眼部微血管血管生成前维沃胆球状芽分析

摘要

该协议提供胆瘤发芽测定，微血管增殖的外体模型。这种测定可用于评估增殖胆小血管所涉及的途径，并评估使用野生型和转基因小鼠组织的药物治疗。

摘要

病理胆瘤血管生成，年龄相关的黄斑变性的显著特征，导致视力障碍和失明。使用人类视网膜微血管内皮细胞（HRMECs）或分离原发性视网膜EC进行内皮细胞增殖检测，在体外模型中广泛使用，用于研究视网膜血管生成。然而，分离纯杂音视网膜内皮细胞在技术上具有挑战性，视网膜ECs可能有不同的增殖反应比胆状内皮细胞和不同的细胞/细胞相互作用。开发了一种高度可重复的外体胆瘤发芽测定，作为胆球微血管增殖的模型。该模型包括胆道血管（EC、巨噬细胞、心状物）和视网膜色素上皮（RPE）之间的相互作用。小鼠RPE/胆状/细胞外植在生长因子减少基膜提取物（BME）（第0天）中分离和孵育。中等每隔一天改变一次，胆瘤发芽在第6天被量化。使用倒置相显微镜拍摄单个胆瘤外植的图像，并使用本实验室开发的 ImageJ 软件半自动宏插件对发芽区域进行量化。这种可重复的外体胆瘤发芽测定可用于评估化合物的潜在治疗和微血管疾病研究，以评估使用野生型和转基因小鼠组织参与胆小血管增殖的途径。

引言

胆血管生成失调与新血管年龄相关的黄斑变性^{（AMD）1。}胆小球是视网膜色素上皮（RPE）下的微血管床。研究表明，胆瘤中血流量的减少与AMD^{2的进展有关}。血管内皮、RPE、巨噬细胞、心肺和其他细胞之间的复杂关系是^{组织3、4、5的平衡。}因此，可重复的测定建模对新血管AMD的研究至关重要。

前活体血管生成测定和体外内皮细胞培养可以补充对体内微血管行为的研究，用于测试新药和机制学研究。内皮细胞，如人类视网膜微血管内皮细胞（HRMEC），人类脐带静脉内皮细胞（HUVEC），分离的原兽脑或视网膜ECs，常用于体外研究，用于眼血管生成^{研究6，7，8。}特别是HRMEC已被广泛用作体外胆状新血管化^{（CNV）9的模型，}通过评估内皮增殖、迁移、管状形成和血管渗漏来评估^{干预6、10。}然而，由于在胆道中与其他细胞类型缺乏相互作用，并且由于这些测定中使用的大多数EC并非源自胆瘤，培养中的EC作为CNV的模型受到限制。在培养中，小鼠巧克力球状电子能难以分离和维护。

大动脉环测定被广泛用作大血管增殖的模型。来自大动脉外植的血管芽包括 ES、周食和巨噬细胞¹¹。大音环测定模型大血管发生井^{12，13，14。}然而，它作为胆囊新血管化的模型有局限性，因为大动脉环是缺乏特征的胆囊微血管环境的大血管组织，而来自大型血管的芽可能与涉及微血管病理学的毛细管网络的芽不同。最近，一个小组发表了一个前维维视网膜测定^15，16。虽然，它适用于视网膜新血管疾病，但它不像在AMD中所看到的那样适合胆状新血管化。

利用小鼠RPE、胆球和胆碱外植组织进行胆瘤发芽测定，以更好地模拟CNV。组织可以很容易地从小鼠（或其他物种）的眼睛^17分离。这种测定允许重复评估药理化合物的亲血管原位和抗血管原位，并评估特定途径在胆道新血管化中的作用，利用转基因小鼠和对控^组18。这种胆瘤发芽测定已在许多后续出版物^{9，10，18，19，20被引用}。在这里，演示了使用这种测定的方法。

研究方案

所述的所有动物实验都得到波士顿儿童医院机构动物护理和使用委员会的批准（ARCH协议号19-04-3913R）。

1. 准备

1. 加入5 mL的青霉素/链霉素（10000 U/mL）和5 mL和10 mL的商用补充剂到500 mL的完整经典介质与血清。最初为 50 mL 的介质的 Aliquot。
   注:请勿将任何介质退回库存，以免受到污染。
2. 在冰上放一完全经典介质。
3. 使用 70% 乙醇清洁解剖显微镜、钳子和剪刀。
4. 准备两个细胞培养皿（10厘米），一个在解剖显微镜上，一个在冰上;在每道菜中放入 10 mL 的完整经典介质。

2. 实验步骤 （图1）

1. 牺牲C57BL/6J小鼠周围的产后（P） 20使用75-100毫克/千克氯胺酮和7.5-10毫克/千克木氨酸注射在陷阱酮。解剖前，在冰上保持眼睛完全的经典介质。
2. 去除结缔组织（肌肉和脂肪组织）和眼睛上的视神经。
3. 使用微剪刀圆圆切 0.5 mm 后角膜边缘。去除角膜/虹膜复合物、玻璃和透镜。
4. 使切削边缘垂直于视神经的切口为 1 mm，并切割 1 mm 宽度的圆周带。将建筑群的中央和外围区域分开。使用钳子从RPE/胆状/四分层复合物中剥离视网膜。
5. 保持外设胆小球带在冰上完全经典介质;隔离另一只眼睛，并重复这个过程，以削减第二个带。
6. 将圆形带切成 6 = 相等的方形片（±1 mm x 1 mm）。
   注:切勿接触任何边缘。
7. 根据制造商的指示解冻基底膜提取物 （BME）。将 30 μL/μL/井的 BME 添加到 24 井组织培养板的每个井的中心。确保 BME 的液滴在板底部形成凸形圆顶，而不接触边缘。
   注:在冰箱中通宵解冻 BME。解冻后，BME 应随时在冰上。
8. 将组织放在 BME 的中间。
   注:不要压平胆状外植;一般来说，让组织在BME内膨胀。组织的方向（侧向上或向下）不会影响实验结果。
9. 在37°C下孵育板10分钟，让凝胶凝固。
10. 加入 500 μL 的完整经典介质/井。
11. 每隔一天更换一次经典介质（500 μL）。用显微镜观察3天后，可以观察到胆状芽。
    注:对于生长因子治疗，使组织挨饿4小时。稀释生长因子降低介质中的试验化合物（1:200 提升而不是 1:50）。

3.SWIFT-Choroid计算机化定量方法¹⁷ （图2）

注:使用计算机化方法测量生长容器覆盖的区域。在量化之前，需要 ImageJ 软件的宏插件（有关更多详细信息 ，请参阅 补充信息）。

1. 使用 ImageJ 打开 choroid 发芽图像并检查"图像|类型|8 位 "与灰度。
2. 转到"图像|调整|亮度/对比度（Ctrl/shift/C）"并优化对比度。
3. 使用魔杖功能从图像中轮廓和去除存在于芽的中心的胆状组织（使用快捷键"F1"）（图2A，B）。
   注:将魔杖的容差率设置为 20-30%。
4. 使用自由选择工具移除图像的背景（图 2C）。转到"图像|调整|阈值 （Ctrl/shift/T）"。使用阈值函数在背景和外围定义微血管芽（图 2D）。
5. 单击"F2"，将显示摘要。单击"保存"来保存所选区域的图像。保存与原始图像相同的文件夹中，供将来参考。
6. 测量一组样本后，复制记录以进行数据分析。
   注:也可以通过"分析"测量面积（μm2）|使用带比例条的图像设置比例"。

结果

每天胆小球发芽生长的比较

我们解剖了带sclera的胆小球，嵌入到BME中，并培养了6天（图1）。第3天至第6天C57BL/6J小鼠的胆瘤发芽用显微镜检查，用SWIFT-Choroid对图像J中的半自动定量方法进行量化。在一个代表性的案例中，第3天（图3A）的胆状发芽区（从外植延伸的容器，不包括外植本身）为0.38毫米^2（图3A），?...

讨论

胆瘤发芽分析辅助研究的新血管AMD9，10，18，19，20。胆龙外植可以从老鼠以及大鼠和人类^{17，21分离}。胆道外植包括ECs，巨噬细胞，和心状体^17。在此测定胆道DC与相邻细胞（如RPE细胞）之间的相互作用，有助于阐?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
AnaSed (Xylazine)	AKORN	59339-110-20
Basal membrane extract (BME) Matrigel	BD Biosciences	354230
Cell culture dish	NEST	704001	10cm
Complete classic medium with serum and CultureBoost	Cell systems	4Z0-500
Ethyl alcohol 200 Proof	Pharmco	111000200	use for 70%
Kimwipes	Kimberly-Clark	06-666
Microscope	ZEISS	Axio Observer Z1
Penicillin/Streptomycin	GIBCO	15140	10000 U/mL
Tissue culture plate (24-well)	Olympus	25-107
VetaKet CIII (Ketamine)	AKORN	59399-114-10