Um Ensaio Ex Vivo Choroid de Angiogênese Microvascular Ocular

Resumo

Este protocolo apresenta ensaio de brotos de choroide, um modelo ex vivo de proliferação microvascular. Este ensaio pode ser usado para avaliar caminhos envolvidos na proliferação de micro vasos choroidais e avaliar tratamentos medicamentosos usando tipo selvagem e tecido de camundongos geneticamente modificados.

Resumo

Angiogênese choroicular patológica, uma característica marcante da degeneração macular relacionada à idade, leva à deficiência visual e cegueira. Ensaios de proliferação de células endoteliais (CE) utilizando células endoteliais microvasculares da retina humana (HRMECs) ou CEs de retina primária isolada são amplamente utilizados em modelos in vitro para estudar angiogênese retinária. No entanto, isolar as células endoteliais da retina murina pura é tecnicamente desafiador e os CEs da retina podem ter respostas de proliferação diferentes das células endoteliais choroidais e diferentes interações celular/celular. Um ensaio altamente reprodutível ex vivo choroidal como modelo de proliferação microvascular choroidal foi desenvolvido. Este modelo inclui a interação entre vasculatura choroide (CE, macrófagos, pericílitos) e epitélio pigmento da retina (RPE). As explantas de RPE/coroid/scleral do mouse são isoladas e incubadas no extrato de membrana basal reduzida pelo fator de crescimento (BME) (dia 0). O meio é trocado a cada dois dias e o broto de coroide é quantificado no dia 6. As imagens da explanta choroide individual são tiradas com um microscópio de fase invertida e a área de broto é quantificada usando um plug-in macro semi-automatizado para o software ImageJ desenvolvido neste laboratório. Este ensaio reprodutível de broto ex vivo choroidal pode ser usado para avaliar compostos para tratamento potencial e para pesquisas de doenças microvasculares para avaliar caminhos envolvidos na proliferação de micro vasos choroidais usando tipo selvagem e tecido de camundongos geneticamente modificados.

Introdução

A desregulação da angiogênese choroidal está associada à degeneração macular relacionada à idade neovascular (DM)¹. O coroide é um leito microvascular presente sob o epitélio pigmento da retina (RPE). Foi demonstrado que a redução do fluxo sanguíneo no coroide está associada à progressão da AMD². A intrincada relação entre endotélio vascular, RPE, macrófagos, pericítos e outras células é responsável pela homeostase do tecido^3,4,5. Portanto, um ensaio reprodutível modelando microambiente choroidal é fundamental para o estudo da AMD neovascular.

Ensaios ex vivo angiogênese e culturas celulares endoteliais in vitro podem complementar estudos de comportamento microvascular in vivo, para testes de novas drogas e para estudos de patogênese. Células endoteliais humanas como células endoteliais microvasculares da retina humana (HRMECs), Células Endoteliais de Veia Umbilical Humana (HUVEC), cérebro animal primário isolado ou CEs da retina são frequentemente utilizadas em estudos in vitro para pesquisa de angiogênese ocular^6,7,8. Os HRMECs, em particular, têm sido amplamente utilizados como modelo de neovascularização in vitro choroidal (CNV)^9, avaliando a proliferação endotelial, migração, formação tubular e vazamento vascular para avaliar as intervenções^6,10. No entanto, as CEs na cultura são limitadas como modelo de CNV devido à falta de interações com outros tipos de células encontradas no coroide e porque a maioria dos CE utilizados nesses ensaios não se originam do coroide. Os ECs de choroidal de rato são difíceis de isolar e manter na cultura.

O ensaio do anel aórtico é amplamente utilizado como modelo de proliferação macro vascular. Brotos vasculares de explantes aórticos incluem CES, pericítes e macrófagos¹¹. O ensaio do anel aórtico modela angiogênese de vaso grande bem^12,13,14. No entanto, tem limitações como modelo de neovascularização choroidal, pois os anéis aórticos são um tecido macrovascular que não tem o ambiente microvascular choroidal característico, e brotos de vasos grandes podem diferir de brotos de redes capilares envolvidas na patologia microvascular. Recentemente, um grupo publicou um ensaio ex-vivo retinal^15,16. Embora seja adequado para doença neovascular da retina, não é tão apropriado para a neovascularização choroidal como visto na AMD.

O ensaio de broto de choroidal utilizando rpe rato, choroide e tecido escleral explantado foi desenvolvido para melhor modelar CNV. O tecido pode ser facilmente isolado dos olhos de camundongos (ou de outras espécies)¹⁷. Este ensaio permite a avaliação reprodutível do potencial pró e anti-angiogênico dos compostos farmacológicos e a avaliação do papel das vias específicas na neovascularização choroidal utilizando tecido de camundongos geneticamente modificados e controles¹⁸. Este ensaio de broto de choroidal foi referenciado em muitas publicações subsequentes^{9,10,18,19,20}. Aqui, demonstram-se o método envolvido no uso deste ensaio.

Protocolo

Todos os experimentos em animais descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Infantil de Boston (protocolo ARCH número 19-04-3913R).

1. Preparação

1. Adicione 5 mL de Penicillin/Streptomycin (10000 U/mL) e 5 mL e 10 mL de suplementos disponíveis comercialmente a 500 mL de meio clássico completo com soro. Alíquota de 50 mL do meio inicialmente.
   NOTA: Não devolva nenhum meio de volta ao estoque para evitar contaminação.
2. Coloque uma alíquota de meio clássico completo no gelo.
3. Use 70% de etanol para limpar o microscópio de dissecação, fórceps e tesouras.
4. Preparar dois pratos de cultura celular (10 cm), um no microscópio de dissecção, outro no gelo; colocar 10 mL de meio clássico completo em cada prato.

2. Etapas experimentais(Figura 1)

1. Sacrifício C57BL/6J camundongos em torno de posta natal (P) 20 usando 75-100 mg/kg de cetamina e 7,5 -10 mg/kg de xilazina injetada intraperitoneally. Mantenha os olhos em meio clássico completo no gelo antes da dissecação.
2. Remova o tecido conjuntivo (músculo e tecido gorduroso) e o nervo óptico no olho.
3. Use uma micro-tesoura para cortar circunferencialmente 0,5 mm posterior ao limbus da córnea. Remova o complexo de córnea/íris, vítreo e a lente.
4. Faça uma incisão de 1 mm perpendicular à borda de corte em direção ao nervo óptico e corte uma faixa circunferencial de 1 mm de largura. Separe as regiões centrais e periféricas do complexo. Use fórceps para descascar a retina do complexo RPE/coroid/sclera.
5. Manter a banda coroide periférica em meio clássico completo no gelo; isolar o outro olho e repetir o processo para cortar uma segunda faixa.
6. Corte a faixa circular em 6 ~peças quadradas iguais (~1 mm x 1 mm).
   NOTA: Nunca toque em nenhuma borda.
7. Descongele o extrato de membrana basal (BME) por instrução de fabricação. Adicione 30 μL/poço de BME no centro de cada poço de uma placa de cultura de tecido de 24 poços. Certifique-se de que a gota de BME forma uma cúpula convexa na parte inferior da placa sem tocar nas bordas.
   NOTA: Descongele o BME durante a noite em uma geladeira. A BME deve estar no gelo a qualquer momento depois do descongelamento.
8. Coloque o tecido no meio da BME.
   NOTA: Não achate a explanta choroide; geralmente, deixe o tecido se expandir dentro da BME. A orientação do tecido (lado escleral para cima ou para baixo) não afeta o desfecho experimental.
9. Incubar a placa a 37 °C por 10 minutos para deixar o gel solidificar.
10. Adicione 500 μL do meio/bem clássico completo.
11. Mude o meio clássico a cada dois dias (500 μL). O broto choroide pode ser observado após 3 dias com um microscópio.
    NOTA: Para o tratamento do fator de crescimento, esfuira o tecido por 4h. Diluir um composto experimental em meio reduzido por fator de crescimento (aumento de 1:200 em vez de 1:50).

3.SWIFT-Choroid método de quantificação informatizada¹⁷ (Figura 2)

NOTA: Foi utilizado um método informatizado para medir a área coberta pelo cultivo de vasos. Um plugin macro para o software ImageJ é necessário antes da quantificação (consulte Informações Suplementares para obter mais detalhes).

1. Abra a imagem choroide com ImageJ e verifique "Imagem | Digite| 8 bits" com escala cinza.
2. Vá para "Image | Ajuste | Brilho/Contraste (Ctrl/shift/C)" e otimizar o contraste.
3. Use a função varinha mágica para delinear e remover da imagem o tecido coroide que está presente no centro dos brotos (usando a tecla de atalho "F1")(Figura 2A,B).
   NOTA: Defina a taxa de tolerância da varinha mágica para 20-30%.
4. Remova o fundo da imagem com as ferramentas de seleção gratuitas(Figura 2C). Vá para "Image | Ajuste | Limiar (Ctrl/shift/T)". Use a função limiar para definir os brotos microvasculares contra o fundo e a periferia(Figura 2D).
5. Clique em "F2" e um resumo aparecerá. Salve uma imagem da área selecionada clicando em "Salvar". Salvo na mesma pasta da imagem original para referência futura.
6. Após a medida de um grupo de amostras, copie o registrado para análise de dados.
   NOTA: Também é possível medir a área (μm²) por "Analisar | Set Scale" usando imagens com barras de escala.

Resultados

Comparação do crescimento de brotos de coroides por dia

Dissecamos o coroide com esclera, embutido na BME e os cultuamos por 6 dias(Figura 1). Os brotos de coroide em camundongos C57BL/6J do dia 3 ao dia 6 foram examinados com um microscópio e quantificados com SWIFT-Choroid um método de quantificação semi-automatizado no ImageJ. Em um caso representativo, a área de broto choroidal (os vasos que se estendem da explanta, excluindo a própria...

Discussão

O ensaio de brotação de choroida ajuda a pesquisa em AMD neovascular^{9,10,18,19,20}. Explantas choroides podem ser isoladas de camundongos, bem como ratos e humanos^17,21. A explantação coroide inclui CES, macrófagos e pericítes¹⁷. Neste ensaio, a interação entre os CEs cho...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
AnaSed (Xylazine)	AKORN	59339-110-20
Basal membrane extract (BME) Matrigel	BD Biosciences	354230
Cell culture dish	NEST	704001	10cm
Complete classic medium with serum and CultureBoost	Cell systems	4Z0-500
Ethyl alcohol 200 Proof	Pharmco	111000200	use for 70%
Kimwipes	Kimberly-Clark	06-666
Microscope	ZEISS	Axio Observer Z1
Penicillin/Streptomycin	GIBCO	15140	10000 U/mL
Tissue culture plate (24-well)	Olympus	25-107
VetaKet CIII (Ketamine)	AKORN	59399-114-10