Производство белков IgG Fusion, постоянно выраженных в Никотиана бентамиана

Резюме

Мы описываем здесь простой метод выражения, извлечения и очистки рекомбинантных человека IgG сливается с GFP в Никотиана benthamiana. Этот протокол может быть распространен на очистку и визуализацию многочисленных белков, использующих колонку хроматографии. Кроме того, протокол адаптируется к личной и виртуальной учебной лаборатории колледжа, обеспечивая проектную разведку.

Аннотация

Высокий спрос на антитела в качестве терапевтических вмешательств для различных инфекционных, метаболических, аутоиммунных, неопластических и других заболеваний создает растущую потребность в разработке эффективных методов рекомбинантного производства антител. По 2019 году было более 70 одобренных FDA моноклональных антител, и есть экспоненциальный потенциал роста. Несмотря на свои обещания, ограничивающими факторами широкого использования являются производственные издержки и сложность. Потенциально заводы предлагают недорогие, безопасные и легко масштабируемые стратегии производства белка. Такие растения, как Nicotiana benthamiana, могут не только правильно складывать и собирать сложные белки млекопитающих, но и добавлять критические пост-трансляционные модификации, аналогичные тем, которые предлагаются культурами клеток млекопитающих. В этой работе, используя родной GFP и кислотно-стабильный вариант зеленого флуоресцентного белка (GFP), слитого с моноклональными антителами человека, мы смогли визуализировать весь переходный процесс экспрессии антител и очистки растений N. benthamiana. В зависимости от цели эксперимента, родной синтез GFP может обеспечить более легкую визуализацию на этапе экспрессии растений, в то время как кислотно-стабильный синтез GFP позволяет визуализировать во время обработки вниз по течению. Эта масштабируемая и простая процедура может быть выполнена одним исследователем для производства миллиграммовых количеств высоко чистых белков антител или антител в течение нескольких дней, используя только несколько небольших растений. Такая методика может быть распространена на визуализацию любого типа процесса очистки антител и, возможно, многих других белков, как в растительных, так и в других системах экспрессии. Кроме того, эти методы могут принести пользу виртуальным инструкциям и быть выполнены в учебной лаборатории студентами, обладающими минимальным опытом работы с методами молекулярной биологии, обеспечивая основу для исследования на основе проектов с реальными приложениями.

Введение

Отраслевые отчеты показывают, что тринадцать из двадцати наиболее кассовых препаратов в Соединенных Штатах были биопрепараты (белковые фармацевтические препараты), из которых девять были антителами. По данным на 2019 год, на различных стадиях клинического развития^{1,2, 3}было более 570 антител (Ab)^{терапевтических средств.} Текущие мировые продажи Ab превышают 100 миллиардов долларов США, а моноклональный ab (mAb) терапевтический рынок, как ожидается, будет генерировать до 300 миллиардов долларов США к 2025^{году 1,4}. С таким высоким спросом и прогнозируемым увеличением доходов, исследователи работают над разработкой способов производства терапии Ab в все больших масштабах, с более высоким качеством и более низкими затратами. Системы экспрессии на растительной основе имеют ряд преимуществ по сравнению с традиционными линиями клеток млекопитающих для доступного и крупномасштабного производства Ab therapeutics^5,6. Производство белковой терапии в растениях ("молекулярная фармация") не требует дорогостоящих биореакторов или объектов клеточной культуры, как это делают традиционные методы^{культуры клеток млекопитающих 7,8}. Растения не могут за заразились человеческими патогенами, минимизируя^{потенциальное загрязнение 9.} Как переходные, так и трансгенные растительные белковые экспрессии могут быть использованы в качестве более низкой стоимости альтернатив млекопитающих или бактериальных производственных^{систем 10.} Хотя трансгенные растения являются предпочтительными для производства сельскохозяйственных культур, рекомбинантное производство белка с использованием этого метода может потребовать от нескольких недель до нескольких месяцев. Достижения в переходной экспрессии с использованием вирусных векторов через шприц или вакуумную агроинфильтрацию позволяют для мелкого и крупномасштабного производства, соответственно,^{желаемого белка в дни 11,12,13,14}. Производство mAbs против Эболы, Денге и, Зика, и многие другие рекомбинантные белки, были произведены и очищены быстро и эффективно с использованием преходящей экспрессии в N. benthamiana ^{растений 15,16,17,18,19}. Эти обстоятельства делают переходное растительное выражение привлекательным вариантом для разработки нескольких терапевтических средств Ab и методов, продемонстрированных в этом^{протоколе 20.}

Мабы первого поколения были получены из мурина, что привело к неспецифической иммуногенности при использовании в испытаниях на людях²¹. Со временем, химерные, гуманизированные, и в конечном итоге, полностью человека Abs были произведены для уменьшения иммуногенности, вызванной Ab терапии. К сожалению, некоторые из этих Абс до сих пор вызывают хозяина иммуногенности из-за различий в гликозиляции²¹. Разработки в области машиностроения позволили модификации Ab гликанов, что имеет важное значение, поскольку стабильность Ab и функции могут значительно зависеть от его гликозилирования^{государства 22}. Достижения позволили производить в растительных системах высокоуровневое выражение гуманизированных мабов, содержащих человеческие гликаны и, как следствие, желаемые биологические черты массового^{производства человеческой фармацевтической 19,21}.

В дополнение к рекомбинантным Абс, Ab синтеза молекул (Ab слияний) были изучены для различных целей в последние десятилетия. Ab слияния часто состоят из Ab или Ab фрагмент сливается с молекулой или белком и предназначены для получения ответов от иммунных клеток-эффекторов²³. Эти молекулы были созданы в качестве потенциальных терапевтических мероприятий для лечения различных патологий, таких как рак и аутоиммунные заболевания^24,25,26,27. Рекомбинантные иммунные комплексы (РИК) являются еще одним классом Аб синтезов, которые были использованы в качестве вакцины^{кандидатов 28}. РИК воспользоваться способностью иммунной системы распознавать Fc регионов Ab слияний и были найдены для улучшения иммуногенности в сочетании с другими платформами^{вакцины 29,30,31}.

Зеленый флуоресцентный белок (GFP) является биолюминесцентный белок, полученный из медузы Aequorea Виктория, которая излучает зеленый свет, когда возбужденных ультрафиолетовым^{светом 32,33}. На протяжении многих лет, использование GFP в качестве визуального маркера экспрессии генов расширилась от экспрессии в кишечной палочке до многочисленных систем экспрессии белка, в том числе N. benthamiana ^{растений 34,35,36,37,38}. Видимые маркеры, такие как GFP, имеют обильные последствия в преподавании и изучении научных концепций. Многочисленные студенты начального уровня описывают трудности с пониманием научных концепций, когда идея преподается не видна невооруженным глазом, такие как понятия молекулярной биологии и смежных^{областях 39}. Таким образом, визуальные маркеры, такие как GFP, могут способствовать обработке информации, связанной с научными процессами, и могут помочь уменьшить трудности, с которыми сталкиваются учащиеся при изучении многочисленных научных концепций.

Хотя GFP часто используется в качестве маркера для обозначения гена и экспрессии in vivo,трудно визуализировать его в процессах ниже по течению при использовании кислых условий. Это обстоятельство в первую очередь потому, что GFP не поддерживает свою структуру и в результате флуоресценции при низком^{рН 40}. Временные кислые среды часто требуются в различных процессах очистки, таких как белок G, белок А и белок L хроматографии, часто используется для очистки Ab^41,42,43,44. Мутанты GFP были использованы для сохранения флуоресценции в кислых^{условиях 45,46}.

В этом примере мы описываем простой метод выражения, экстракции и очистки рекомбинантных белков синтеза IgG в растениях N. benthamiana. Мы произвели традиционный GFP, слитый с N-термином гуманизированной тяжелой цепи IgG, создавая синтез GFP-IgG. Параллельно мы разработали слияние оптимизированной заводом последовательности для кислотно-стабильной GFP (asGFP) с N-термином гуманизированной тяжелой цепи IgG, создавая синтез asGFP-IgG. Преимущества производства GFP-IgG включают в себя способность визуализировать наличие целевого белка во время экспрессии, в то время как ASGFP-IgG позволяет видеть наличие рекомбинантного белка не только в этапах экспрессии и экстракции, но и в этапах очистки белка. Этот протокол может быть адаптирован для производства, очистки и визуализации ряда белков синтеза GFP, производимых в N. benthamiana и очищенных с использованием методов хроматографии, которые требуют низкого рН. Этот процесс также может быть адаптирован к различным количествам листового материала. Хотя Абс и синтез белков помечены GFP или asGFP не предназначены для использования для терапии, эти методы могут быть полезны в качестве контроля во время экспериментов, а также могут быть дополнительно использованы в качестве учебного пособия для молекулярной и клеточной биологии и биотехнологии, как лично, так и виртуально.

протокол

1. Культивировать растения N. benthamiana

1. Поместите торфяные гранулы почвы на поднос и залейте предварительно вареную, еще горячую (40-45 градусов по Цельсию), воду над торфяными гранулами для полного расширения. После того, как гранулы будут полностью расширены, поместите 2-3 N. benthamiana семена на каждую торфяную гранулу с помощью пинцета.
2. Налейте около 0,5 в воде, чтобы покрыть дно лотка. Этикетка лоток с датой посева. Продолжайте поливать саженцы ежедневно соответствующим количеством удобрений. Концентрация удобрений (водорастворимых цельных растительных продуктов) составляет, как правило, 2,5-2,8 г/л.
3. Обложка лоток с влажным верхом при размещении в камере роста. Храните семенные торфяные гранулы в камере роста при 23-25 градусов по Цельсию, с фотопериодом 16 ч и 60% относительной влажностью.
4. Через неделю удалите дополнительные растения, оставляя каждую гранулу только с одной рассадой.
5. Когда растениям 2-3 недели, перенесите каждую торфяную гранулу в отдельный горшок, содержащий почву, ехаю за влагой. Эта демонстрация использовала Чудо-Gro влаги контроля заливки почвы.
6. Вода ежедневно с удобрениями 1 г/л. Никогда не оставляйте почву полностью сухой. Растения готовы к проникновению, когда им 5-6 недель.

2. Подготовка агробактерий tumefaciens для инфильтрации

ПРИМЕЧАНИЕ: GFP-IgG термоядерные конструкции могут быть получены, как описано в этой статье³¹. Ген asGFP был получен и оптимизирован растением из этого исследования⁴⁵. Следующие шаги должны быть сделаны рядом с горелкой Bunsen, и основные асептические методы должны быть применены, чтобы избежать загрязнения.

1. Полоса A. tumefaciens EHA105 укрывательство фасоли желтый карликовый вирус (BeYDV)^{19 вектор} выражения растений для каждой конструкции (asGFP-IgG, GFP-IgG, световая цепь) из запасов глицерола на пластине LB agar (10 г/л триптона, 10 г/л NaCl, 5 г дрожжевого экстракта, 15 г/л агара, 50 мкг/мл канамицина).
2. Расти в течение одного дня в 30 градусов по Цельсию стоя инкубатор. Изолировать единую колонию для проверки стандартным протоколом ПЦР экрана колонии.
3. Используйте проверенную колонию для каждой конструкции. Заполните коническую трубку 10 мл ЛБ-медиа (10 г/л триптона, 10 г/л NaCl, 5 г дрожжевого экстракта, 50 мкг/мл). Затем добавьте 10 МКЛ из 100 мкг/мл канамицина. Добавьте 10 мкл 2,5 мкг/мл рифампицина, чтобы предотвратить заражение кишечной палочкой. Инкубация при 30 градусах Цельсия и 120-150 об/мин за ночь.
4. На следующий день, если культура агробактерий выросла до_{OD 600} и 0,6-0,9, она может быть использована для инфильтрации. Если он заросший (OD₆₀₀ йgt; 1), 1-2 мл должны быть переведены на свежие LB с антибиотиками и выросли до требуемого OD₆₀₀. В зависимости от концентрации начальной культуры, потенциально может потребоваться два дня, чтобы вырасти до_{OD 600} и 0,6-0,9.
5. После того, как в соответствующих OD₆₀₀, место культур в центрифуге, и гранулы бактерий центрифугации на 4500 х г в течение 20 мин, комнатная температура (RT).
6. Декант супернатант из обоих образцов, а затем повторно каждой гранулы в 1x инфильтрации буфера (10 мМ 2-(N-morpholino) этанесульфоновой кислоты, 10 мМ сульфат магния, скорректированный до рН 5,5 с KOH), чтобы получить окончательный OD₆₀₀ и 0,4. Это должно занять примерно 15-45 мл буфера инфильтрации, в зависимости от первоначальной плотности культуры. Объедините равные объемы каждой конструкции синтеза IgG с конструкцией световой цепи, чтобы получить окончательный OD₆₀₀ и 0,2 на конструкцию в каждой трубе.

3. Игла-менее шприц агроинфильтрации

1. Возьмите выпрямленную окопку и 5-6-недельные растения N. benthamiana из шага 1. Используя острый край опки, сделайте небольшой прокол в первом эпидермальной слое листа на адаксиальной поверхности. Избегайте проколов все это путь до конца.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нижние листья легче для инфильтрации, в то время как листья на верхней части растения сложнее. Как правило, экспрессия рекомбинантных белков является самым высоким в листьях, расположенных в середине растения, и эти листья также получить менее некротических.
2. Заполните шприц 1 мл, без иглы прилагается, с подготовленным раствором Agrobacterium от шага 2. Обложка отверстие, сделанное в предыдущем шаге с конца шприца и медленно нажмите, чтобы ввести бактерии в лист при применении нежной контрпрессуры из-за листа. Смотреть лист темнее, как раствор вводится без применения слишком большого давления на шприц.
3. Попробуйте проникнуть большую часть области листьев максимум в 3-4 раза - чрезмерное повреждение листьев может помешать выходу белка. Проникший растительный лист будет казаться в основном темным снизу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот бактериальный раствор должен быть достаточно, по крайней мере 3-4 растений на конструкцию. Автоклав любого оставшегося бактериального раствора перед отбрасывание.

4. Расти и наблюдать проникли Н. benthamiana

1. Поместите проникшие растения обратно в камеру роста и продолжайте поливать ежедневно.
2. Наблюдайте за листьями от хлороза и некроза в инфильтраторных областях. Наблюдайте растения для флуоресценции GFP (если GFP присутствует) под длинной и коротковолной УФ-лампой.
3. День 4-5 показывает самую высокую флуоресценцию обеих конструкций GFP в листьях. Урожай всех листьев на 4-5 dpi (дней после инфильтрации) и взвесить общий материал листьев.
4. Используйте его немедленно для обработки вниз по течению или хранить при -80 градусов по Цельсию до готовности к использованию.

5. Извлечение белка

1. Храните буферы и блендер чашки на льду или при 4 градусов по Цельсию перед использованием.
2. Подготовка 2-3 мл ледяного буфера добычи (100 мМ Трис-ХКл, 50 мМ НаКл, 2 мМ ЭДТА, рН 8 с HCl) на 1 г растительного материала. Добавьте 2 мМ фенилметилсульфонилового фтора (PMSF) из запаса (100 мМ) и 50 м натрия аскорбат в буфер экстракции незадолго до извлечения.
3. Поместите растительную ткань из шага 4 в предварительно облицованную чашку блендера. Добавьте измеренное количество охлажденного буфера экстракции в чашку блендера (как указано в шаге 5.2). Поместите чашку блендера на блендер. Возьмите предварительно вырезать лист парафильма и растянуть его поверх блендера чашку. Смешайте однородность с интервалом в 20 секунд, хорошо помешивая между циклами смешивания по мере необходимости.
4. Перенесите смешанный материал в стакан. Добавить бар перемешать и перемешать при 4 градусов по Цельсию в течение 30 минут для повышения белка solubility и для того, чтобы осадки твердых веществ.
5. Поместите 2 слоя Miracloth над чистым стаканом на льду и залить экстракт через него, чтобы удалить большой лист мусора. После того, как все экстракт налил, сложить Miracloth сжать остаточный экстракт листьев. Экстракт должен выглядеть темно-зеленым без видимых частиц.
6. Перенесите 50 мкл этого образца на новую трубку объемом 1,5 мл и помекаете «полный экстракт» для более длительного анализа. Перенесите экстракт в центрифуговые трубки. Центрифуга оставшейся части растительного экстракта при 16 000 х г в течение 20 мин, 4 градусов по Цельсию и перенесите супернатант в коническую трубку.
7. Фильтр растворимый экстракт с помощью шприца 50 мл и шприца стекловолокна фильтр (0,75 мкм).
8. Соберите 50 МКЛ образца после центрифугации, наклеив ярлык «растворимый экстракт» для более длительного анализа.

6. Процедура хроматографии колонки белка G

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол, описанный здесь для гравитационного потока хроматографии с использованием пирс белка G агарозы смолы. При использовании другой смолы, обратитесь к инструкциям производителя для корректировки. Никогда не позволяйте смолы иссякнуть и предотвратить все жидкости от слива. Повторите розетку по мере необходимости.

1. Настройка полипропиленовой колонки, которая содержит 20 мл образца.
2. Оцените количество суспензии, необходимой в зависимости от целевого типа иммуноглобулина и его сродства к смоле. Как правило, 3 мл общей суспензии с объемом кровати 1,5 мл достаточно для очистки нескольких миллиграммов Ab.
3. Аккуратно налейте необходимое количество повторного суспензии в ограниченную колонку. Откройте розетку столбца из нижней части столбца и позвольте ей стечь до тех пор, пока большая часть буфера не исчезнет.
4. Сразу же залить 10 мл мыть буфера 1x PBS (137 мММ NaCl, 2,7 мМ ККл, 10 мм На₂HPO₄, 1,8 мМХ₂PO₄, рН 7,4 с HCl) на вершине. Пусть это стечь и повторить этот шаг мыть 2x.
5. Примените отфильтрованный образец от шага 5 к столбецу и соберите flowthrough-aliquot 50 йл потока для более последнего анализа. Сохраните остальную часть потока в случае, если Ab не привязывается к смоле.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Повторное применение потока в новую колонку обычно не приводит к хорошей урожайности; поэтому рекомендуется начинать с нового листового материала.
6. Вымойте смолу дважды с 10 мл 1x PBS, чтобы уменьшить неспецифические связывания. При желании, aliquot 50 йл мытья, как буфер стекает через столбец, чтобы убедиться, что цель Ab не элайт с буфером мытья.
7. Настройка и маркировка пяти трубок с 125 МЛ стерильных 1 M Tris-HCl при рН 8. Это необходимо для нейтрализации абс в кислотном буфере элюции, чтобы избежать потенциальных структурных изменений. Кроме того, добавьте 30 МКЛ из 2 M Tris базы, чтобы получить менее разбавленный образец.
   ВНИМАНИЕ: Во время элюции, УФ-излучение может быть использовано для визуализации. Это не нужно делать в течение всего периода элюции. Если УФ используется, не забудьте носить соответствующие СИЗ, чтобы избежать повреждения глаз и кожи. УФ-излучение не нужно использовать во время шага элюции.
8. Уберите абс, применив 5 мл буфера элюции (100 мМглицин, рН 2,5 с HCl) к колонке и соберите 1 мл фракций к каждой назначенной трубке с предыдущего шага.
9. Немедленно регенерировать столбец, применяя 20 мл буфера мытья, а затем 10 мл буфера мытья. Убедитесь, что смола не остается в кислой среде в течение длительного времени. Elutions должны появиться флуоресцентные, часто самый высокий флуоресценции наблюдается во втором elution, но может варьироваться от экстракции до извлечения.
10. Для хранения, мыть смолы с 10 мл 20% этанола в PBS и дайте ему процедить на полпути. Повторите верхнюю часть, затем нижнюю часть столбца и держитесь в вертикальном положении при 4 градусах Цельсия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, белки G смолы могут быть повторно использованы до 10 раз без значительной потери эффективности. Обратитесь к руководящим принципам производителя для конкретных деталей.
11. Определите концентрацию Ab с помощью спектрофотометра, измерив абсорбцию на уровне 280 нм, используя буфер элюции в качестве пробела. Храните элуаты в -80 градусов по Цельсию и aliquot 50 йл каждой фракции в отдельную трубку для дальнейшего анализа.

7. SDS-PAGE для обнаружения синтеза GFP-Ig

1. Подготовь все образцы перед созданием SDS-PAGE.
   1. Добавить 4 л буфера выборки (6x уменьшая буфер выборки: 3,0 мл глицерола, 0,93 г DTT, 1 г SDS, 7 мл 4x Tris (pH 6.8) 0.5 M, 1.2 мг бромофено-голубого); (6x не уменьшая буфер выборки: 3.0 mL глицерола, 1 g SDS, 7 mL 4x Tris (pH 6.8) 0.5 M, 1.2 мг голубого бромофенола) до 20 qL каждого образца (общий экстракт, растворимый экстракт, flowthrough, мыть, все фракции elution) для анализа. Убедитесь, что крышки трубки надежно закреплены.
   2. Лечить только снижение образцов в течение 5 мин в кипящей водяной бане, а затем положить образцы в течение 5 мин на льду. Образцы спина в микроцентрифуге на 5 с и загружают по 20 мкл каждого образца в порядке сбора в гелеобразные скважины. Загрузите 3 МКЛ двухцветной белковой лестницы в отдельный колодец.
2. Вы запустите гель SDS-PAGE при постоянном разделении белковой полосы 100 V до желаемого разделения белковой полосы; это занимает около 1,5 часов. Мониторинг лестницы как индикатор разделения белка.
3. Визуализуйте гель под УФ для наблюдения за флуоресценцией GFP.
4. При желании, пятно гель с пятном Кумасси для оценки общего белка в каждом образце. Кроме того, выполнять западные пятно для оценки целевого белка с использованием конкретных Abs.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оба Coomassie окрашивания и западной пятно может быть выполнено, следуя стандартным^{протоколам 47,48}.

Результаты

Это исследование демонстрирует простой и быстрый метод производства рекомбинантных белков и визуализации их во всех процессах вниз по течению. Используя N. benthamiana и следуя предоставленного протокола, рекомбинантное производство белка, описанное здесь, может быть достигнуто менее...

Обсуждение

Этот протокол может быть использован для визуальной проверки любого рекомбинантного Ab или рекомбинантного белка, произведенного в растениях N. benthamiana, включая те, которые требуют временного воздействия кислой среды^{для целей очистки столбца 42,43,}

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL syringe	any	N/A
50 mL syringe	any	N/A
Agar	SIGMA-ALDRICH	A5306
Blender with cups	any	N/A
Bromophenol blue	Bio-Rad	1610404
DTT (DL-Dithiothreitol)	MP BIOMEDICALS	219482101
EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid	SIGMA-ALDRICH	E-6760
Ethanol	any	N/A
Glycerol	G-Biosciences	BTNM-0037
Glycine	SIGMA-ALDRICH	G7126-500G
HCl (Hydrochloric acid)	EMD MILLIPORE CORPORATION	HX0603-4
Heating block	any reputable supplier	N/A
Jiffy-7 727 w/hole peat pellets	Hummert International	14237000
Kanamycin	Gold Biotechnology Inc	K-120-100
KCl (Potassium Chloride)	SIGMA-ALDRICH	P9541-500G
KH2PO4 (Potassium Phosphate)	J.t.baker	3248-05
KOH (Potassium Hydroxide)	VWR	BDH0262
Magnesium sulfate heptahydrate	SIGMA-ALDRICH	M2773
MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid)	SIGMA-ALDRICH	M8250
Miracloth	Millipore	4 75855-1R
Moisture control potting mix	Miracle-Gro	755783
Na2HPO4 (Sodium Phosphate)	J.t.baker	3827-01
NaCl (Sodium Chloride)	Santa Cruz Biotechnology	sc-203274C
Nicotiana benthamiana seeds	any reputable supplier	N/A
PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride)	G-Biosciences	786-787
Polypropylene Column	any	N/A
Precision Plus Protein Dual Color Standards	Bio-Rad	1610394
Protein G resin	Thermo Fisher Scientific	20399
Rifampicin	Gold Biotechnology Inc	R-120-25
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)	G-Biosciences	DG093
Sodium Ascorbate	SIGMA-ALDRICH	A7631-500G
Spectrophotometer	any reputable supplier	N/A
Titan3 0.75 µm glass fiber filter	ThermoScientific	40725-GM
Tray for peat pellets with dome	any	N/A
TRIS Base	J.t.baker	4109-02
Tris-HCl	Amresco	M108-1KG
Tryptone	SIGMA-ALDRICH	17221
UV lamp	any	N/A
Water Soluble All Purpose Plant Food	Miracle-Gro	2000992
Yeast extract	SIGMA-ALDRICH	9182