Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Method Article
Bu protokol, mikrovasküler proliferasyonun ex vivo modeli olan koroid filizlenme testini sunar. Bu tsay koroidal mikro damarlar çoğalan dahil yolları değerlendirmek ve yabani tip ve genetiği değiştirilmiş fare dokusu kullanarak ilaç tedavileri değerlendirmek için kullanılabilir.
Yaşa bağlı makula dejenerasyonunun belirgin bir özelliği olan patolojik koroidal anjiyogenez görme bozukluğu ve körlüğe yol açar. İnsan retinal mikrovasküler endotel hücreleri (HRMECs) veya izole primer retinal EC'ler kullanılarak yapılan endotel hücresi (EC) proliferasyon tahlilleri retinal anjiyogenezi incelemek için in vitro modellerde yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak, saf minrik retinal endotel hücrelerini izole etmek teknik olarak zordur ve retinal eC'ler koroidal endotel hücreleri ve farklı hücre/hücre etkileşimlerinden farklı proliferasyon yanıtlarına sahip olabilir. Koroidal mikrovasküler proliferasyon modeli olarak son derece tekrarlanabilir ex vivo koroidal filizlenme tayini geliştirilmiştir. Bu model koroid vaskülatür (EC, makrofajlar, perisitler) ve retinal pigment epitel (RPE) arasındaki etkileşimi içerir. Fare RPE/koroid/skleral eksplorasyonizole edilir ve büyüme faktörü azaltılmış bazal membran ekstresi (BME) (gün 0) inkübe edilir. Orta her gün değiştirilir ve koroid filizlenme gün 6 sayısallaştırılır. Bireysel koroooid eksplant görüntüleri ters faz mikroskobu ile alınır ve filizlenme alanı bu laboratuvarda geliştirilen ImageJ yazılımına yarı otomatik makro eklentisi kullanılarak ölçülür. Bu tekrarlanabilir ex vivo koroidal filizlenme tsay potansiyel tedavi ve mikrovasküler hastalık araştırma yabani tip ve genetiği değiştirilmiş fare dokusu kullanarak koroidal mikro damar çoğalması ile ilgili yolları değerlendirmek için bileşikleri değerlendirmek için kullanılabilir.
Koroidal anjiyogenez disregülasyonu neovasküler yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD)1ile ilişkilidir. Koroid retinapigment epitel (RPE) altında bulunan bir mikrovasküler yatak. Bu koroid azalmış kan akımı AMD ilerlemesi ile ilişkili olduğu gösterilmiştir2. Vasküler endotel, RPE, makrofajlar, perisitler ve diğer hücreler arasındaki karmaşık ilişki doku homeostaz sorumludur3,4,5. Bu nedenle, korooidal mikroçevre modelleme bir tekrarlanabilir tsay neovasküler AMD çalışması için önemlidir.
Ex vivo anjiyogenez testleri ve in vitro endotel hücre kültürleri, yeni ilaçların test edilmesi ve patogenez çalışmaları için in vivo mikrovasküler davranış çalışmalarını tamamlayabilir. İnsan retinal mikrovasküler endotel hücreleri gibi endotel hücreleri (HRMECs), İnsan Umbilikal Ven Endotel Hücreleri (HUVEC), izole primer hayvan beyni veya retinal ECs genellikle oküler anjiyogenez araştırma için in vitro çalışmalarda kullanılır6,7,8. Özellikle HrMECs yaygın olarak in vitro koroidal nevaskülarozizasyon bir model olarak kullanılmıştır (CNV)9 endotel proliferasyonu, göç, tübüler oluşumu ve vasküler sızıntı değerlendirilerek müdahaleler6,10. Ancak, kültürdeki AK'ler, koroidde bulunan diğer hücre tipleri ile etkileşim eksikliği nedeniyle ve bu tahlillerde kullanılan çoğu EC koroidkaynaklı olmadığından CNV modeli olarak sınırlıdır. Fare koroidal ECs izole etmek ve kültür de korumak zordur.
Aort halkası tonu yaygın makro vasküler proliferasyon modeli olarak kullanılır. Aort eksperlerinden vasküler filizler ECs, perisitler ve makrofajlar11içerir. Aort halka sıyrık modelleri büyük damar anjiyogenez iyi12,13,14. Ancak, aort halkaları karakteristik koroidal mikrovasküler ortamdan yoksun bir makrovasküler doku olarak koroidal nevasaskülarizasyon bir model olarak sınırlamalar vardır, ve büyük damarlardan filizmikrovasküler patoloji dahil kılcal ağlardan filiz farklı olabilir. Son zamanlarda bir grup bir ex-vivo retinal assay15,16yayınladı. Retinal nevasküler hastalık için uygun olmasına rağmen, AMD'de görüldüğü gibi koroidal nevasaskülarizasyon için uygun değildir.
Fare RPE kullanılarak koroidal filizlenme tayini, koroid, ve skleral ekstre doku daha iyi model CNV için geliştirilmiştir. Doku kolayca fare (veya diğer türler) gözleri17izole edilebilir. Bu teşp, farmakolojik bileşiklerin pro- ve anti-anjiojen potansiyelinin tekrarlanabilir değerlendirilmesi ve genetiği değiştirilmiş fareler ve kontrollerden doku kullanarak koroidal nekolkülarizasyonda spesifik yolların rolünün değerlendirilmesisağlar 18. Bu koroidal filizlenme tsay birçok sonrakiyayınlardareferans olmuştur 9,10,18,19,20. Burada, bu tişin kullanımında yer alan yöntem gösterilmiştir.
Açıklanan tüm hayvan deneyleri Boston Çocuk Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır (ARCH protokol numarası 19-04-3913R).
1. Hazırlık
2. Deneysel adımlar (Şekil 1)
3.SWIFT-Korooid bilgisayarlı niceleme yöntemi17 (Şekil 2)
NOT: Büyüyen damarların kapsadığı alanı ölçmek için bilgisayarlı bir yöntem kullanılmıştır. ImageJ yazılımına bir makro eklentisi, nicelikselleştirmeden önce gereklidir (daha fazla ayrıntı için Ek Bilgiler'e bakın).
Günde korooid filizlenme artışının karşılaştırılması
Biz sklera ile koroid diseksiyon, BME gömülü ve 6 gün boyunca kültürlü(Şekil 1). C57BL/6J farelerinde 3.günden 6.güne kadar filizlenen korooit mikroskopla incelendi ve ImageJ'de yarı otomatik bir niceleme yöntemi ile SWIFT-Choroid ölçüldü. Temsili bir durumda, koroidal filizlenme alanı (ekstreğe kadar uzanan damarlar, eksplantın kendisi hariç) Gün 3'te 0,38 mm
Koroidal filizlenme tonu neovasküler AMD9,10,18,19,20araştırma yardımcıları . Koroid eksponer fareler yanı sıra sıçan ve insanlar17,21izole edilebilir. Koroid ekstreğe EC, makrofajlar ve perisitler17içerir. Bu tsurkta koroidal EC'ler ve RPE hücreleri gibi komşu hü...
Yazarların mali açıklamaları yok. Bilgisayarlı yöntem yazarlar aracılığıyla akademik kurumlara ücretsiz olarak sunulmaktadır.
Çalışma Manpei Suzuki Diyabetvakfı (YT), Boston Çocuk Hastanesi OFD/BTREC/CTREC Fakülte Kariyer Geliştirme Hibesi, Boston Çocuk Hastanesi Oftalmoloji Vakfı, BCH Pilot Ödülü, BCH Manton Center Bursu, ve Little Zaffe Foundation (ZF), Alman Araştırma Vakfı (DFG; BC [CA1940/1-1]), NIH R24EY024868, EY017017, R01EY01717-13S1, EY030904-01, BCH IDDRC (1U54HD090255), Massachusetts Lions Eye (LEH).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
AnaSed (Xylazine) | AKORN | 59339-110-20 | |
Basal membrane extract (BME) Matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
Cell culture dish | NEST | 704001 | 10cm |
Complete classic medium with serum and CultureBoost | Cell systems | 4Z0-500 | |
Ethyl alcohol 200 Proof | Pharmco | 111000200 | use for 70% |
Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666 | |
Microscope | ZEISS | Axio Observer Z1 | |
Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140 | 10000 U/mL |
Tissue culture plate (24-well) | Olympus | 25-107 | |
VetaKet CIII (Ketamine) | AKORN | 59399-114-10 |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır