JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол представляет собой анализ прорастания хороидов, ex vivo модель микрососудистого пролиферации. Этот анализ может быть использован для оценки путей, участвующих в распространении хороидных микро-сосудов и оценки лечения наркотиков с использованием дикого типа и генетически модифицированных тканей мыши.

Аннотация

Патологический хороидный ангиогенез, характерная черта возрастной макулярной дегенерации, приводит к ухудшению зрения и слепоте. Эндотелиальные клетки (EC) пролиферации анализы с использованием человеческой сетчатки микрососудистых эндотелиальных клеток (HRMECs) или изолированных первичных ЭК сетчатки широко используются в пробирке модели для изучения ангиогенеза сетчатки. Тем не менее, изоляция чистого мурина сетчатки эндотелиальных клеток является технически сложной задачей и сетчатки ЭК может иметь различные реакции распространения, чем хороидные эндотелиальные клетки и различные клетки / клетки взаимодействия. Разработан высокоразвратный анализ хороидного прорастания ex vivo в качестве модели хороидного микрососудистого пролиферации. Эта модель включает в себя взаимодействие между хороидной сосудов (EC, макрофаги, перициты) и эпителия пигмента сетчатки (RPE). Мышь RPE / choroid / scleral explants изолированы и инкубируются в рост-фактор-уменьшенный экстракт базальной мембраны (BME) (день 0). Средний изменен через день и прорастание хороидов количественно на 6-й день. Изображения отдельных choroid explant взяты с перевернутым фазовым микроскопом, а область прорастания количественно оценивается с помощью полуавтоматического макро плагина к программному обеспечению ImageJ, разработанному в этой лаборатории. Это воспроизводимое ex vivo хороидного прорастания анализ может быть использован для оценки соединений для потенциального лечения и для исследования микрососудистых заболеваний для оценки путей, участвующих в распространении хороидных микро сосудов с использованием дикого типа и генетически модифицированных тканей мыши.

Введение

Дисрегуляция хороидного ангиогенеза связана с неоваскулярной возрастной макулярной дегенерацией (AMD)1. Хороид представляет если вылазки, присутствующие под эпителием пигмента сетчатки (RPE). Было показано, что снижение кровотока в хороиде связано с прогрессированием AMD2. Замысловатая связь между сосудистым эндотелием, RPE, макрофагами, перицитами и другими клетками отвечает за гомеостазткани 3,4,5. Таким образом, воспроизводимый анализ моделирования хороидной микроокноронности имеет решающее значение для изучения неоваскулярных AMD.

Ex vivo ангиогенез анализы и в пробирке эндотелиальных клеточных культур может дополнять исследования микрососудистого поведения in vivo, для тестирования новых препаратов и для исследований патогенеза. Эндотелиальные клетки, такие как микрососудистые эндотелиальные клетки сетчатки человека (HRMECs), человеческие пупочные вены эндотелиальных клеток (HUVEC), изолированных первичного мозга животных или сетчатки ECs часто используются в исследованиях in vitro для исследованияглазного ангиогенеза 6,7,8. HRMECs, в частности, широко используются в качестве модели в пробирке хороидной неоваскуляризации (CNV) 9 путемоценки эндотелиального пролиферации, миграции, трубчатого образования и сосудистой утечкидля оценки вмешательств 6,10. Тем не менее, ЭК в культуре ограничены в качестве модели CNV из-за отсутствия взаимодействия с другими типами клеток, найденных в хороиде и потому, что большинство EC, используемых в этих анализах, не происходят из хороида. Мышь хороидных ECs трудно изолировать и поддерживать в культуре.

Анализ аортического кольца широко используется в качестве модели макросудистого пролиферации. Сосудистые ростки из аорты explants включают ЭК, перициты и макрофаги11. Аортическое кольцо анализ моделей большого сосуда ангиогенезхорошо 12,13,14. Тем не менее, он имеет ограничения в качестве модели хороидной неоваскуляризации, как аортальные кольца макрососудистой ткани не хватает характерной хоровой микрососудистой среды, и ростки из крупных сосудов может отличаться от ростков из капиллярных сетей, участвующих в микрососудистой патологии. Недавно группа опубликовала экс-Виво сетчатки анализ15,16. Хотя, он подходит для неоваскулярных заболеваний сетчатки, это не так подходит для хороидной неоваскуляризации, как видно из AMD.

Анализ прорастания хороидов с использованием мыши RPE, хороида и склеральной эксплантационной ткани был разработан для лучшей модели CNV. Ткань может быть легко изолирована от мыши (или других видов) глаза17. Этот анализ позволяет воспроизводимую оценку про- и антиангиогенного потенциала фармакологических соединений и оценку роли конкретных путей в хороидной неоваскуляризации с использованием тканей генетически модифицированных мышей иконтроля 18. Этот анализ прорастания хороидов упоминается во многихпоследующих публикациях 9,10,18,19,20. Здесь демонстрируется метод, участвующий в использовании этого анализа.

протокол

Все описанные эксперименты на животных были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных в Бостонской детской больнице (протокол ARCH No 19-04-3913R).

1. Подготовка

  1. Добавьте 5 мл пенициллина/стрептомицина (10000 U/mL) и 5 мл и 10 мл коммерчески доступных добавок до 500 мл полной классической среды с сывороткой. Aliquot 50 мл среды на начальном этапе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не возвращайте любую среду обратно на склад, чтобы избежать загрязнения.
  2. Положите aliquot полной классической среды на льду.
  3. Используйте 70% этанола для очистки рассечения микроскопа, типсов и ножниц.
  4. Приготовить два блюда клеточной культуры (10 см), одно на микроскопе вскрытия, одно на льду; положить 10 мл полной классической среды в каждом блюде.

2. Экспериментальные шаги(рисунок 1)

  1. Пожертвование C57BL/6J мышей вокруг послеродовой (P) 20 с использованием 75-100 мг/кг кетамина и 7,5 -10 мг/кг ксилазина вводят интраперитонально. Держите глаза в полной классической среде на льду перед вскрытием.
  2. Удалить соединительной ткани (мышечной и жировой ткани) и зрительного нерва на глаз.
  3. Используйте микро-ножницы, чтобы обойти сократить 0,5 мм задней роговицы лимбуса. Удалите роговицу / ирис комплекса, стекловидного и хрусталика.
  4. Сделайте 1 мм разрез перпендикулярно краю разреза к зрительному нерву и вырезать окружной полосы 1 мм шириной. Отделить центральные и периферийные районы комплекса. Используйте типсы, чтобы очистить сетчатку от RPE / хороид / склера комплекса.
  5. Держите периферическую хороидную полосу в полной классической среде на льду; изолировать другой глаз и повторить процесс, чтобы сократить вторую полосу.
  6. Разрежьте круговую полосу на 6 квадратных частей (1 мм х 1 мм).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Никогда не прикасайтесь к краю.
  7. Оттепель базальной мембраны экстракт (BME) на инструкцию производства. Добавьте 30 йл/колодец BME в центр каждой хорошо из 24 хорошо пластины культуры тканей. Убедитесь, что капля BME образует выпуклый купол в нижней части пластины, не касаясь краев.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оттепель BME на ночь в холодильнике. BME должен быть на льду в любое время после оттаивания.
  8. Поместите ткань в середине BME.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не сглаживать choroid explant; как правило, пусть ткани расширить в рамках BME. Ориентация ткани (склеральная сторона вверх или вниз) не влияет на экспериментальный результат.
  9. Инкубировать пластину при 37 градусов по Цельсию в течение 10 минут, чтобы гель затвердеть.
  10. Добавьте 500 йл полной классической среды/хорошо.
  11. Изменение классической среды через день (500 йЛ). Прорастание хороидов можно наблюдать через 3 дня с помощью микроскопа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для лечения фактора роста, голодать ткани в течение 4 ч. Разбавить пробное соединение в среде, уменьшенной фактором роста (1:200 повышение вместо 1:50).

3.SWIFT-хороидный компьютеризированный методколичественной оценки 17 (Рисунок 2)

ПРИМЕЧАНИЕ: Был использован компьютеризированный метод измерения площади, охватываемой растущими сосудами. Макро плагин к программному обеспечению ImageJ необходим до количественной оценки (подробнее см. Дополнительную информацию).

  1. Откройте изображение прорастания хороида с ImageJ и проверьте" Image | Тип| 8-битный" с серой шкалой.
  2. Перейти к "Image | Отрегулируйте | Яркость/контрастность (Ctrl/shift/C)" и оптимизируйте контрастность.
  3. Используйте функцию волшебной палочки, чтобы наметить и удалить из изображения хороидной ткани, которые присутствуют в центре ростков (с использованием ключа от ярлыка "F1") (Рисунок 2A,B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Установите скорость толерантности волшебной палочки до 20-30%.
  4. Удалите фон изображения с помощью бесплатных инструментов выбора(рисунок 2C). Перейти к "Image | Отрегулируйте | Порог (Ctrl/shift/T)". Используйте пороговую функцию для определения микрососудистых ростков на фоне и периферии(рисунок 2D).
  5. Нажмите "F2" и резюме появится. Сохраните изображение выбранной области, нажав кнопку"Сохранить". Сохранить в той же папке, что и исходное изображение для будущей ссылки.
  6. После того, как группа образцов измеряется, скопировать записанные для анализа данных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Также можно измерить область (м2) по"Анализу | Установить шкалу" с помощью изображений с масштабом баров.

Результаты

Сравнение роста прорастания хороидов в день

Мы вскрыли хороид склерой, встроенные в BME и культурные их в течение 6 дней(рисунок 1). Прорастание хороида у мышей C57BL/6J с 3-го дня до 6-го дня было исследовано с помощью микроскопа и количественно с помощью...

Обсуждение

Анализ прорастания хороидов помогает исследованиям в неоваскулярной AMD9,10,18,19,20. Хороидные экспланты могут быть изолированы от мышей, а также крыс илюдей 17,21. Choroid explant...

Раскрытие информации

У авторов нет финансовой отчетности. Компьютеризированный метод доступен бесплатно академическим учреждениям через авторов.

Благодарности

Работа была поддержана грантами от Manpei Suzuki Diabetic Foundation (YT), Бостонской детской больницы OFD/BTREC/CTREC Faculty Development Grant, Бостонской детской больницы Ophthalmology Foundation, BCH Pilot Award, BCH Manton Center Fellowship, и Little Giraffe Foundation (КФ), Немецкого исследовательского фонда (DFG; до н.э. (CA1940/1-1), NIH R24EY024868, EY017017, R01EY01717-13S1, EY030904-01, BCH IDDRC (1U54HD0090255), Массачусетс Lions Eye Foundation (LEHS).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
AnaSed (Xylazine)AKORN59339-110-20
Basal membrane extract (BME) MatrigelBD Biosciences354230
Cell culture dishNEST70400110cm
Complete classic medium with serum and CultureBoostCell systems4Z0-500
Ethyl alcohol 200 ProofPharmco111000200use for 70%
KimwipesKimberly-Clark06-666
MicroscopeZEISSAxio Observer Z1
Penicillin/StreptomycinGIBCO1514010000 U/mL
Tissue culture plate (24-well)Olympus25-107
VetaKet CIII (Ketamine)AKORN59399-114-10

Ссылки

  1. Zarbin, M. A. Current concepts in the pathogenesis of age-related macular degeneration. Arch Ophthalmol. 122 (4), 598-614 (2004).
  2. Pemp, B., Schmetterer, L. Ocular blood flow in diabetes and age-related macular degeneration. Canadian Journal of Ophthalmology. 43 (3), 295-301 (2008).
  3. Murakami, Y., Ishikawa, K., Nakao, S., Sonoda, K. H. Innate immune response in retinal homeostasis and inflammatory disorders. Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100778 (2020).
  4. Fu, Z., et al. Dyslipidemia in retinal metabolic disorders. EMBO Molecular Medicine. 11 (10), 10473 (2019).
  5. Daruich, A., et al. Mechanisms of macular edema: Beyond the surface. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 20-68 (2018).
  6. Tomita, Y., et al. Long-Acting FGF21 Inhibits Retinal Vascular Leakage in In Vivo and In Vitro Models. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 21041188 (2020).
  7. Maisto, R., et al. ARPE-19-derived VEGF-containing exosomes promote neovascularization in HUVEC: the role of the melanocortin receptor 5. Cell Cycle. 18 (4), 413-424 (2019).
  8. Mazzoni, J., et al. The Wnt Inhibitor Apcdd1 Coordinates Vascular Remodeling and Barrier Maturation of Retinal Blood Vessels. Neuron. 96 (5), 1055-1069 (2017).
  9. Fu, Z., et al. Adiponectin Mediates Dietary Omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acid Protection Against Choroidal Neovascularization in Mice. Investigative Ophthalmology and Visual Sciences. 58 (10), 3862-3870 (2017).
  10. Gong, Y., et al. Cytochrome P450 Oxidase 2C Inhibition Adds to omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acids Protection Against Retinal and Choroidal Neovascularization. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 36 (9), 1919-1927 (2016).
  11. Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model. International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).
  12. Bellacen, K., Lewis, E. C. Aortic ring assay. Journal of Visulaized Experiments. (33), e1564 (2009).
  13. Masson, V. V., et al. Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis. Biological Procedures Online. 4, 24-31 (2002).
  14. Katakia, Y. T., et al. Ex vivo model for studying endothelial tip cells: Revisiting the classical aortic-ring assay. Microvascular Research. 128, 103939 (2020).
  15. Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
  16. Rezzola, S., et al. A novel ex vivo murine retina angiogenesis (EMRA) assay. Experimental Eye Research. 112, 51-56 (2013).
  17. Shao, Z., et al. Choroid sprouting assay: an ex vivo model of microvascular angiogenesis. PLoS One. 8 (7), 69552 (2013).
  18. Tomita, Y., et al. Free fatty acid receptor 4 activation protects against choroidal neovascularization in mice. Angiogenesis. 23, 385-394 (2020).
  19. Li, J., et al. Endothelial TWIST1 promotes pathological ocular angiogenesis. Investigative Ophthalmology and Vision Science. 55 (12), 8267-8277 (2014).
  20. Liu, C. H., et al. Endothelial microRNA-150 is an intrinsic suppressor of pathologic ocular neovascularization. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (39), 12163-12168 (2015).
  21. Zhou, Q., et al. LncEGFL7OS regulates human angiogenesis by interacting with MAX at the EGFL7/miR-126 locus. Elife. 8, 40470 (2019).
  22. Kobayashi, S., Fukuta, M., Kontani, H., Yanagita, S., Kimura, I. A quantitative assay for angiogenesis of cultured choroidal tissues in streptozotocin-diabetic Wistar and spontaneously diabetic GK rats. Japanese Journal of Pharmacology. 78 (4), 471-478 (1998).
  23. Kobayashi, S., et al. Inhibitory effects of tetrandrine and related synthetic compounds on angiogenesis in streptozotocin-diabetic rodents. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 22 (4), 360-365 (1999).
  24. Kobayashi, S., Shinohara, H., Tsuneki, H., Nagai, R., Horiuchi, S. N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine proliferated CD34(+) cells from rat choroidal explant in culture. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (9), 1382-1387 (2004).
  25. Kobayashi, S., et al. Overproduction of N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine-induced neovascularization in cultured choroidal explant of streptozotocin-diabetic rat. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (10), 1565-1571 (2004).
  26. Bergers, G., Song, S. The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance. Neuro-Oncology. 7 (4), 452-464 (2005).
  27. Browning, A. C., Stewart, E. A., Amoaku, W. M. Reply to: Phenotypic plasticity of human umbilical vein endothelial cells. British Journal of Ophthalmology. 96 (9), 1275-1276 (2012).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

162RPEAMDex vivo

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены