JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, mikrovasküler proliferasyonun ex vivo modeli olan koroid filizlenme testini sunar. Bu tsay koroidal mikro damarlar çoğalan dahil yolları değerlendirmek ve yabani tip ve genetiği değiştirilmiş fare dokusu kullanarak ilaç tedavileri değerlendirmek için kullanılabilir.

Özet

Yaşa bağlı makula dejenerasyonunun belirgin bir özelliği olan patolojik koroidal anjiyogenez görme bozukluğu ve körlüğe yol açar. İnsan retinal mikrovasküler endotel hücreleri (HRMECs) veya izole primer retinal EC'ler kullanılarak yapılan endotel hücresi (EC) proliferasyon tahlilleri retinal anjiyogenezi incelemek için in vitro modellerde yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak, saf minrik retinal endotel hücrelerini izole etmek teknik olarak zordur ve retinal eC'ler koroidal endotel hücreleri ve farklı hücre/hücre etkileşimlerinden farklı proliferasyon yanıtlarına sahip olabilir. Koroidal mikrovasküler proliferasyon modeli olarak son derece tekrarlanabilir ex vivo koroidal filizlenme tayini geliştirilmiştir. Bu model koroid vaskülatür (EC, makrofajlar, perisitler) ve retinal pigment epitel (RPE) arasındaki etkileşimi içerir. Fare RPE/koroid/skleral eksplorasyonizole edilir ve büyüme faktörü azaltılmış bazal membran ekstresi (BME) (gün 0) inkübe edilir. Orta her gün değiştirilir ve koroid filizlenme gün 6 sayısallaştırılır. Bireysel koroooid eksplant görüntüleri ters faz mikroskobu ile alınır ve filizlenme alanı bu laboratuvarda geliştirilen ImageJ yazılımına yarı otomatik makro eklentisi kullanılarak ölçülür. Bu tekrarlanabilir ex vivo koroidal filizlenme tsay potansiyel tedavi ve mikrovasküler hastalık araştırma yabani tip ve genetiği değiştirilmiş fare dokusu kullanarak koroidal mikro damar çoğalması ile ilgili yolları değerlendirmek için bileşikleri değerlendirmek için kullanılabilir.

Giriş

Koroidal anjiyogenez disregülasyonu neovasküler yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD)1ile ilişkilidir. Koroid retinapigment epitel (RPE) altında bulunan bir mikrovasküler yatak. Bu koroid azalmış kan akımı AMD ilerlemesi ile ilişkili olduğu gösterilmiştir2. Vasküler endotel, RPE, makrofajlar, perisitler ve diğer hücreler arasındaki karmaşık ilişki doku homeostaz sorumludur3,4,5. Bu nedenle, korooidal mikroçevre modelleme bir tekrarlanabilir tsay neovasküler AMD çalışması için önemlidir.

Ex vivo anjiyogenez testleri ve in vitro endotel hücre kültürleri, yeni ilaçların test edilmesi ve patogenez çalışmaları için in vivo mikrovasküler davranış çalışmalarını tamamlayabilir. İnsan retinal mikrovasküler endotel hücreleri gibi endotel hücreleri (HRMECs), İnsan Umbilikal Ven Endotel Hücreleri (HUVEC), izole primer hayvan beyni veya retinal ECs genellikle oküler anjiyogenez araştırma için in vitro çalışmalarda kullanılır6,7,8. Özellikle HrMECs yaygın olarak in vitro koroidal nevaskülarozizasyon bir model olarak kullanılmıştır (CNV)9 endotel proliferasyonu, göç, tübüler oluşumu ve vasküler sızıntı değerlendirilerek müdahaleler6,10. Ancak, kültürdeki AK'ler, koroidde bulunan diğer hücre tipleri ile etkileşim eksikliği nedeniyle ve bu tahlillerde kullanılan çoğu EC koroidkaynaklı olmadığından CNV modeli olarak sınırlıdır. Fare koroidal ECs izole etmek ve kültür de korumak zordur.

Aort halkası tonu yaygın makro vasküler proliferasyon modeli olarak kullanılır. Aort eksperlerinden vasküler filizler ECs, perisitler ve makrofajlar11içerir. Aort halka sıyrık modelleri büyük damar anjiyogenez iyi12,13,14. Ancak, aort halkaları karakteristik koroidal mikrovasküler ortamdan yoksun bir makrovasküler doku olarak koroidal nevasaskülarizasyon bir model olarak sınırlamalar vardır, ve büyük damarlardan filizmikrovasküler patoloji dahil kılcal ağlardan filiz farklı olabilir. Son zamanlarda bir grup bir ex-vivo retinal assay15,16yayınladı. Retinal nevasküler hastalık için uygun olmasına rağmen, AMD'de görüldüğü gibi koroidal nevasaskülarizasyon için uygun değildir.

Fare RPE kullanılarak koroidal filizlenme tayini, koroid, ve skleral ekstre doku daha iyi model CNV için geliştirilmiştir. Doku kolayca fare (veya diğer türler) gözleri17izole edilebilir. Bu teşp, farmakolojik bileşiklerin pro- ve anti-anjiojen potansiyelinin tekrarlanabilir değerlendirilmesi ve genetiği değiştirilmiş fareler ve kontrollerden doku kullanarak koroidal nekolkülarizasyonda spesifik yolların rolünün değerlendirilmesisağlar 18. Bu koroidal filizlenme tsay birçok sonrakiyayınlardareferans olmuştur 9,10,18,19,20. Burada, bu tişin kullanımında yer alan yöntem gösterilmiştir.

Protokol

Açıklanan tüm hayvan deneyleri Boston Çocuk Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır (ARCH protokol numarası 19-04-3913R).

1. Hazırlık

  1. 5 mL penisilin/Streptomisin (10000 U/mL) ve 5 mL ve 10 mL ticari olarak mevcut takviyeleri 500 mL serumlu komple klasik ortama ekleyin. Aliquot 50 mL başlangıçta orta.
    NOT: Kontaminasyonu önlemek için herhangi bir ortamı stoğa geri döndürmeyin.
  2. Buz üzerinde tam klasik orta bir aliquot koyun.
  3. Diseksiyon mikroskobu, forceps ve makas temizlemek için% 70 etanol kullanın.
  4. İki hücre kültürü yemekleri (10 cm), bir diseksiyon mikroskop, bir buz üzerinde hazırlayın; her çanak tam klasik orta 10 mL koyun.

2. Deneysel adımlar (Şekil 1)

  1. Kurban C57BL/6J fareler doğum sonrası etrafında (P) 20 75-100 mg/kg ketamin ve 7.5 -10 mg/kg ksilazin intraperitoneal enjekte. Diseksiyon dan önce gözleri buz üzerinde tam klasik ortamda tutun.
  2. Bağ dokusu (kas ve yağ dokusu) ve göz optik sinir kaldırın.
  3. Kornea limbusuna 0,5 mm arka veya çevresi kesmek için mikro makas kullanın. Kornea / iris kompleksi, vitreus ve lens çıkarın.
  4. Optik sinir doğru kesme kenarına dik bir 1 mm kesi olun ve 1 mm genişliğinde bir çevre bandı kesti. Kompleksin merkezi ve çevresel bölgelerini ayırın. RPE/koroid/sklera kompleksinden retinayı soymak için forceps kullanın.
  5. Periferik koroid bandı buz üzerinde tam klasik ortamda tutun; diğer göz izole ve ikinci bir bant kesmek için işlemi tekrarlayın.
  6. Dairesel bandı 6 ~eşit kare parçaya (~1 mm x 1 mm) kesin.
    NOT: Hiçbir kenara dokunmayın.
  7. Üretim talimatı başına bazal membran ekstresini (BME) eritin. 24 kuyu doku kültürü plakasının her kuyunun ortasına 30 μL/kuyu BME ekleyin. BME damlacık kenarlarına dokunmadan plakanın altında bir konveks kubbe oluşturduğundan emin olun.
    NOT: BME'yi bir buzdolabında bir gecede eritin. BME eritme sonra her zaman buz üzerinde olmalıdır.
  8. BME ortasına doku yerleştirin.
    NOT: Koroid eksplantDüzleştirmek etmeyin; genellikle, doku BME içinde genişletmek sağlar. Dokunun oryantasyonu (skleral tarafı yukarı veya aşağı) deneysel sonucu etkilemez.
  9. Jelkatı izin vermek için 10 dakika boyunca 37 °C'de plaka kuluçka.
  10. Tam klasik orta /kuyu 500 μL ekleyin.
  11. Klasik ortamı her gün (500 μL) değiştirin. Koroid filizlenme mikroskop ile 3 gün sonra görülebilir.
    NOT: Büyüme faktörü tedavisi için, 4 saat için doku açlıktan. Büyüme faktörü azaltılmış ortamda bir deneme bileşik seyreltmek (1:50 yerine 1:200 artırmak).

3.SWIFT-Korooid bilgisayarlı niceleme yöntemi17 (Şekil 2)

NOT: Büyüyen damarların kapsadığı alanı ölçmek için bilgisayarlı bir yöntem kullanılmıştır. ImageJ yazılımına bir makro eklentisi, nicelikselleştirmeden önce gereklidir (daha fazla ayrıntı için Ek Bilgiler'e bakın).

  1. ImageJ ile koroid filizlenen görüntüyü açın ve "Resim | Yazın| 8-bit" gri ölçekli.
  2. "Resim | | ayarlama Parlaklık/Kontrast (Ctrl/shift/C)" ve kontrastı optimize edin.
  3. Filizin merkezinde bulunan koroid dokuyu anahatlamak ve görüntüden çıkarmak için sihirli değnek işlevini kullanın (kısayol tuşu "F1")(Şekil 2A,B)kullanın.
    NOT: Sihirli değnek tolerans oranını %20-30 olarak ayarlayın.
  4. Ücretsiz seçim araçlarıyla resmin arka planını kaldırın(Şekil 2C). "Resim | | ayarlama Eşik (Ctrl/shift/T)". Mikrovasküler filizleri arka plana ve çevreye karşı tanımlamak için eşik işlevini kullanın (Şekil 2D).
  5. "F2" seçeneğini tıklayın ve bir özet görüntülenir. Seçili alanın görüntüsünü " Kaydet " düğmesine tıklayarakkaydedin. Gelecekteki başvuru için özgün resimle aynı klasöre kaydedin.
  6. Bir grup örnek ölçüldükten sonra, veri analizi için kaydedilen kopyayı kopyalayın.
    NOT: Alanı (μm²) "Analiz | Ölçekçubukları olan görüntüleri kullanarak Ölçek'i ayarlayın.

Sonuçlar

Günde korooid filizlenme artışının karşılaştırılması

Biz sklera ile koroid diseksiyon, BME gömülü ve 6 gün boyunca kültürlü(Şekil 1). C57BL/6J farelerinde 3.günden 6.güne kadar filizlenen korooit mikroskopla incelendi ve ImageJ'de yarı otomatik bir niceleme yöntemi ile SWIFT-Choroid ölçüldü. Temsili bir durumda, koroidal filizlenme alanı (ekstreğe kadar uzanan damarlar, eksplantın kendisi hariç) Gün 3'te 0,38 mm

Tartışmalar

Koroidal filizlenme tonu neovasküler AMD9,10,18,19,20araştırma yardımcıları . Koroid eksponer fareler yanı sıra sıçan ve insanlar17,21izole edilebilir. Koroid ekstreğe EC, makrofajlar ve perisitler17içerir. Bu tsurkta koroidal EC'ler ve RPE hücreleri gibi komşu hü...

Açıklamalar

Yazarların mali açıklamaları yok. Bilgisayarlı yöntem yazarlar aracılığıyla akademik kurumlara ücretsiz olarak sunulmaktadır.

Teşekkürler

Çalışma Manpei Suzuki Diyabetvakfı (YT), Boston Çocuk Hastanesi OFD/BTREC/CTREC Fakülte Kariyer Geliştirme Hibesi, Boston Çocuk Hastanesi Oftalmoloji Vakfı, BCH Pilot Ödülü, BCH Manton Center Bursu, ve Little Zaffe Foundation (ZF), Alman Araştırma Vakfı (DFG; BC [CA1940/1-1]), NIH R24EY024868, EY017017, R01EY01717-13S1, EY030904-01, BCH IDDRC (1U54HD090255), Massachusetts Lions Eye (LEH).

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
AnaSed (Xylazine)AKORN59339-110-20
Basal membrane extract (BME) MatrigelBD Biosciences354230
Cell culture dishNEST70400110cm
Complete classic medium with serum and CultureBoostCell systems4Z0-500
Ethyl alcohol 200 ProofPharmco111000200use for 70%
KimwipesKimberly-Clark06-666
MicroscopeZEISSAxio Observer Z1
Penicillin/StreptomycinGIBCO1514010000 U/mL
Tissue culture plate (24-well)Olympus25-107
VetaKet CIII (Ketamine)AKORN59399-114-10

Referanslar

  1. Zarbin, M. A. Current concepts in the pathogenesis of age-related macular degeneration. Arch Ophthalmol. 122 (4), 598-614 (2004).
  2. Pemp, B., Schmetterer, L. Ocular blood flow in diabetes and age-related macular degeneration. Canadian Journal of Ophthalmology. 43 (3), 295-301 (2008).
  3. Murakami, Y., Ishikawa, K., Nakao, S., Sonoda, K. H. Innate immune response in retinal homeostasis and inflammatory disorders. Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100778 (2020).
  4. Fu, Z., et al. Dyslipidemia in retinal metabolic disorders. EMBO Molecular Medicine. 11 (10), 10473 (2019).
  5. Daruich, A., et al. Mechanisms of macular edema: Beyond the surface. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 20-68 (2018).
  6. Tomita, Y., et al. Long-Acting FGF21 Inhibits Retinal Vascular Leakage in In Vivo and In Vitro Models. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 21041188 (2020).
  7. Maisto, R., et al. ARPE-19-derived VEGF-containing exosomes promote neovascularization in HUVEC: the role of the melanocortin receptor 5. Cell Cycle. 18 (4), 413-424 (2019).
  8. Mazzoni, J., et al. The Wnt Inhibitor Apcdd1 Coordinates Vascular Remodeling and Barrier Maturation of Retinal Blood Vessels. Neuron. 96 (5), 1055-1069 (2017).
  9. Fu, Z., et al. Adiponectin Mediates Dietary Omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acid Protection Against Choroidal Neovascularization in Mice. Investigative Ophthalmology and Visual Sciences. 58 (10), 3862-3870 (2017).
  10. Gong, Y., et al. Cytochrome P450 Oxidase 2C Inhibition Adds to omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acids Protection Against Retinal and Choroidal Neovascularization. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 36 (9), 1919-1927 (2016).
  11. Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model. International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).
  12. Bellacen, K., Lewis, E. C. Aortic ring assay. Journal of Visulaized Experiments. (33), e1564 (2009).
  13. Masson, V. V., et al. Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis. Biological Procedures Online. 4, 24-31 (2002).
  14. Katakia, Y. T., et al. Ex vivo model for studying endothelial tip cells: Revisiting the classical aortic-ring assay. Microvascular Research. 128, 103939 (2020).
  15. Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
  16. Rezzola, S., et al. A novel ex vivo murine retina angiogenesis (EMRA) assay. Experimental Eye Research. 112, 51-56 (2013).
  17. Shao, Z., et al. Choroid sprouting assay: an ex vivo model of microvascular angiogenesis. PLoS One. 8 (7), 69552 (2013).
  18. Tomita, Y., et al. Free fatty acid receptor 4 activation protects against choroidal neovascularization in mice. Angiogenesis. 23, 385-394 (2020).
  19. Li, J., et al. Endothelial TWIST1 promotes pathological ocular angiogenesis. Investigative Ophthalmology and Vision Science. 55 (12), 8267-8277 (2014).
  20. Liu, C. H., et al. Endothelial microRNA-150 is an intrinsic suppressor of pathologic ocular neovascularization. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (39), 12163-12168 (2015).
  21. Zhou, Q., et al. LncEGFL7OS regulates human angiogenesis by interacting with MAX at the EGFL7/miR-126 locus. Elife. 8, 40470 (2019).
  22. Kobayashi, S., Fukuta, M., Kontani, H., Yanagita, S., Kimura, I. A quantitative assay for angiogenesis of cultured choroidal tissues in streptozotocin-diabetic Wistar and spontaneously diabetic GK rats. Japanese Journal of Pharmacology. 78 (4), 471-478 (1998).
  23. Kobayashi, S., et al. Inhibitory effects of tetrandrine and related synthetic compounds on angiogenesis in streptozotocin-diabetic rodents. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 22 (4), 360-365 (1999).
  24. Kobayashi, S., Shinohara, H., Tsuneki, H., Nagai, R., Horiuchi, S. N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine proliferated CD34(+) cells from rat choroidal explant in culture. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (9), 1382-1387 (2004).
  25. Kobayashi, S., et al. Overproduction of N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine-induced neovascularization in cultured choroidal explant of streptozotocin-diabetic rat. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (10), 1565-1571 (2004).
  26. Bergers, G., Song, S. The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance. Neuro-Oncology. 7 (4), 452-464 (2005).
  27. Browning, A. C., Stewart, E. A., Amoaku, W. M. Reply to: Phenotypic plasticity of human umbilical vein endothelial cells. British Journal of Ophthalmology. 96 (9), 1275-1276 (2012).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 162koroi filizlenme tayiniendotel h creleriretinapigment epiteliRPEkoroidal anjiyogenezkoroidal neologal neologizasyonya a ba l makula dejenerasyonuAMDek vivo

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır