחה זו מוכחת.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים שתוארו אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים מוסדיים בבית החולים לילדים בבוסטון (פרוטוקול ARCH מספר 19-04-3913R).

1. הכנה

  1. הוסף 5 מ"ל של פניצילין / סטרפטומיצין (10000 U / mL) ו 5 מ"ל ו 10 מ"ל של תוספי מזון זמינים מסחרית ל 500 מ"ל של מדיום קלאסי מלא עם סרום. Aliquot 50 מ"ל של המדיום בתחילה.
    הערה: אין להחזיר כל מדיום בחזרה למניה כדי למנוע זיהום.
  2. שים aliquot של מדיום קלאסי שלם על קרח.
  3. השתמש 70% אתנול כדי לנקות את מיקרוסקופ ניתוח, מטלפים, ומספריים.
  4. הכן שתי מנות תרבות תאים (10 ס"מ), אחת על מיקרוסקופ הניתוח, אחת על קרח; לשים 10 מ"ל של מדיום קלאסי שלם בכל מנה.

2. שלבים ניסיוניים (איור 1)

  1. הקרבת עכברים C57BL/6J סביב לאחר הלידה (P) 20 באמצעות 75-100 מ"ג/ק"ג קטמין ו 7.5 -10 מ"ג / ק"ג xylazine מוזרק תוך אפית. שמור את העיניים במדיום קלאסי שלם על קרח לפני הניתוח.
  2. הסר את רקמת החיבור (רקמת שריר ושומן) ואת עצב הראייה על העין.
  3. השתמש מיקרו מספריים לחתוך היקפית 0.5 מ"מ אחורי לימבוס הקרנית. הסר את תסביך הקרנית/ הקשתית, זיבתי ואת העדשה.
  4. הפוך חתך 1 מ"מ בניצב לקצה לחתוך לכיוון עצב הראייה לחתוך רצועה היקפית של רוחב 1 מ"מ. הפרד את האזורים המרכזיים וההיפריאליים של המתחם. השתמש מלקחיים כדי לקלף את הרשתית מ RPE / choroid / תסביך סקלרה.
  5. שמור את להקת choroid ההיקפית במדיום קלאסי שלם על קרח; לבודד את העין השנייה ולחזור על התהליך כדי לחתוך רצועה שנייה.
  6. חותכים את הרצועה העגולה ל-6 ~ חלקים מרובעים שווים (~ 1 מ"מ x 1 מ"מ).
    הערה: לעולם אל תיגע בקצה כלשהו.
  7. הפשר את תמצית הממברנה הבסיסית (BME) לפי הוראת הייצור. הוסף 30 μL / גם של BME למרכז של כל באר של צלחת 24 תרבות רקמות היטב. ודא שהירידה של BME יוצרת כיפה קנית בתחתית הצלחת מבלי לגעת בקצוות.
    הערה: להפשיר את BME לילה במקרר. BME צריך להיות על הקרח בכל עת לאחר הפשרה.
  8. מניחים את הרקמה באמצע BME.
    הערה: אין לשטח את explant choroid; בדרך כלל, תן לרקמה להתרחב בתוך BME. הכיוון של הרקמה (צד scleral למעלה או למטה) אינו משפיע על התוצאה הניסיונית.
  9. הדגירה את הצלחת ב 37 °C (60 °F) במשך 10 דקות כדי לתת את הג'ל להתגבש.
  10. הוסף 500 μL של המדיום הקלאסי המלא / טוב.
  11. שנה את המדיום הקלאסי כל יומיים (500 μL). נביעה Choroid ניתן לראות לאחר 3 ימים עם מיקרוסקופ.
    הערה: לטיפול בגורם גדילה, להרעיב את הרקמה במשך 4 שעות. לדלל תרכובת ניסיון בינוני מופחת גורם גדילה (1:200 דחיפה במקום 1:50).

3.SWIFT כימות ממוחשבת 3.Choroid17 (איור 2)

הערה: נעשה שימוש בשיטה ממוחשבת למדידת האזור המכסה בכלי גידול. יש צורך בתוסף מאקרו לתוכנה ImageJ לפני כימות (ראה מידע משלים לפרטים נוספים).

  1. פתח את התמונה הנבטת choroid עם ImageJ ובדוק "| סוג| 8 סיביות" עם קנה מידה אפור.
  2. עבור אל "| התאם | בהירות/חדות (Ctrl/shift/C)" ומטב את החדות.
  3. השתמש בפונקציית מטה הקסם כדי לחלק ולהסיר מהתמונה את רקמת הצ'רויד שנמצאת במרכז הנבטים (באמצעות מקש קיצור "F1") (איור 2A,B).
    הערה: הגדר את שיעור הרגישות של שרביט הקסם ל- 20-30%.
  4. הסר את הרקע של התמונה בעזרת כלי הבחירה החינמיים (איור 2C). עבור אל "| התאם | סף (Ctrl/shift/T)". השתמש בפונקציית הסף כדי להגדיר את הנבטים המיקרו-וסקולריים על רקע הפריפריה (איור 2D).
  5. לחץ על "F2" ויופיע סיכום. שמור תמונה של האזור הנבחר על-ידי לחיצה על "שמור". שמור באותה תיקיה שבה שמור את התמונה המקורית לעיון בעתיד.
  6. לאחר מדידת קבוצת דגימות, העתק את התועד לניתוח נתונים.
    הערה: ניתן גם למדוד את האזור (μm²) על ידי "לנתח | הגדר קנה מידה" באמצעות תמונות עם סרגלי קנה מידה.

תוצאות

השוואה של צמיחה נביעה choroid ליום

ניתרנו את הצ'רויד עם סקלרה, מוטבע ב-BME ותרבתנו אותם במשך 6 ימים(איור 1). נביעה choroid בעכברים C57BL/6J מיום 3 ליום 6 נבדקו עם מיקרוסקופ וכמתו עם SWIFT-Choroid שיטת כימות אוטומטית למחצה ImageJ. במקרה מייצג, שטח הנביטה של הכורואידל (כלי השיט ...

Discussion

המדגמה הנבטת choroidal מסייעת למחקר ב AMD neovascular9,10,18,19,20. מתפוצצים Choroid ניתן לבודד מעכברים, כמו גם חולדות ובני אדם17,21. explant choroid כולל ECs, מקרופאגים, ו pericytes17. בהבחנה ?...

Disclosures

למחברים אין גילויים פיננסיים. השיטה הממוס ממוחשבת זמינה ללא תשלום למוסדות אקדמיים באמצעות המחברים.

Acknowledgements

העבודה נתמכה על ידי מענקים מהקרן הסוכרתית Manpei סוזוקי (YT), בית החולים לילדים בבוסטון OFD / BTREC / CTREC הפקולטה לפיתוח קריירה מענק, בוסטון ילדים בית החולים Ophthalmology הקרן, BCH פיילוט פרס, BCH מנטון מרכז מלגות, וקרן ג'ירפה הקטנה (ZF), קרן המחקר הגרמנית (DFG; לפנה"ס [CA1940/1-1]), NIH R24EY024868, EY017017, R01EY017-13S1, EY030904-01, BCH IDDRC (1U54HD090255), קרן עין האריות של מסצ'וסטס (LEHS).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AnaSed (Xylazine)AKORN59339-110-20
Basal membrane extract (BME) MatrigelBD Biosciences354230
Cell culture dishNEST70400110cm
Complete classic medium with serum and CultureBoostCell systems4Z0-500
Ethyl alcohol 200 ProofPharmco111000200use for 70%
KimwipesKimberly-Clark06-666
MicroscopeZEISSAxio Observer Z1
Penicillin/StreptomycinGIBCO1514010000 U/mL
Tissue culture plate (24-well)Olympus25-107
VetaKet CIII (Ketamine)AKORN59399-114-10

References

  1. Zarbin, M. A. Current concepts in the pathogenesis of age-related macular degeneration. Arch Ophthalmol. 122 (4), 598-614 (2004).
  2. Pemp, B., Schmetterer, L. Ocular blood flow in diabetes and age-related macular degeneration. Canadian Journal of Ophthalmology. 43 (3), 295-301 (2008).
  3. Murakami, Y., Ishikawa, K., Nakao, S., Sonoda, K. H. Innate immune response in retinal homeostasis and inflammatory disorders. Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100778 (2020).
  4. Fu, Z., et al. Dyslipidemia in retinal metabolic disorders. EMBO Molecular Medicine. 11 (10), 10473 (2019).
  5. Daruich, A., et al. Mechanisms of macular edema: Beyond the surface. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 20-68 (2018).
  6. Tomita, Y., et al. Long-Acting FGF21 Inhibits Retinal Vascular Leakage in In Vivo and In Vitro Models. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 21041188 (2020).
  7. Maisto, R., et al. ARPE-19-derived VEGF-containing exosomes promote neovascularization in HUVEC: the role of the melanocortin receptor 5. Cell Cycle. 18 (4), 413-424 (2019).
  8. Mazzoni, J., et al. The Wnt Inhibitor Apcdd1 Coordinates Vascular Remodeling and Barrier Maturation of Retinal Blood Vessels. Neuron. 96 (5), 1055-1069 (2017).
  9. Fu, Z., et al. Adiponectin Mediates Dietary Omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acid Protection Against Choroidal Neovascularization in Mice. Investigative Ophthalmology and Visual Sciences. 58 (10), 3862-3870 (2017).
  10. Gong, Y., et al. Cytochrome P450 Oxidase 2C Inhibition Adds to omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acids Protection Against Retinal and Choroidal Neovascularization. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 36 (9), 1919-1927 (2016).
  11. Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model. International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).
  12. Bellacen, K., Lewis, E. C. Aortic ring assay. Journal of Visulaized Experiments. (33), e1564 (2009).
  13. Masson, V. V., et al. Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis. Biological Procedures Online. 4, 24-31 (2002).
  14. Katakia, Y. T., et al. Ex vivo model for studying endothelial tip cells: Revisiting the classical aortic-ring assay. Microvascular Research. 128, 103939 (2020).
  15. Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
  16. Rezzola, S., et al. A novel ex vivo murine retina angiogenesis (EMRA) assay. Experimental Eye Research. 112, 51-56 (2013).
  17. Shao, Z., et al. Choroid sprouting assay: an ex vivo model of microvascular angiogenesis. PLoS One. 8 (7), 69552 (2013).
  18. Tomita, Y., et al. Free fatty acid receptor 4 activation protects against choroidal neovascularization in mice. Angiogenesis. 23, 385-394 (2020).
  19. Li, J., et al. Endothelial TWIST1 promotes pathological ocular angiogenesis. Investigative Ophthalmology and Vision Science. 55 (12), 8267-8277 (2014).
  20. Liu, C. H., et al. Endothelial microRNA-150 is an intrinsic suppressor of pathologic ocular neovascularization. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (39), 12163-12168 (2015).
  21. Zhou, Q., et al. LncEGFL7OS regulates human angiogenesis by interacting with MAX at the EGFL7/miR-126 locus. Elife. 8, 40470 (2019).
  22. Kobayashi, S., Fukuta, M., Kontani, H., Yanagita, S., Kimura, I. A quantitative assay for angiogenesis of cultured choroidal tissues in streptozotocin-diabetic Wistar and spontaneously diabetic GK rats. Japanese Journal of Pharmacology. 78 (4), 471-478 (1998).
  23. Kobayashi, S., et al. Inhibitory effects of tetrandrine and related synthetic compounds on angiogenesis in streptozotocin-diabetic rodents. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 22 (4), 360-365 (1999).
  24. Kobayashi, S., Shinohara, H., Tsuneki, H., Nagai, R., Horiuchi, S. N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine proliferated CD34(+) cells from rat choroidal explant in culture. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (9), 1382-1387 (2004).
  25. Kobayashi, S., et al. Overproduction of N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine-induced neovascularization in cultured choroidal explant of streptozotocin-diabetic rat. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (10), 1565-1571 (2004).
  26. Bergers, G., Song, S. The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance. Neuro-Oncology. 7 (4), 452-464 (2005).
  27. Browning, A. C., Stewart, E. A., Amoaku, W. M. Reply to: Phenotypic plasticity of human umbilical vein endothelial cells. British Journal of Ophthalmology. 96 (9), 1275-1276 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

162choroidingRPEchoroidalneovascularization choroidalAMD

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved