Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
Этот протокол представляет собой анализ прорастания хороидов, ex vivo модель микрососудистого пролиферации. Этот анализ может быть использован для оценки путей, участвующих в распространении хороидных микро-сосудов и оценки лечения наркотиков с использованием дикого типа и генетически модифицированных тканей мыши.
Патологический хороидный ангиогенез, характерная черта возрастной макулярной дегенерации, приводит к ухудшению зрения и слепоте. Эндотелиальные клетки (EC) пролиферации анализы с использованием человеческой сетчатки микрососудистых эндотелиальных клеток (HRMECs) или изолированных первичных ЭК сетчатки широко используются в пробирке модели для изучения ангиогенеза сетчатки. Тем не менее, изоляция чистого мурина сетчатки эндотелиальных клеток является технически сложной задачей и сетчатки ЭК может иметь различные реакции распространения, чем хороидные эндотелиальные клетки и различные клетки / клетки взаимодействия. Разработан высокоразвратный анализ хороидного прорастания ex vivo в качестве модели хороидного микрососудистого пролиферации. Эта модель включает в себя взаимодействие между хороидной сосудов (EC, макрофаги, перициты) и эпителия пигмента сетчатки (RPE). Мышь RPE / choroid / scleral explants изолированы и инкубируются в рост-фактор-уменьшенный экстракт базальной мембраны (BME) (день 0). Средний изменен через день и прорастание хороидов количественно на 6-й день. Изображения отдельных choroid explant взяты с перевернутым фазовым микроскопом, а область прорастания количественно оценивается с помощью полуавтоматического макро плагина к программному обеспечению ImageJ, разработанному в этой лаборатории. Это воспроизводимое ex vivo хороидного прорастания анализ может быть использован для оценки соединений для потенциального лечения и для исследования микрососудистых заболеваний для оценки путей, участвующих в распространении хороидных микро сосудов с использованием дикого типа и генетически модифицированных тканей мыши.
Дисрегуляция хороидного ангиогенеза связана с неоваскулярной возрастной макулярной дегенерацией (AMD)1. Хороид представляет если вылазки, присутствующие под эпителием пигмента сетчатки (RPE). Было показано, что снижение кровотока в хороиде связано с прогрессированием AMD2. Замысловатая связь между сосудистым эндотелием, RPE, макрофагами, перицитами и другими клетками отвечает за гомеостазткани 3,4,5. Таким образом, воспроизводимый анализ моделирования хороидной микроокноронности имеет решающее значение для изучения неоваскулярных AMD.
Ex vivo ангиогенез анализы и в пробирке эндотелиальных клеточных культур может дополнять исследования микрососудистого поведения in vivo, для тестирования новых препаратов и для исследований патогенеза. Эндотелиальные клетки, такие как микрососудистые эндотелиальные клетки сетчатки человека (HRMECs), человеческие пупочные вены эндотелиальных клеток (HUVEC), изолированных первичного мозга животных или сетчатки ECs часто используются в исследованиях in vitro для исследованияглазного ангиогенеза 6,7,8. HRMECs, в частности, широко используются в качестве модели в пробирке хороидной неоваскуляризации (CNV) 9 путемоценки эндотелиального пролиферации, миграции, трубчатого образования и сосудистой утечкидля оценки вмешательств 6,10. Тем не менее, ЭК в культуре ограничены в качестве модели CNV из-за отсутствия взаимодействия с другими типами клеток, найденных в хороиде и потому, что большинство EC, используемых в этих анализах, не происходят из хороида. Мышь хороидных ECs трудно изолировать и поддерживать в культуре.
Анализ аортического кольца широко используется в качестве модели макросудистого пролиферации. Сосудистые ростки из аорты explants включают ЭК, перициты и макрофаги11. Аортическое кольцо анализ моделей большого сосуда ангиогенезхорошо 12,13,14. Тем не менее, он имеет ограничения в качестве модели хороидной неоваскуляризации, как аортальные кольца макрососудистой ткани не хватает характерной хоровой микрососудистой среды, и ростки из крупных сосудов может отличаться от ростков из капиллярных сетей, участвующих в микрососудистой патологии. Недавно группа опубликовала экс-Виво сетчатки анализ15,16. Хотя, он подходит для неоваскулярных заболеваний сетчатки, это не так подходит для хороидной неоваскуляризации, как видно из AMD.
Анализ прорастания хороидов с использованием мыши RPE, хороида и склеральной эксплантационной ткани был разработан для лучшей модели CNV. Ткань может быть легко изолирована от мыши (или других видов) глаза17. Этот анализ позволяет воспроизводимую оценку про- и антиангиогенного потенциала фармакологических соединений и оценку роли конкретных путей в хороидной неоваскуляризации с использованием тканей генетически модифицированных мышей иконтроля 18. Этот анализ прорастания хороидов упоминается во многихпоследующих публикациях 9,10,18,19,20. Здесь демонстрируется метод, участвующий в использовании этого анализа.
Все описанные эксперименты на животных были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных в Бостонской детской больнице (протокол ARCH No 19-04-3913R).
1. Подготовка
2. Экспериментальные шаги(рисунок 1)
3.SWIFT-хороидный компьютеризированный методколичественной оценки 17 (Рисунок 2)
ПРИМЕЧАНИЕ: Был использован компьютеризированный метод измерения площади, охватываемой растущими сосудами. Макро плагин к программному обеспечению ImageJ необходим до количественной оценки (подробнее см. Дополнительную информацию).
Сравнение роста прорастания хороидов в день
Мы вскрыли хороид склерой, встроенные в BME и культурные их в течение 6 дней(рисунок 1). Прорастание хороида у мышей C57BL/6J с 3-го дня до 6-го дня было исследовано с помощью микроскопа и количественно с помощью...
Анализ прорастания хороидов помогает исследованиям в неоваскулярной AMD9,10,18,19,20. Хороидные экспланты могут быть изолированы от мышей, а также крыс илюдей 17,21. Choroid explant...
У авторов нет финансовой отчетности. Компьютеризированный метод доступен бесплатно академическим учреждениям через авторов.
Работа была поддержана грантами от Manpei Suzuki Diabetic Foundation (YT), Бостонской детской больницы OFD/BTREC/CTREC Faculty Development Grant, Бостонской детской больницы Ophthalmology Foundation, BCH Pilot Award, BCH Manton Center Fellowship, и Little Giraffe Foundation (КФ), Немецкого исследовательского фонда (DFG; до н.э. (CA1940/1-1), NIH R24EY024868, EY017017, R01EY01717-13S1, EY030904-01, BCH IDDRC (1U54HD0090255), Массачусетс Lions Eye Foundation (LEHS).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
AnaSed (Xylazine) | AKORN | 59339-110-20 | |
Basal membrane extract (BME) Matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
Cell culture dish | NEST | 704001 | 10cm |
Complete classic medium with serum and CultureBoost | Cell systems | 4Z0-500 | |
Ethyl alcohol 200 Proof | Pharmco | 111000200 | use for 70% |
Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666 | |
Microscope | ZEISS | Axio Observer Z1 | |
Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140 | 10000 U/mL |
Tissue culture plate (24-well) | Olympus | 25-107 | |
VetaKet CIII (Ketamine) | AKORN | 59399-114-10 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены