JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نحن نصف هنا طريقة بسيطة للتعبير، واستخراج، وتنقية IgG الإنسان المؤتلف تنصهر إلى GFP في Nicotiana benthamiana. ويمكن توسيع نطاق هذا البروتوكول لتنقية وتصور العديد من البروتينات التي تستخدم الكروماتوغرافيا العمود. وعلاوة على ذلك، فإن البروتوكول قابل للتكيف مع مختبر التدريس الشخصي والكلي الافتراضي، ويوفر الاستكشاف القائم على المشروع.

Abstract

ارتفاع الطلب على الأجسام المضادة كتدخلات علاجية لمختلف الأمراض المعدية، الأيضية، المناعة الذاتية، النيبلاستيك، وغيرها من الأمراض يخلق حاجة متزايدة في تطوير أساليب فعالة لإنتاج الأجسام المضادة المؤتلفة. اعتبارًا من عام 2019 ، كان هناك أكثر من 70 أجسامًا مضادة أحادية النسيلة وافقت عليها إدارة الأغذية والعقاقير ، وهناك إمكانات نمو هائلة. وعلى الرغم من وعدهم، فإن العوامل المقيدة للاستخدام على نطاق واسع هي تكاليف التصنيع وتعقيده. من المحتمل أن تقدم النباتات استراتيجيات تصنيع البروتين منخفضة التكلفة وآمنة وسهلة التوسع. لا يمكن للنباتات مثل Nicotiana benthamiana فقط أن تُطوى وتُجمّع بروتينات الثدييات المعقدة، بل يمكنها أيضًا إضافة تعديلات حاسمة بعد الترجمة مماثلة لتلك التي تقدمها ثقافات خلايا الثدييات. في هذا العمل، باستخدام GFP الأصلي وناديل حمض مستقر من البروتين الفلوري (GFP) منصهرة للأجسام المضادة أحادية النسيلة البشرية، كنا قادرين على تصور التعبير المضاد العابر بأكمله وعملية تنقية من N. النباتات بنثامينا. اعتمادا على الغرض من التجربة ، يمكن أن يضمن الاندماج GFP الأصلي تصورًا أسهل أثناء مرحلة التعبير في النباتات ، بينما يسمح دمج GFP المستقر بالأحماض بالتصور أثناء معالجة المصب. يمكن إجراء هذا الإجراء القابل للتحجيم ومباشر من قبل باحث واحد لإنتاج كميات مليغرام من الأجسام المضادة النقية للغاية أو بروتينات الانصهار الأجسام المضادة في غضون أيام باستخدام عدد قليل من النباتات الصغيرة فقط. ويمكن توسيع هذه التقنية إلى تصور أي نوع من عملية تنقية الأجسام المضادة وربما العديد من البروتينات الأخرى، سواء في النباتات أو غيرها من أنظمة التعبير. وعلاوة على ذلك، يمكن لهذه التقنيات أن تستفيد من التعليمات الافتراضية ويتم تنفيذها في مختبر التدريس من قبل طلاب المرحلة الجامعية الذين يمتلكون الحد الأدنى من الخبرة السابقة مع تقنيات البيولوجيا الجزيئية، وتوفير أساس لاستكشاف المشاريع القائمة مع تطبيقات في العالم الحقيقي.

Introduction

وتشير تقارير الصناعة إلى أن ثلاثة عشر من أصل العقاقير العشرين الأكثر دخلاً في الولايات المتحدة كانت بيولوجية (أدوية قائمة على البروتين)، منها تسعة أدوية مضادة. اعتبارا من عام 2019، كان هناك أكثر من 570 الأجسام المضادة (AB) العلاج في مختلف مراحل التنمية السريرية1,2,3. مبيعات AB العالمية الحالية تتجاوز 100 مليار دولار أمريكي، ومن المتوقع أن يحقق سوق العلاجية Ab (mAb) أحادية النسيلة ما يصل إلى 300 مليار دولار أمريكي بحلول عام 20251،4. مع هذا الطلب المرتفع والزيادات المتوقعة في الإيرادات ، يعمل الباحثون على تطوير طرق لإنتاج علاجات Ab على نطاق أكبر من أي وقت مضى ، مع جودة أعلى وتكاليف أقل. نظم التعبير النباتية لديها العديد من المزايا على خطوط الخلايا الثدييات التقليدية لتصنيع بأسعار معقولة وعلى نطاق واسع من العلاجات Ab5،6. إنتاج علاجات البروتين في النباتات ("pharming الجزيئية") لا يتطلب المفاعلات الحيوية باهظة الثمن أو مرافق زراعة الخلايا كما تفعل الثدييات التقليدية تقنيات زراعة الخلايا7,8. لا يمكن للنباتات أن تُسْتَمِر مسببات الأمراض البشرية، مما يقلل من التلوث المحتمل9. ويمكن استخدام كل من التعبير البروتيني النباتي العابر والمحول وراثياً كبدائل أقل تكلفة لنظم إنتاج الثدييات أو البكتيرية10. على الرغم من أن النباتات المعدلة وراثيا هي المفضلة لإنتاج المحاصيل، إنتاج البروتين المؤتلف باستخدام هذه الطريقة يمكن أن تتطلب أسابيع إلى أشهر. التقدم في التعبير العابر باستخدام ناقلات الفيروسية إما عن طريق حقنة أو فراغ الزراعية تصفية تسمح لإنتاج الصغيرة وعلى نطاق واسع، على التوالي، من البروتين المطلوب في أيام11،12،13،14. إنتاج mAbs ضد الإيبولا، حمى الضنك و، زيكا، والعديد من البروتينات المؤتلفة الأخرى، وقد تم إنتاج وتنقيت بسرعة وكفاءة باستخدام التعبير العابر في N. النباتات بنثاميانا 15،16،17،18،19. هذه الظروف تجعل التعبير النباتي العابر خيارا جذابا لتطوير علاجات Ab متعددة والأساليب التي أظهرت في هذا البروتوكول20.

