眼小血管血管新生のエキビボロイド発芽アッセイ

要約

このプロトコルは、微小血管増殖の元生体モデルである脈絡芽発芽アッセイを提示する。このアッセイは、脈絡膜微小血管の増殖に関与する経路を評価し、野生型および遺伝子組み換えマウス組織を用いた薬物治療を評価するために使用することができる。

要約

加齢黄斑変性症の顕著な特徴である病的脈絡膜血管新生は、視力障害および失明を引き起こしうる。ヒトのレチナル微小血管内皮細胞(HRMEC)または単離された一次性の腎細胞を用いた内皮細胞(EC)増殖アッセイは、腎血管新生を研究するために、インビトロモデルで広く使用されている。しかし、純粋なマウスのレチナル内皮細胞を単離することは技術的に困難であり、RETINAL ECは脈絡膜内皮細胞および異なる細胞/細胞相互作用とは異なる増殖応答を有する可能性がある。脈絡膜微小血管増殖のモデルとして、再現性の高いex vivo脈絡膜発芽アッセイが開発された。このモデルには、脈絡膜血管系(EC、マクロファージ、ペリサイト)と網膜色素上皮(RPE)の相互作用が含まれます。マウス RPE/脈絡膜/鎖状外植体は、成長因子減少基底膜抽出物(BME)(0日目)で単離され、インキュベートされる。培地は1日おきに変化し、6日目に脈絡芽が定量される。個々のチョロイド外植の画像は反転した位相顕微鏡で撮影され、発芽領域は、本研究室で開発されたImageJソフトウェアへの半自動マクロプラグインを使用して定量化されます。この再現性ex vivo脈絡膜発芽アッセイは、潜在的な治療のための化合物を評価し、微小血管疾患研究のために、野生型および遺伝子組み換えマウス組織を用いた脈絡膜微小血管増殖に関与する経路を評価するために使用することができる。

概要

脈絡膜血管新生調節異常は、新血管加齢黄斑変性症(AMD)1と関連している。脈絡膜は、網膜色素上皮(RPE)の下に存在する微小血管床である。脈絡膜における血流の減少は^、AMD2の進行と関連することが示されている。血管内皮、RPE、マクロファージ、包皮細胞および他の細胞との間の複雑な関係は^{、組織3、4、5}の恒常性を担^う。従って、再生可能なアッセイは、新血管AMDの研究に重要な脈絡膜微小環境をモデル化する。

Ex vivo血管新生アッセイおよびインビトロ内皮細胞培養は、生体内の微小血管挙動の研究、新薬の試験、および病原性の研究を補完することができる。ヒトの眼内小血管内皮細胞(HRMEC)、ヒトアンビリカル静脈内皮細胞(HUVEC)、単離された原発性動物の脳または眼内脳の脳などの内皮細胞は、眼血管新生研究^6、7、8の体外研究でしばしば使用される。特にHRMECは、内皮増殖、移動、管形成、および血管漏れを評価することによってインビトロ脈絡膜新血管新生(CNV)9のモデルとして広く使用され、介入を評価する^6,10。しかし、培養中のECは、脈絡膜に見られる他の細胞型との相互作用が欠如し、これらのアッセイで使用されるほとんどのECが脈絡膜に由来しないため、CNVのモデルとして制限されています。マウス脈絡膜電子株は培養中に分離し維持することが困難である。

大動脈環アッセイは、マクロ血管増殖のモデルとして広く用いられている。大動脈外植植物からの血管芽は、IC、ペリサイトおよびマクロファージ¹¹を含む。大動脈環アッセイは、大血管血管新生ウェル^{12、13、14を}モデル化する。しかし、大動脈環としての脈絡膜新血管化のモデルとしての限界があり、特徴的な脈絡膜微小血管環境を欠いた大血管組織であり、大血管からの芽は微小血管病理に関与する毛細血管ネットワークとは異なる可能性がある。最近、グループは、元生体のレティナルアッセイ^15、16を発表しました。しかし、それは、疾患性新血管疾患に適しているが、それはAMDに見られるほど脈絡膜新血管化に適していない。

マウスRPE、脈絡膜、および硬化分離組織を用いた脈絡膜発芽アッセイは、より良いモデルCNVのために開発された。組織はマウス(または他の種)の目¹⁷から容易に単離することができる。このアッセイは、薬理学的化合物のプロおよび抗血管新生電位の再現性評価及び遺伝子組換えマウスおよび対照¹⁸からの組織を用いた脈絡膜新生血管形成における特定の経路の役割の評価を可能にする。この脈絡膜発芽アッセイは、その後の多くの出版物^{9、10、18、19、20}で参照されています。ここでは、このアッセイの使用に関与する方法が示される。

プロトコル

記載されているすべての動物実験は、ボストン小児病院の施設動物ケアおよび使用委員会(ARCHプロトコル番号19-04-3913R)によって承認されました。

1. 準備

1. ペニシリン/ストレプトマイシン(10000 U/mL)5 mLと5mLと10mLの市販サプリメントを、完全な古典的な培地の500 mLに血清で加えます。初期の培地のアリコート50mL。
   注:汚染を避けるために、在庫に媒体を戻さないようにしてください。
2. 氷の上に完全な古典的な媒体のアリコートを置きます。
3. 70%エタノールを使用して、解剖顕微鏡、鉗子、ハサミを洗浄してください。
4. 解剖顕微鏡に1つ、氷の上に1つ、2つの細胞培養皿(10 cm)を準備します。各皿に完全な古典的な媒体の10 mLを入れてください。

2. 実験ステップ (図 1)

1. 75-100 mg/kgケタミンを使用した出生後(P)20の周りのC57BL/6Jマウスを犠牲にし、7.5-10 mg/kgキシラジンを腹腔内注射する。解剖する前に氷の上に完全な古典的な媒体で目を保ちます。
2. 結合組織(筋肉と脂肪組織)と眼の視神経を取り除きます。
3. マイクロハサミを使用して角膜のリンブに0.5mm後部を円周的に切断します。角膜/虹彩複合体、ガラス状、レンズを取り除きます。
4. 1mm切開を視神経に向かって切り取りエッジに垂直にし、幅1mmの円周バンドを切断します。複合体の中央領域と周辺領域を分離します。鉗子を使用して、RPE/脈絡/強膜複合体からレチナを剥がします。
5. 氷の上に完全な古典的な媒体で末梢脈絡膜バンドを保ちます。もう一方の目を分離し、2番目のバンドを切断するプロセスを繰り返します。
6. 円形のバンドを6~等しい正方形(〜1mm×1mm)に切ります。
   注意:どのエッジにも触れないでください。
7. 製造指図ごとに基底膜抽出物(BME)を解凍します。BMEの30 μL/wellを24ウェル組織培養プレートの各ウェルの中央に加えます。BMEの液滴が、エッジに触れることなくプレートの底部に凸型ドームを形成していることを確認してください。
   注:冷蔵庫で一晩BMEを解凍してください。BMEは解凍後いつでも氷の上にあるべきです。
8. BMEの真ん中に組織を置きます。
   注意:脈絡膜の外植を平らにしないでください。一般に、組織をBME内で拡大させる。組織の向き(強膜側の上下)は、実験結果に影響を与えません。
9. 37°Cでプレートを10分間インキュベートし、ゲルを固化させます。
10. 完全な古典的な媒体/井戸の500 μLを加える。
11. クラシックメディアを1日おきに変更します(500 μL)。脈絡芽は顕微鏡で3日後に観察することができる。
    注:成長因子治療のために、4時間組織を飢えます。増殖因子還元培地で試験化合物を希釈する(1:50の代わりに1:200ブースト)。

3.SWIFT-コロイドコンピュータ化定量方法¹⁷ (図2)

注:成長する船舶がカバーする面積を測定するためのコンピュータ化された方法が使用されました。ImageJ ソフトウェアへのマクロプラグインは、定量化の前に必要です (詳細については 補足情報 を参照してください)。

1. イメージJでチョロイドの発芽画像を開き、「画像|タイプ|グレースケールの 8 ビット "
2. 「 イメージ |に移動する|を調整する明るさ/コントラスト(Ctrl/シフト/C)を使用し、コントラストを最適化します。
3. 魔法の杖機能を使用して、新芽の中心に存在する脈絡膜組織を画像から外し、(ショートカットキーを使用してF1")(図2A,B)を使用します。
   注:魔法の杖の許容率を20〜30%に設定します。
4. 自由選択ツール (図 2C)で画像の背景を削除します。「 イメージ |に移動する|を調整するしきい値 (Ctrl/シフト/T)"。閾値関数を使用して、背景および周辺に対する微小血管芽を定義する(図2D)。
5. [F2]をクリックすると、概要が表示されます。[保存] をクリックして、選択した領域の画像を保存します。今後の参照のために、元の画像と同じフォルダに保存します。
6. サンプルのグループを測定した後、データ分析のために記録されたデータをコピーします。
   注:また、「分析|で面積(μm²)を測定することも可能です。スケールバー付きのイメージを使用してスケール " を設定します。

結果

1日あたりの脈絡芽成長の比較

BMEに埋め込まれた鎖骨で脈絡膜を解剖し、6日間培養した(図1)。C57BL/6Jマウスで3日目から6日目までの脈絡芽を顕微鏡で調べ、ImageJでの半自動定量法をSWIFT-チョロイドで定量した。代表的な場合、発脈芽領域(外植から伸びる血管は、外植自体を除く)は、3日目(図3A)、4日目(図3B)で1.47mm2?...

ディスカッション

脈絡膜発芽アッセイは、新血管AMD^{9、10、18、19、20}の研究^を助ける。脈絡膜外植は、マウスだけでなく、ラットおよびヒト^17、21から単離することができる。脈絡膜外植は、IC、マクロファージ、およびペリサイト^17<...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
AnaSed (Xylazine)	AKORN	59339-110-20
Basal membrane extract (BME) Matrigel	BD Biosciences	354230
Cell culture dish	NEST	704001	10cm
Complete classic medium with serum and CultureBoost	Cell systems	4Z0-500
Ethyl alcohol 200 Proof	Pharmco	111000200	use for 70%
Kimwipes	Kimberly-Clark	06-666
Microscope	ZEISS	Axio Observer Z1
Penicillin/Streptomycin	GIBCO	15140	10000 U/mL
Tissue culture plate (24-well)	Olympus	25-107
VetaKet CIII (Ketamine)	AKORN	59399-114-10