وكان الجيل الأول mAbs من الاشتقاق المورين، مما أدى إلى عدم مناعة محددة عند استخدامها في التجارب البشرية21. مع مرور الوقت، تم إنتاج الشميرك، أنسانية، وفي نهاية المطاف، ABS الإنسان بالكامل لتقليل المناعة الناجمة عن علاجات Ab. للأسف، بعض هذه عبس لا تزال تسبب المُضيف المناعي بسبب الاختلافات في جليكوسيل21. وقد سمحت التطورات في هندسة النباتات لتعديل جليكلان Ab ، وهو أمر ضروري منذ استقرار Ab وظيفة يمكن أن تتأثر بشكل كبير من قبل الدولة glycosylation22. وقد سمحت التطورات الإنتاج في النظم النباتية من التعبير على مستوى عال من mAbs أنس، التي تحتوي على الجليكانات الإنسان ونتيجة لذلك الصفات البيولوجية المطلوبة من الأدوية البشرية المنتجة على نطاق واسع19،21.

بالإضافة إلى عبس المؤتلف، تم استكشاف جزيئات الانصهار Ab (Ab fusions) لأغراض مختلفة في العقود الأخيرة. يتكون الانصهار AB في كثير من الأحيان من جزء Ab أو Ab منصهر لجزيء أو بروتين ومصممة للحصول على استجابات من الخلايا المناعية23. وقد تم إنشاء هذه الجزيئات كتدخلات علاجية محتملة لعلاج الأمراض المختلفة مثل السرطان وأمراض المناعة الذاتية24,25,26,27. المجمعات المناعية المؤتلفة (RICs) هي فئة أخرى من الانصهار Ab التي تم توظيفها كمرشحين للقاح28. RICs الاستفادة من قدرة الجهاز المناعي للتعرف على مناطق Fc من الانصهار Ab وقد تم العثور على تحسين المناعية عند دمجها مع منصات لقاح أخرى29,30,31.

بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) هو بروتين الإنارة الحيوية المستمدة من قناديل البحر Aequorea فيكتوريا، الذي ينبعث الضوء الأخضر عندما متحمس من قبل الأشعة فوق البنفسجية32،33. على مر السنين، وقد توسعت استخدام GFP كعلامة بصرية للتعبير الجيني من التعبير في Escherichia القولونية إلى العديد من أنظمة التعبير البروتين، بما في ذلك N. النباتات بنثاميانا 34،35،36،37،38. وللعلامات المرئية، مثل برنامج التعليم العام، آثار كثيرة في تدريس المفاهيم العلمية وتعلمها. يصف العديد من الطلاب المبتدئين صعوبات في فهم المفاهيم العلمية عندما تكون الفكرة التي يتم تدريسها غير مرئية للعين المجردة ، مثل مفاهيم البيولوجيا الجزيئية والمجالات ذات الصلة39. وبالتالي، يمكن للعلامات البصرية، مثل برنامج العمل العالمي، أن تسهم في معالجة المعلومات المتعلقة بالعمليات العلمية ويمكن أن تساعد في تقليل الصعوبات التي يبلغ عنها الطلاب في تعلم العديد من المفاهيم العلمية.

على الرغم من أن GFP غالبا ما يستخدم كعلامة للإشارة إلى الجينات والتعبير في الجسم الحي، فمن الصعب تصور ذلك في العمليات المصب إذا كان استخدام الظروف الحمضية. هذا الظرف هو في المقام الأول لأن GFP لا يحافظ على هيكلها وفلورسنس الناتجة في انخفاض40. وغالبا ما تكون هناك حاجة إلى بيئات حمضية مؤقتة في عمليات تنقية مختلفة، مثل البروتين G، البروتين A، و بروتين L الكروماتوغرافيا، وغالبا ما تستخدم لتنقية Ab41،42،43،44. وقد استخدمت المسوخ GFP للاحتفاظ الفلوريسنس تحت الظروف الحمضية45,46.

هنا نحن وصف طريقة بسيطة للتعبير، واستخراج، وتنقية من البروتينات الانصهار IgG المؤتلف في N. النباتات بنثاميانا. أنتجنا GFP التقليدية تنصهر إلى N-هدفينوس من سلسلة ثقيلة IgG أنساء، وخلق الانصهار GFP-IgG. في الوقت نفسه ، طورنا دمج تسلسل codon المصنع الأمثل لGFP حمض مستقرة (asGFP) إلى N-terminus من سلسلة ثقيلة IgG أنس ، وخلق الانصهار asGFP - IgG. مزايا إنتاج GFP-IgG تشمل القدرة على تصور وجود البروتين المستهدف أثناء التعبير، في حين أن asGFP-IgG يسمح برؤية وجود البروتين المؤتلف ليس فقط في التعبير واستخلاص الخطوات ولكن أيضا في خطوات تنقية البروتين. يمكن تكييف هذا البروتوكول لإنتاج وتنقية وتصور مجموعة من بروتينات الانصهار GFP المنتجة في N. benthamiana وتنقيتها باستخدام تقنيات الكروماتوغرافيا التي تتطلب انخفاض في الحموضة. ويمكن أيضا أن تكون مصممة هذه العملية لكميات مختلفة من مواد ورقة. في حين أن Abs والبروتينات الانصهار الموسومة مع GFP أو asGFP لا يقصد استخدامها للعلاجات ، يمكن أن تكون هذه الأساليب مفيدة كضوابط أثناء التجارب ويمكن أيضا أن تستخدم كأداة تعليمية للبيولوجيا الجزيئية والخلوية والتكنولوجيا الحيوية ، سواء في شخص أو تقريبا.

Protocol

1. زراعة N. بنثاميانا النباتات

  1. ضع كريات الخث التربة على صينية وتصب مسلوقة سابقا، لا تزال ساخنة (~ 40-45 درجة مئوية)، والمياه على الكريات الخث للتوسع الكامل. بعد يتم توسيع الكريات بالكامل، مكان 2-3 N. بذور بنثاميانا على كل بيليه الخث باستخدام ملاقط.
  2. صب حوالي 0.5 في الماء لتغطية الجزء السفلي من علبة. تسمية علبة مع تاريخ البذر. الاستمرار في المياه الشتلات يوميا مع كميات مناسبة من الأسمدة. تركيز الأسمدة (الأغذية النباتية القابلة للذوبان في الماء لجميع الأغراض) هو عموما 2.5-2.8 غرام / لتر.
  3. غطي الصينية مع أعلى رطب عند وضعها في غرفة النمو. الحفاظ على الكريات الجفت بذر في غرفة النمو في 23-25 درجة مئوية، مع 16 ساعة photoperiod و 60٪ الرطوبة النسبية.
  4. بعد أسبوع واحد، إزالة النباتات اضافية ترك كل بيليه مع شتلة واحدة فقط.
  5. عندما تكون النباتات 2-3 أسابيع من العمر، نقل كل بيليه الخث إلى وعاء الفردية التي تحتوي على التربة مراقبة الرطوبة. هذه المظاهرة استخدمت معجزة غرو السيطرة على الرطوبة بوتينغ التربة.
  6. المياه يوميا مع 1 غرام / لتر الأسمدة. لا تترك التربة جافة تماماً النباتات جاهزة للتسلل عندما تكون 5-6 أسابيع من العمر.

2- إعداد بكتيريا الجرغتريا للتسلل

ملاحظة: يمكن الحصول على بنيات الانصهار GFP-IgG كما هو موضح في هذه الورقة31. تم الحصول على الجين asGFP والنبات الأمثل من هذه الدراسة45. يجب أن يتم الخطوات التالية بجانب ناسخ بونسن، وينبغي تطبيق التقنيات المطهرة الأساسية لتجنب التلوث.

  1. Streak A. tumefaciens EHA105 إيواء فيروس القزم الأصفر الفول (BeYDV)19 ناقلات التعبير النباتي لكل بناء (asGFP-IgG، GFP-IgG, سلسلة خفيفة) من مخزون الجلسرين على LB agar (10 غرام / لتربتون, 10 غرام / لتر NaCl, 5 استخراج الخميرة 5 ز, 15 غرام / L أجار, 50 ميكروغرام / مل kanamycin) لوحة.
  2. تنمو ليوم واحد في حاضنة 30 درجة مئوية الدائمة. عزل مستعمرة واحدة للتحقق من قبل معيار مستعمرة شاشة بروتوكول PCR.
  3. استخدام مستعمرة التحقق من كل بناء. ملء أنبوب مخروطي مع 10 مل من وسائل الاعلام LB (10 غرام / لترتبتون، 10 غرام / لتر NaCl، 5 غرام من استخراج الخميرة، 50 ميكروغرام / مل). بعد ذلك، إضافة 10 ميكرولتر من 100 ميكروغرام / مل kanamycin. إضافة 10 ميكرولتر من 2.5 ميكروغرام / مل rifampicin لمنع التلوث الإشريكية القولونية. احتضان في 30 درجة مئوية و 120-150 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها.
  4. في اليوم التالي، إذا نمت ثقافة البكتيريا الزراعية إلى600 OD = 0.6-0.9، يمكن استخدامها للتسلل. إذا كان متضخمة (OD600 > 1)، وينبغي نقل 1-2 مل إلى LB الطازجة مع المضادات الحيوية ونمت إلى ODالمطلوبة 600. اعتمادا على تركيز الثقافة الأولية، قد يستغرق يومين لنمو إلى OD600 = 0.6-0.9.
  5. مرة واحدة في ODالمناسبة 600، وضع الثقافات في جهاز طرد مركزي ، بيليه البكتيريا عن طريق الطرد المركزي في 4500 × ز لمدة 20 دقيقة ، ودرجة حرارة الغرفة (RT).
  6. افرط من كلا العينتين، ومن ثم إعادة الاعتماد على كل بيليه في 1x حاجز التسلل (10 mM 2-(N-morpholino) حمض ethanesulfonic، 10 mM كبريتات المغنيسيوم، وتعديلها إلى 5.5 مع KOH) للحصول على النهائي OD600 = 0.4. وينبغي أن يستغرق هذا حوالي 15-45 مل من العازلة التسلل، اعتمادا على كثافة الثقافة الأولية. الجمع بين وحدات التخزين على قدم المساواة من كل بناء الانصهار IgG مع بناء سلسلة الضوء للحصول على النهائي OD600 = 0.2 لكل بناء في كل أنبوب.

3. الإبرة أقل حقنة الزراعية الترشيح

  1. اتخاذ مقطع الورق تقويمها و5-6 أسابيع N. بنثاميانا النباتات من الخطوة 1. باستخدام حافة حادة مشبك ورقة، وجعل ثقب صغير في الطبقة البشرة الأولى من ورقة على سطح adaxial. تجنب ثقب كل ذلك من خلال الطريق.
    ملاحظة: الأوراق السفلية هي أسهل للتسلل، في حين أن الأوراق على الجزء العلوي من المصنع هي أصعب. عموما، والتعبير عن البروتينات المؤتلف هو أعلى في الأوراق الموجودة في وسط النبات، وهذه الأوراق أيضا الحصول على أقل نخرية.
  2. ملء حقنة 1 مل، دون إبرة المرفقة، مع حل الزراعية البكتيريا المعدة من الخطوة 2. تغطية ثقب المحرز في الخطوة السابقة مع نهاية الحقنة ودفع ببطء لحقن البكتيريا في ورقة بينما تطبيق ضغط مضاد لطيف من وراء ورقة. مشاهدة ورقة داكنة كما يتم حقن الحل دون ممارسة الكثير من الضغط على الحقنة.
  3. محاولة التسلل إلى معظم منطقة ورقة في الحد الأقصى من 3-4 مرات – تلف ورقة المفرطة قد تعوق الغلة البروتين. ورقة النبات المتسللة سوف تظهر في الغالب الظلام من وجهة النظر السفلية.
    ملاحظة: يجب أن يكون هذا الحل البكتيري كافيًا لما لا يقل عن 3-4 نباتات لكل بناء. اتوماتيف أي محلول بكتيري متبقي قبل التخلص منه.

4. تنمو ومراقبة مخترق N. benthamiana

  1. مكان النباتات تسلل مرة أخرى في غرفة النمو والاستمرار في المياه يوميا.
  2. مراقبة أوراق للكلوروز ونخر في المناطق المتسللة. مراقبة النباتات لفلوريسسين GFP (إذا كان GFP موجودًا) تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية طويل وقصير الموجة.
  3. يظهر اليوم 4-5 الفلورس الأعلى من كل من يبني GFP في الأوراق. حصاد جميع الأوراق في 4-5 نقطة في البوصة (أيام بعد التسلل) وزن مجموع المواد ورقة.
  4. استخدمه على الفور لمعالجة المصب أو تخزينه عند -80 درجة مئوية حتى يصبح جاهزًا للاستخدام.

5. استخراج البروتين

  1. الحفاظ على المخازن المؤقتة وأكواب الخلاط على الجليد أو عند 4 درجة مئوية قبل الاستخدام.
  2. إعداد 2-3 مل من الجليد الباردة استخراج العازلة (100 mM تريس-HCl، 50 mM NaCl، 2 mM EDTA، 8 مع HHCL) لكل 1 غرام من المواد النباتية. إضافة 2 mM فينيل ميثيل الفلوريومول (PMSF) من المخزون (100 mM) و 50 mM أسكوبات الصوديوم إلى مخزن الاستخراج قبل الاستخراج.
  3. ضع الأنسجة النباتية من الخطوة 4 في كوب الخلاط المبتدوج. إضافة كمية قياسها من مخزن الاستخراج المبرد إلى كوب الخلاط (كما هو مبين في الخطوة 5.2). ضع كأس الخلاط على الخلاط. خذ ورقة ما قبل القطع من البارا فيلم وتمتد على الجزء العلوي من كوب الخلاط. امزج إلى تجانس مع فواصل زمنية 20 ثانية، مع التحريك بشكل جيد بين دورات المزج حسب الحاجة.
  4. نقل المواد المخلوطة إلى القارق. يُضاف شريط التحريك ويُحرّك في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة لتعزيز ذوبان البروتين والسماح بهطول الأمطار من المواد الصلبة.
  5. ضع طبقتين من Miracloth على متنها قارص نظيفة على الجليد وسكب المقتطف من خلاله لإزالة حطام الأوراق الكبيرة. بعد أن يتم سكب كل استخراج، أضعاف Miracloth للضغط على استخراج ورقة المتبقية. يجب أن تظهر استخراج الأخضر الداكن دون الجسيمات مرئية.
  6. نقل 50 ميكرولتر من هذه العينة إلى أنبوب جديد 1.5 مل وتسمية "استخراج المجموع" لتحليلها في وقت لاحق. نقل استخراج إلى أنابيب الطرد المركزي. طرد مركزي ما تبقى من استخراج النبات في 16،000 س ز لمدة 20 دقيقة، 4 درجة مئوية ونقل الماغن إلى أنبوب مخروطي.
  7. تصفية استخراج قابل للذوبان باستخدام حقنة 50 مل ومحقنة مرشح الألياف الزجاجية (0.75 ميكرومتر).
  8. جمع 50 ميكرولتر من عينة بعد الطرد المركزي، تسمية "استخراج قابل للذوبان" لتحليلها في وقت لاحق.

6. بروتين G العمود إجراء الكروماتوغرافيا

ملاحظة: البروتوكول الموصوف هنا هو للجاذبية تدفق اللوني باستخدام بيرس بروتين G الراتنج agarose. إذا كان استخدام راتنج مختلفة، راجع تعليمات الشركة المصنعة للتعديلات. لا تدع الراتنج يجف ويمنع جميع السوائل من التصريف. اِلْصِل المأخذ حسب الحاجة.

  1. إعداد عمود البولي بروبلين الذي يحمل 20 مل من العينة.
  2. تقدير كمية الطين اللازمة اعتمادا على نوع الغلوبولين المناعي المستهدف وتقاربه مع الراتنج. عموما، 3 مل من الطين الكلي مع حجم السرير 1.5 مل كافية لتنقية عدة ملليغرام من Ab.
  3. صب بعناية المبلغ المطلوب من الطين resuspended في العمود توج. افتح منفذ العمود من أسفل العمود واسمح له باستنزفه حتى يختفي معظم المخزن المؤقت.
  4. صب على الفور 10 مل من غسل العازلة 1X PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4 مع HCl) على رأس. السماح لها استنزاف وتكرار هذه الخطوة غسل 2x.
  5. تطبيق العينة المصفاة من الخطوة 5 إلى العمود وجمع flowthrough-aliquot 50 μL من flowthrough لتحليل لاحق. حفظ بقية flowthrough في حالة AB لم ربط الراتنج.
    ملاحظة: إعادة تطبيق flowthrough إلى عمود جديد لا ينتج عادةً في عائد جيد; وبالتالي ينصح أن تبدأ مع مادة ورقة جديدة.
  6. غسل الراتنج مرتين مع 10 مل من 1X PBS للحد من الربط غير محددة. إذا رغبت في ذلك، aliquot 50 ميكرولتر من غسل كما المصارف العازلة من خلال العمود للتحقق من أن لا يتم اغص الهدف مع مخزن الغسيل.
  7. إعداد وتسمية خمسة أنابيب مع 125 ميكرولتر من العقيمة 1 م تريس-HCl في 8 pH. هذا هو لتحييد عبس في العازلة elution الحمضية لتجنب التغييرات الهيكلية المحتملة. بدلا من ذلك، إضافة 30 ميكرولتر من 2 M تريس قاعدة للحصول على عينة أقل المخفف.
    تنبيه: أثناء التهيّن، يمكن استخدام الأشعة فوق البنفسجية للتصور. هذا لا يحتاج أن يتمّ طوال المدة من ال elution. إذا كان يتم استخدام الأشعة فوق البنفسجية، تأكد من ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة لتجنب تلف العينين والجلد. لا يحتاج ضوء الأشعة فوق البنفسجية إلى أن يستخدم خلال خطوة elution.
  8. Elute من عبس عن طريق تطبيق 5 مل من عازلة elution (100 mM الجليسين، 2.5 الرقم الH مع HCl) إلى العمود وجمع 1 كسور مل لكل أنبوب المعينة من الخطوة السابقة.
  9. تجديد العمود فورا عن طريق تطبيق 20 مل من العازلة غسل، تليها 10 مل من العازلة الغسيل. تأكد من عدم ترك الراتنج في بيئة حمضية لفترة طويلة. وينبغي أن تظهر elutions الفلورسنت، وغالبا ما ينظر إلى أعلى fluorescence في elution الثاني ولكن يمكن أن تختلف من استخراج إلى استخراج.
  10. للتخزين، وغسل الراتنج مع 10 مل من 20٪ الإيثانول في برنامج تلفزيوني والسماح لها استنزاف في منتصف الطريق. خلاصة الجزء العلوي، ثم الجزء السفلي من العمود، والحفاظ على تستقيم في 4 °C.
    ملاحظة: عموما، يمكن إعادة استخدام راتنجات البروتين G تصل إلى 10 مرات دون خسارة كبيرة من الكفاءة. راجع إرشادات الشركة المصنعة للحصول على تفاصيل محددة.
  11. حدد تركيز Ab باستخدام مقياس طيفي بقياس الامتصاص عند 280 نانومتر، باستخدام حاجز elution كفراغ. تخزين الذرات في -80 درجة مئوية و aliquot 50 ميكرولتر من كل كسر إلى أنبوب منفصل لمزيد من التحليل.

7. SDS-PAGE للكشف عن الانصهار GFP-Ig

  1. إعداد كافة العينات قبل إعداد SDS-PAGE.
    1. إضافة 4 ميكرولتر من عينة العازلة (6x تقليل العازلة عينة: 3.0 مل من الجلسرين، 0.93 غرام من DTT، 1 غرام من SDS، 7 مل من 4x تريس (pH 6.8) 0.5 M، 1.2 ملغ من البروموفينول الأزرق)؛ (6x غير تقليل العازلة عينة: 3.0 مل من الجلسرين، 1 غرام من SDS، 7 مل من 4x تريس (pH 6.8) 0.5 M، 1.2 ملغ من بروموفينول الأزرق) إلى 20 ميكرولتر من كل عينة (استخراج الإجمالي، استخراج قابل للذوبان، من خلال التدفق، غسل، جميع الكسور elutions) للتحليل. تأكد من تثبيت أغطية الأنبوب بشكل آمن.
    2. علاج فقط تقليل العينات لمدة 5 دقائق في حمام الماء المغلي، ومن ثم وضع عينات لمدة 5 دقائق على الجليد. تدور عينات في microcentrifuge لمدة ~ 5 S وتحميل 20 ميكرولتر من كل عينة في ترتيب جمع في آبار هلام. تحميل 3 ميكرولتر من سلم البروتين ثنائي اللون في بئر منفصلة.
  2. تشغيل هلام SDS-PAGE في ثابت 100 V لفصل الفرقة البروتين المطلوب; يستغرق حوالي 1.5 ساعة. مراقبة سلم كمؤشر لفصل البروتين.
  3. تصور هلام تحت الأشعة فوق البنفسجية لمراقبة الفلورس GFP.
  4. إذا رغبت في ذلك، وصمة عار مع الجل مع وصمة عار Coomassie لتقييم البروتين الكلي في كل عينة. بدلا من ذلك، تنفيذ لطخة الغربية لتقييم البروتين المستهدف باستخدام ABS محددة.
    ملاحظة: يمكن تنفيذ كل من تلطيخ Coomassie ولطخة الغربية باتباع البروتوكولات القياسية47،48.

النتائج

توضح هذه الدراسة طريقة سهلة وسريعة لإنتاج البروتينات المؤتلفة وتصورها في جميع مراحل عمليات المصب. باستخدام N. benthamiana وبعد البروتوكول المقدمة، يمكن أن يتحقق إنتاج البروتين المؤتلف الموصوف هنا في أقل من أسبوع. يظهر سير العمل الكلي للتعبير النباتي، الاستخراج، والتنقية في ال?...

Discussion

ويمكن استخدام هذا البروتوكول للتحقق البصرية من أي أب المؤتلف أو البروتين المؤتلف المنتجة في N. بنثاميانا النباتات، بما في ذلك تلك التي تتطلب التعرض المؤقت للبيئات الحمضية لأغراض تنقية العمود42،43،44. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون دمج asGF...

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

نشكر ماريا بيا ديبالما على تحرير الفيديو. كما نشكر مكتب التوعية التعليمية والخدمات الطلابية في جامعة ولاية أريزونا على مساعدتهم السخية في رسوم النشر. وقد دعمت البحث لهذا البروتوكول من قبل كلية علوم الحياة، جامعة ولاية أريزونا.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
5 mL syringeanyN/A
50 mL syringeanyN/A
AgarSIGMA-ALDRICHA5306
Blender with cupsanyN/A
Bromophenol blueBio-Rad1610404
DTT (DL-Dithiothreitol)MP BIOMEDICALS219482101
EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acidSIGMA-ALDRICHE-6760
EthanolanyN/A
GlycerolG-BiosciencesBTNM-0037
GlycineSIGMA-ALDRICHG7126-500G
HCl (Hydrochloric acid)EMD MILLIPORE CORPORATIONHX0603-4
Heating blockany reputable supplierN/A
Jiffy-7 727 w/hole peat pelletsHummert International14237000
KanamycinGold Biotechnology IncK-120-100
KCl (Potassium Chloride)SIGMA-ALDRICHP9541-500G
KH2PO4 (Potassium Phosphate)J.t.baker3248-05
KOH (Potassium Hydroxide)VWRBDH0262
Magnesium sulfate heptahydrateSIGMA-ALDRICHM2773
MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid)SIGMA-ALDRICHM8250
MiraclothMillipore4 75855-1R
Moisture control potting mixMiracle-Gro755783
Na2HPO4 (Sodium Phosphate)J.t.baker3827-01
NaCl (Sodium Chloride)Santa Cruz Biotechnologysc-203274C
Nicotiana benthamiana seedsany reputable supplierN/A
PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride)G-Biosciences786-787
Polypropylene ColumnanyN/A
Precision Plus Protein Dual Color StandardsBio-Rad1610394
Protein G resinThermo Fisher Scientific20399
RifampicinGold Biotechnology IncR-120-25
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)G-BiosciencesDG093
Sodium AscorbateSIGMA-ALDRICHA7631-500G
Spectrophotometerany reputable supplierN/A
Titan3 0.75 µm glass fiber filterThermoScientific40725-GM
Tray for peat pellets with domeanyN/A
TRIS BaseJ.t.baker4109-02
Tris-HClAmrescoM108-1KG
TryptoneSIGMA-ALDRICH17221
UV lampanyN/A
Water Soluble All Purpose Plant FoodMiracle-Gro2000992
Yeast extractSIGMA-ALDRICH9182

References

  1. Lu, R. M., et al. Development of therapeutic antibodies for the treatment of diseases. Journal of Biomedical Science. 27 (1), (2020).
  2. Kaplon, H., Reichert, J. M. Antibodies to watch in 2019. mAbs. 11 (2), 219-238 (2019).
  3. The top 20 drugs by U.S. sales. FiercePharma Available from: https://www.fiercepharma.com/special-report/top-20-drugs-by-2018-u-s-sales (2018)
  4. Grilo, A. L., Mantalaris, A. The Increasingly Human and Profitable Monoclonal Antibody Market. Trends in Biotechnology. 37 (1), 9-16 (2019).
  5. Kim, M. -. Y., et al. Novel vaccination approach for dengue infection based on recombinant immune complex universal platform. Vaccine. 33 (15), 1830-1838 (2015).
  6. Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. Transgenic plants in the biopharmaceutical market. Expert Opinion on Emerging Drugs. 10 (1), 185-218 (2005).
  7. Stoger, E., Fischer, R., Moloney, M., Ma, J. K. -. C. Plant Molecular Pharming for the Treatment of Chronic and Infectious Diseases. Annual Review of Plant Biology. 65 (1), 743-768 (2014).
  8. Buyel, J. F., Fischer, R. Predictive models for transient protein expression in tobacco (Nicotiana tabacum L.) can optimize process time, yield, and downstream costs. Biotechnology and Bioengineering. 109 (10), 2575-2588 (2012).
  9. Yao, J., Weng, Y., Dickey, A., Wang, K. Y. Plants as factories for human pharmaceuticals: Applications and challenges. International Journal of Molecular Sciences. 16 (12), 28549-28565 (2015).
  10. Mor, T. S., Moon, Y. -. S., Palmer, K. E., Mason, H. S. Geminivirus vectors for high-level expression of foreign proteins in plant cells. Biotechnology and Bioengineering. 81 (4), 430-437 (2003).
  11. Hefferon, K. L. Plant virus expression vectors set the stage as production platforms for biopharmaceutical proteins. Virology. 433 (1), 1-6 (2012).
  12. Yamamoto, T., et al. Improvement of the transient expression system for production of recombinant proteins in plants. Scientific Reports. 8 (1), 4755 (2018).
  13. Zhong, G. Y., et al. Commercial production of aprotinin in transgenic maize seeds. Molecular Breeding. 5 (4), 345-356 (1999).
  14. Giddings, G., Allison, G., Brooks, D., Carter, A. Transgenic plants as factories for biopharmaceuticals. Nature Biotechnology. 18 (11), 1151-1155 (2000).
  15. Fulton, A., Lai, H., Chen, Q., Zhang, C. Purification of monoclonal antibody against Ebola GP1 protein expressed in Nicotiana benthamiana. Journal of Chromatography A. 1389, 128-132 (2015).
  16. Diamos, A., et al. A highly expressing, soluble, and stable plant-made IgG fusion carrying Zika virus envelope domain III elicits potent immunogenic responses in mice without adjuvant. Frontiers in immunology. 3140 (11), (2020).
  17. Hunter, J. G. L., et al. Evaluation of a toxoid fusion protein vaccine produced in plants to protect poultry against necrotic enteritis. PeerJ. 2019 (3), 6600 (2019).
  18. Dent, M., et al. Plant-produced anti-dengue virus monoclonal antibodies exhibit reduced antibody-dependent enhancement of infection activity. Journal of General Virology. 97 (12), 3280-3290 (2016).
  19. Diamos, A. G., et al. High Level Production of Monoclonal Antibodies Using an Optimized Plant Expression System. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 472 (2020).
  20. Olinger, G. G., et al. Delayed treatment of Ebola virus infection with plant-derived monoclonal antibodies provides protection in rhesus macaques. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), 18030-18035 (2012).
  21. Mastrangeli, R., Palinsky, W., Bierau, H. Glycoengineered antibodies: towards the next-generation of immunotherapeutics. Glycobiology. 29 (3), 199-210 (2019).
  22. Montero-Morales, L., Steinkellner, H. Advanced Plant-Based Glycan Engineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 81 (2018).
  23. Joosten, V., Lokman, C., vanden Hondel, C. A. M. J. J., Punt, P. J. The production of antibody fragments and antibody fusion proteins by yeasts and filamentous fungi. Microbial Cell Factories. 2 (1), 1-15 (2003).
  24. Müller, D. Antibody fusions with immunomodulatory proteins for cancer therapy. Pharmacology and Therapeutics. 154, 57-66 (2015).
  25. Bootz, F., Neri, D. Immunocytokines: A novel class of products for the treatment of chronic inflammation and autoimmune conditions. Drug Discovery Today. 21 (1), 180-189 (2016).
  26. Jafari, R., Zolbanin, N. M., Rafatpanah, H., Majidi, J., Kazemi, T. Fc-fusion Proteins in Therapy: An Updated View. Current Medicinal Chemistry. 24 (12), (2017).
  27. Brinkmann, U., Kontermann, R. E. The making of bispecific antibodies. mAbs. 9 (2), 182-212 (2017).
  28. Mason, H. S. Recombinant immune complexes as versatile and potent vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 12 (4), 988-989 (2016).
  29. Mason, H. S. Recombinant immune complexes as versatile and potent vaccines. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 12 (4), 988-989 (2016).
  30. Diamos, A. G., et al. Vaccine synergy with virus-like particle and immune complex platforms for delivery of human papillomavirus L2 antigen. Vaccine. 37 (1), 137-144 (2019).
  31. Diamos, A. G., et al. Codelivery of improved immune complex and virus-like particle vaccines containing Zika virus envelope domain III synergistically enhances immunogenicity. Vaccine. 38 (18), 3455-3463 (2020).
  32. Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene. 111 (2), 229-233 (1992).
  33. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  34. Palm, M., Baumstark-Khan, C., Horneck, G. Green Fluorescent Protein (GFP) Expression in Mammalian Cells After UV-Irradiation. Fundamentals for the Assessment of Risks from Environmental Radiation. , 311-316 (1999).
  35. Paemeleire, K., et al. Intercellular calcium waves in HeLa cells expressing GFP-labeled connexin 43, 32, or 26. Molecular Biology of the Cell. 11 (5), 1815-1827 (2000).
  36. Harper, B. K., Stewart, C. N. Patterns of Green Fluorescent Protein Expression in Transgenic Plants. Plant Molecular Biology Reporter. 18 (2), 141 (2000).
  37. Kaishima, M., Ishii, J., Matsuno, T., Fukuda, N., Kondo, A. Expression of varied GFPs in Saccharomyces cerevisiae: Codon optimization yields stronger than expected expression and fluorescence intensity. Scientific Reports. 6, (2016).
  38. . Glow in the Dark: Fluorescent Proteins as Cell and Tissue-Specific Markers in Plants Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21772029/ (2020)
  39. Mnguni, L. E. The theoretical cognitive process of visualization for science education. SpringerPlus. 3 (1), 1-9 (2014).
  40. Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120 (24), 4247-4260 (2007).
  41. Bjorck, L., Kronvall, G. Purification and some properties of streptococcal protein G, a novel IgG-Binding reagent. The Journal of Immunology. 133 (2), (1984).
  42. Andrew, S. M., Titus, J. A. Purification of Immunoglobulin G. Current Protocols in Immunology. 21 (1), 1-12 (2001).
  43. Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein A chromatography for antibody purification. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 848 (1), 40-47 (2007).
  44. Vola, R., Lombardi, A., Tarditi, L., Björck, L., Mariani, M. Recombinant proteins L and LG: efficient tools for purification of murine immunoglobulin G fragments. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 668 (2), 209-218 (1995).
  45. Shinoda, H., Ma, Y., Nakashima, R., Sakurai, K., Matsuda, T., Nagai, T. Acid-Tolerant Monomeric GFP from Olindias formosa. Cell Chemical Biology. 25 (3), 330-338 (2018).
  46. Roberts, T. M., et al. Identification and Characterisation of a pH-stable GFP. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  47. Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
  48. Mahmood, T., Western Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  49. Vessoni Penna, T. C., Ishii, M., Cholewa, O., de Souza, L. C. Thermal characteristics of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) extracted from Escherichia coli. Letters in Applied Microbiology. 38 (2), 135-139 (2004).
  50. Kang, S. J., Park, E. A., Lee, D. H., Hong, K. W. Comparison of the stability of eGFP displayed on the Bacillus subtilis spore surface using CotB and C-terminally truncated CotB proteins as an anchoring motif under extreme conditions. Applied Biological Chemistry. 62 (1), 41 (2019).
  51. Kuta, D. D., Tripathi, L. Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer. African Journal of Biotechnology. 4 (8), 752-757 (2005).
  52. Qiusheng, Z., Bao, J., Likun, L., Xianhua, X. Effects of antioxidants on the plant regeneration and GUS expressive frequency of peanut (Arachis hypogaea) explants by Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 81 (1), 83-90 (2005).
  53. Diamos, A. G., Rosenthal, S. H., Mason, H. S. H.S. 5' and 3' Untranslated Regions Strongly Enhance Performance of Geminiviral Replicons in Nicotiana benthamiana Leaves. Frontiers in Plant Science. 7, 200 (2016).
  54. Huang, Z., Chen, Q., Hjelm, B., Arntzen, C., Mason, H. A DNA replicon system for rapid high-level production of virus-like particles in plants. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 706-714 (2009).
  55. Diamos, A. G., Mason, H. S. Modifying the Replication of Geminiviral Vectors Reduces Cell Death and Enhances Expression of Biopharmaceutical Proteins in Nicotiana benthamiana Leaves. Frontiers in Plant Science. 9, 1974 (2019).
  56. Gordon-Kamm, W., et al. Stimulation of the cell cycle and maize transformation by disruption of the plant retinoblastoma pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11975-11980 (2002).
  57. Villemont, E., Dubois, F., Sangwan, R. S., Vasseur, G., Bourgeois, Y., Sangwan-Norreel, B. S. Role of the host cell cycle in the Agrobacterium-mediated genetic transformation of Petunia: Evidence of an S-phase control mechanism for T-DNA transfer. Planta. 201 (2), 160-172 (1997).
  58. Regnard, G. L., Halley-Stott, R. P., Tanzer, F. L., Hitzeroth, I. I., Rybicki, E. P. High level protein expression in plants through the use of a novel autonomously replicating geminivirus shuttle vector. Plant Biotechnology Journal. 8 (1), 38-46 (2010).
  59. Chen, Q., He, J., Phoolcharoen, W., Mason, H. S. Geminiviral vectors based on bean yellow dwarf virus for production of vaccine antigens and monoclonal antibodies in plants. Human Vaccines. 7 (3), 331-338 (2011).
  60. Morton, T. G., Gold, A. J., Sullivan, W. M. Influence of Overwatering and Fertilization on Nitrogen Losses from Home Lawns. Journal of Environmental Quality. 17 (1), 124-130 (1988).
  61. Brown, J. C. Iron Chlorosis in Plants. Advances in Agronomy. 13, 329-369 (1961).
  62. Morton, E. R., Fuqua, C. Laboratory Maintenance of Agrobacterium. Current Protocols in Microbiology. , (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

167 Nicotiana benthamiana IgG G

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved