ニコティアナ・ベンタミアナで一過性発現するIgG融合タンパク質の製造

要約

ここでは、 ニコティアナベンタミアナでGFPに融合した組換えヒトIgGの発現、抽出、精製のための簡単な方法について説明します。このプロトコルはカラムクロマトグラフィーを利用する多数のタンパク質の精製および可視化に拡張することができる。さらに、このプロトコルは対人および仮想大学の教育研究所に適応可能であり、プロジェクトベースの探査を提供する。

要約

様々な感染性、代謝、自己免疫、新生物、および他の疾患の治療介入として抗体の需要が高く、組換え抗体産生のための効率的な方法を開発する必要性が高まっています。2019年現在、FDA承認モノクローナル抗体は70種類を超えており、指数関数的な成長の可能性があります。彼らの約束にもかかわらず、広範囲にわたる使用のための制限要因は、製造コストと複雑さです。潜在的に、植物は低コストで安全で、容易に拡張可能なタンパク質製造戦略を提供します。 ニコティアナベンタミアナ のような植物は、複雑な哺乳類タンパク質を正しく折りたたんで組み立てることができるだけでなく、哺乳類の細胞培養物と同様の重要な翻訳後修飾を追加することができます。本研究では、ヒトモノクローナル抗体に融合した天然GFPと酸性安定型の緑色蛍光タンパク質(GFP)を用いることで 、N.ベンタミアナ 植物からの一過性抗体の発現および精製プロセス全体を可視化することができた。実験の目的に応じて、ネイティブGFP融合は植物の発現段階での可視化を容易にし、酸安定性のGFP融合は下流処理中の視覚化を可能にする。このスケーラブルで簡単な手順は、わずか数個の小さな植物を使用して数日のうちに非常に純粋な抗体または抗体融合タンパク質のミリグラム量を生成するために、単一の研究者によって行うことができます。このような技術は、植物および他の発現系の両方で、あらゆる種類の抗体精製プロセスおよび潜在的に他の多くのタンパク質の可視化に拡張することができる。さらに、これらの技術は、仮想命令に利益をもたらし、分子生物学技術の経験を最小限に抑えた学部生によって教育研究室で実行され、実際のアプリケーションでプロジェクトベースの探査の基盤を提供します。

概要

業界の報告によると、米国で最も高く評価されている20種類の医薬品のうち13種類が生物学的製剤(タンパク質ベースの医薬品)であり、そのうち9薬が抗体であった。2019年時点で、様々な臨床開発段階で570以上の抗体(Ab)治療薬が^{1、2、3であった}。現在の世界のAbの売上高は1,000億米ドルを超え、モノクローナルAb(mAb)治療市場は2025^年1、4.4年までに最大3,000億米ドルを生み出す見込みです。このような高い需要と収益の増加が見込まれる中、研究者は、より高品質で低コストで、これまで以上に大きな規模でAb治療薬を生産する方法の開発に取り組んできました。植物ベースの発現系は、Ab治療薬^5,6の手頃な価格で大規模な製造のための伝統的な哺乳類細胞株に対していくつかの利点がある。植物におけるタンパク質治療の生産(「分子ファーミング」)は、伝統的な哺乳類細胞培養技術^7,8のように高価なバイオリアクターまたは細胞培養施設を必要としない。植物は人間の病原体を収縮させることはできず、潜在的な汚染を最小限に^抑える9.一過性およびトランスジェニック植物ベースのタンパク質発現はいずれも、哺乳動物または細菌産生系¹⁰に対する低コストの代替として利用することができる。トランスジェニック植物は作物の生産に好ましいが、この方法を用いた組換えタンパク質の生産には数週間から数カ月が必要となる。シリンジまたは真空アグロインフィルを介したウイルスベクターを用いた過渡発現の進歩により、それぞれ^、11日目^{、12日、13}日^、14日目に所望のタンパク質の小規模および大規模な産生が可能になる。エボラ出血熱に対するmAbsの産生は、デング熱および、ジカ、および他の多くの組換えタンパク質が、N.ベンタミアナ植物^{15、16、17、18、19}において一過性発現を用いて迅速かつ効率的に産生および精製された。これらの状況は、一過性植物ベースの発現を複数のAb治療薬を開発するための魅力的な選択肢と、このプロトコル²⁰で示された方法を作る。

第1世代mAbsはマウス誘導であり、ヒト試験²¹で使用すると非特異的な免疫原性をもたらした。時間が経つにつれて、キメラ、ヒト化、そして最終的には、アブ療法によって誘発される免疫原性を低下させるために完全にヒト腹筋が産生された。残念ながら、これらの腹筋のいくつかは、グリコシル化²¹の違いのために宿主免疫原性を引き起こす。植物工学の発展は、Abの安定性と機能がそのグリコシル化状態²²によって著しく影響を受ける可能性があるため不可欠であるAbグリカンの修飾を可能にした。進歩により、ヒト化mAbsの高レベル発現の植物系での生産が可能となり、ヒトグリカンを含み、結果的に大量生産されたヒト医薬^19,21の所望の生物学的形質を含む。

組み換えAbsに加えて、Ab融合分子(Ab融合)は、ここ数十年で様々な目的のために探求されてきた。Ab融合は、しばしば分子またはタンパク質に融合したAbまたはAb断片から構成され、免疫エフェクター細胞²³からの応答を引き出すために設計されている。これらの分子は、癌や自己免疫疾患^{24、25、26、27}などの様々な病理を治療するための潜在的な治療介入として作成されています。組換え免疫複合体(IC)は、ワクチン候補²⁸として採用されているAb融合の別のクラスである。ICは、Ab融合のFc領域を認識する免疫系の能力を利用し、他のワクチンプラットフォーム^29、30、31と組み合わせると免疫原性を改善することが分^かった。

緑色蛍光タンパク質(GFP)はクラゲエーコレアビクトリアに由来する生物発光タンパク質であり、紫外線^32、33で励起すると緑色の光を発する。長年にわたり、GFPの遺伝子発現の視覚マーカーとしての使用は、大腸菌の発現から、N.ベンタミアナ植物34、35、36、37、38を含む多数のタンパク質発現系へと拡大してきた。GFPのような目に見えるマーカーは、科学的概念の教えと学習に豊富な意味を持っています。多くのエントリーレベルの学生は、分子生物学の概念や関連分野³⁹など、教えられている考えが肉眼では見えない場合に科学的概念を把握することの難しさを説明する。GFPのような視覚マーカーは、科学的プロセスに関連する情報の処理に貢献することができ、学生が多くの科学的概念を学ぶ上で報告する困難を軽減するのに役立ちます。

GFPは生体内で遺伝子や発現を示すマーカーとしてよく用いられますが、酸性条件を使用する場合は下流工程で可視化することは困難です。この状況は主に、GFPが低^pH40でその構造および結果蛍光を維持しないためである。一時的な酸性環境は、タンパク質G、プロテインA、およびプロテインLクロマトグラフィーなどの様々な精製プロセスにおいてしばしば必要とされ、Ab精製^{41、42、43、44}にしばしば利用される。GFP変異体は、酸性条件下で蛍光を保持するために用いられてきた^45,46.

ここで 、N.ベンタミアナ 植物における組換えIgG融合タンパク質の発現、抽出、精製のための簡単な方法について述べている。ヒト化IgG重鎖のN末流に融合した伝統的なGFPを製造し、GFP-IgG融合を生み出しました。同時に、酸安定性GFP(asGFP)の植物コドン最適化配列をヒト化IgG重鎖のN末流に融合させ、asGFP-IgG融合を生み出しました。GFP-IgGを製造する利点は、発現中に標的タンパク質の存在を可視化する能力を含むが、asGFP-IgGは、発現および抽出ステップだけでなく、タンパク質の精製ステップにおいても組換えタンパク質の存在を見ることができる。このプロトコルは 、N.ベンタミナ で産生されるGFP融合タンパク質の生産、精製、可視化に適応し、低pHを必要とするクロマトグラフィー技術を使用して精製することができます。プロセスはまた葉材料の様々な量に合わせることができる。GFPまたはasGFPでタグ付けされた腹筋および融合タンパク質は、治療に使用することを意図していませんが、これらの方法は実験中のコントロールとして有用であり、また、分子細胞生物学とバイオテクノロジーの教育ツールとしても、対人的にも仮想的にも利用することができます。

プロトコル

1. N.ベンタミアナ植物の 栽培

1. トレイに土壌泥炭ペレットを置き、完全に膨張するために泥炭ペレットの上に熱い(〜40〜45°C)、以前に沸騰した水を注ぎます。ペレットを完全に拡張した後、ピンセットを使用して各泥炭ペレットに2-3 N.ベンタミアナ 種子を置きます。
2. トレイの底を覆うために約0.5を水に注ぎます。トレイにシード日を付けます。適切な量の肥料で毎日苗に水を与え続けます。肥料(水溶性万能植物食品)濃度は、一般的に2.5〜2.8 g/Lです。
3. 成長室に置かれたときにフミドームの上で皿を覆う。16時間の光周期と60%の相対湿度で、成長チャンバー内の播種泥のペレットを23〜25°Cに保ちます。
4. 1週間後、1つの苗だけで各ペレットを残して余分な植物を取り除きます。
5. 植物が2〜3週齢の場合は、各泥炭ペレットを水分制御土壌を含む個々のポットに移します。このデモンストレーションでは、ミラクルグロ水分制御ポッティング土壌を使用しました。
6. 1 g/L 肥料で毎日水。土壌を完全に乾燥させたままにしないでください。植物は、5〜6週齢のときに浸潤の準備ができています。

2. 浸潤用アグロバクテリウム・トゥメファシエンスの調製

注: GFP-IgG融合構造は、本論文³¹に記載されているように得ることができます。asGFP遺伝子を取得し、本研究⁴⁵から植物最適化した。次の手順は、ブンゼンバーナーの隣に行う必要があり、基本的な無菌技術は、汚染を避けるために適用する必要があります。

1. ストリーク A.ツメファシエンス EHA105は、LB寒天(10g/Lトリプトン、10g/L NaCl、5g/Lアガー、50g/Lアガー、50g/Lアガー、50グラム/カンク)のグリセロールストックから各コンストラクト(asGFP-IgG、GFP-IgG、軽鎖)に対^{する各構造} (asGFP-IgG、GFP-IgG、軽鎖)に対する植物発現ベクターを含む。
2. 30°Cの立っているインキュベーターで1日成長させる。標準コロニースクリーンPCRプロトコルによる検証のために単一コロニーを分離します。
3. 各構成体に検証済みコロニーを使用します。10 mLのLB培地(10 g/Lトリプトン、10 g/L NaCl、酵母エキス5g、50 μg/mL)を充填します。次に、100 μg/mL カナマイシンを10 μL加えます。大 腸菌 の汚染を防ぐために、2.5 μg/mL リフィンピシンを10 μL加えます。30°C、120~150rpmで一晩インキュベートします。
4. 翌日、 アグロバクテリウム 培養物が_{OD600=0.6-0.9} に成長した場合、浸潤に用いることができる。それが生い茂っている場合(OD₆₀₀ > 1)、1-2 mLは抗生物質で新鮮なLBに移され、必要なOD₆₀₀に成長する必要があります。初期培養の濃度によっては、OD₆₀₀ = 0.6-0.9に成長するのに2日かかる可能性があります。
5. 適切なOD₆₀₀に入ると、培養物を遠心分離機に入れ、20分間4,500xg、室温(RT)で遠心分離して細菌をペレット化する。
6. 両方のサンプルからデカント上清を、次いで、各ペレットを1x浸潤バッファー(10 mM 2-(N-モルフォリノ)エタンレスルホン酸、10mM硫酸マグネシウム、PH 5.5に調整して最終的なOD_600=0.4 を得る。これは、初期培養密度に応じて、浸潤バッファーの約15〜45 mLを取る必要があります。各IgG融合構造の等量を軽鎖構造と組み合わせて、各チューブの構築ごとに最終的なOD₆₀₀ = 0.2を得ます。

3. 針なし注射器アグロインフィル

1. ステップ1からまっすぐにしたペーパークリップと5-6週齢の N.ベンタミアナ 植物を取ります。クリップの鋭いエッジを使用して、大角面の葉の最初の表皮層に小さな穿刺を行います。ずっとそれを穿刺することは避けてください。
   注:下の葉は浸潤が容易ですが、植物の上部の葉は難しいです。一般的に、組換えタンパク質の発現は植物の真ん中に位置する葉の中で最も高く、これらの葉も壊死性が低くなります。
2. 1 mL シリンジを、針を取り付けずに、ステップ 2 から調製した アグロバクテリウム 溶液を充填する。前のステップで作られた穴をシリンジの端で覆い、葉の後ろから穏やかなカウンタープレッシャーを加えながらゆっくりと葉に細菌を注入するために押します。注射器にあまり圧力をかけることなく溶液を注入するので、葉が暗くなります。
3. 最大3〜4倍の葉領域に浸潤してみてください - 過度の葉の損傷は、タンパク質の収率を妨げる可能性があります。浸潤した植物の葉は、下のビューからほとんど暗く表示されます。
   注:この細菌溶液は、構成体ごとに少なくとも3〜4の植物のために十分である必要があります。廃棄する前に残りの細菌溶液をオートクレーブする。

4. 浸透したN.ベンタミアナを成長させ、観察する

1. 浸潤した植物を成長室に戻し、毎日水を続けます。
2. 浸潤した領域でクロロ症と壊死のための葉を観察します。長い短波 UV ランプの下で GFP 蛍光の植物を観察 (GFP が存在する場合) 。
3. 4-5日目は、葉の両方のGFP構成体の中で最も高い蛍光を示す。4-5 dpi(浸潤後の日)ですべての葉を収穫し、総葉材料を計量します。
4. 下流加工にすぐに使用するか、使用できる状態になるまで-80°Cで保管してください。

5. タンパク質抽出

1. バッファーとブレンダーカップを氷の上または4 °Cで保管してから使用してください。
2. 2-3 mLの氷冷抽出バッファー(100 mM Tris-HCl、50 mM NaCl、2 mM EDTA、PH 8、HCl)を植物材料1 gあたり準備します。抽出直前に、ストック(100mM)から2mMのフェニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)と50mMアスコルビン酸ナトリウムを抽出バッファーに加えます。
3. ステップ4から植物組織をプレチルブレンダーカップに入れる。測定量のチルド抽出バッファーをブレンダー カップに追加します(ステップ 5.2 で示すように)。ブレンダーカップをブレンダーの上に置きます。パラフィルムのプレカットシートを取り、ブレンダーカップの上にそれを伸ばします。20秒間隔で均質にブレンドし、必要に応じてブレンドサイクル間でよく攪拌します。
4. ブレンドされた材料をビーカーに移します。攪拌棒を加え、4°Cで30分間かき混ぜてタンパク質の溶解性を高め、固形物の沈殿を可能にします。
5. 氷の上にきれいなビーカーの上にミラクロスの2層を置き、大きな葉の破片を取り除くためにそれを通して抽出物を注ぎます。すべての抽出物を注いだ後、ミラクロスを折り畳んで残りの葉エキスを絞ります。抽出は、目に見える微粒子なしで濃い緑色に表示されるはずです。
6. このサンプルの50 μLを新しい1.5 mLチューブに移し、後で分析するために「トータル抽出物」とラベルを付けます。抽出物を遠心管に移します。植物エキスの残りの部分を20分間、4°Cで16,000xgで遠心分離し、上清を円錐管に移します。
7. 50 mL のシリンジとシリンジガラス繊維フィルター(0.75 μm)を使用して、可溶性抽出物をフィルター処理します。
8. 遠心分離後に50μLのサンプルを採取し、後で分析するために「可溶性抽出物」をラベル付けします。

6. プロテインGカラムクロマトグラフィー法

注: ここで説明するプロトコルは、ピアースプロテインGアガロース樹脂を使用した重力流クロマトグラフィー用です。別の樹脂を使用する場合は、製造元の説明書を参照してください。樹脂を乾燥させ、すべての液体が排出されるのを防ぎます。必要に応じて、コンセントを元に変更します。

1. 20 mLのサンプルを保持するポリプロピレンカラムを設置します。
2. ターゲット免疫グロブリンの種類と樹脂に対する親和性に応じて必要なスラリーの量を推定します。一般的に、1.5 mLの床容積を有する総スラリーの3mLは、Abの数ミリグラムの精製に十分である。
3. キャップされたカラムに必要な量の再懸濁ススラリーを慎重に注ぎます。列の下部から列の出口を開き、バッファーの大部分がなくなるまでドレインできるようにします。
4. すぐに10 mLの洗浄バッファー1x PBS(137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na₂HPO 4、1.8 mM KH₂PO_4、HCl付きpH 7.4)を上に注ぎます。水気を切り、この洗浄ステップ2xを繰り返します。
5. ステップ5からフィルター処理されたサンプルをカラムに適用し、フロースルー-アリコート50 μLのフロースルーを収集して、後で分析します。Abが樹脂に結合しなかった場合に備えて、フロースルーの残りの部分を保存します。
   注: フロースルーを新しい列に再適用しても、通常は良好な歩留まりにはなりません。したがって、新しい葉材料で始めることをお勧めします。
6. 樹脂を10mLの1x PBSで2回洗浄し、非特異的結合を低減します。必要に応じて、アリコート50 μLの洗浄は、バッファーがカラムを通ってドレインし、ターゲットAbが洗浄バッファで溶出していないことを確認する。
7. pH 8で125 μLの無菌1 M Tris-HClを備えた5本のチューブを設置し、ラベルを付けます。これは、潜在的な構造変化を避けるために酸性溶出バッファー内の腹筋を中和することです。または、2 M Tris ベースの 30 μL を加えると、希釈量が少なくなります。
   注意: 溶出中に、UV ライトをビジュアライゼーションに使用できます。これは溶出の間行われる必要はない。UV を使用している場合は、目や皮膚への損傷を避けるために適切な PPE を着用してください。UV ライトは溶出工程で使用する必要はありません。
8. 5 mLの溶出バッファー(100 mM グリシン、HCl を使用した pH 2.5)をカラムに塗布し、前のステップから各指定チューブに 1 mL 分を集めて Abs をエルプルします。
9. 20 mLの洗浄バッファーを塗布し、続いて10 mLの洗浄バッファーを塗布してカラムを直ちに再生します。樹脂が酸性環境に長期間放置されていないことを確認します。溶出は蛍光を現す必要があり、しばしば最も高い蛍光は第2溶出で見られるが、抽出から抽出まで変化する可能性がある。
10. 保管のために、PBSで20%エタノールの10 mLで樹脂を洗浄し、中途半端に排水させます。上部を要約し、次に列の底を要約し、4 °Cで直立してください。
    注:一般的に、プロテインG樹脂は、効率を大幅に低下させることなく10回まで再利用することができます。詳細については、製造元のガイドラインを参照してください。
11. 分光光度計を用いて、280nmで吸光度を測定し、溶出バッファーをブランクとして用いてAb濃度を決定する。溶出液を-80°Cに保存し、各分画の50μLを別のチューブに保存して、さらなる分析を行います。

7. GFP-Ig融合検出のためのSDS-ページ

1. SDS-PAGE を設定する前に、すべてのサンプルを準備してください。
   1. サンプルバッファーの 4 μL を追加します (6x 還元サンプル バッファー: 3.0 mL のグリセロール, 0.93 g の DTT, 1 g の SDS, 7 mL 4x トリス (pH 6.8) 0.5 M, 1.2 mgのブロモフェノールブルー);(6x非還元サンプルバッファー:グリセロール3.0 mL、SDSの1g、4xトリスの7 mL(pH 6.8)0.5M、1.2mgのブロモフェノールブルー)から各サンプルの20μL(全抽出物、可溶性抽出物、フロースルー、洗浄、全溶離画)を分析する。チューブキャップがしっかりと固定されていることを確認します。
   2. 沸騰した水浴で5分間だけサンプルを減らすのを扱い、氷の上に5分間サンプルを入れます。サンプルをマイクロ遠心分離機で~5秒回転し、各サンプルの20 μLをゲルウェルに集める順序でロードします。デュアルカラータンパク質ラダーの3 μLを別のウェルにロードします。
2. SDS-PAGEゲルを一定の100 Vで実行し、目的のタンパク質バンド分離を行います。所要時間は約1.5時間です。タンパク質分離の指標としてはしごを監視します。
3. UVの下でゲルを可視化し、GFP蛍光を観察します。
4. 必要に応じて、クーマシー染色でゲルを染色し、各サンプル中の全タンパク質を評価する。あるいは、ウェスタンブロットを実行して、特定のAbsを用いて標的タンパク質を評価する。
   注:クーマシー染色とウェスタンブロットの両方は、標準プロトコル^47、48に従うことによって行うことができます。

結果

本研究は、組み換えタンパク質を作製し、下流プロセス全体にわたってそれらを可視化する簡単かつ迅速な方法を実証しています。N.ベンタミアナを用いて、規定されたプロトコルに従って、ここで説明する組換えタンパク質の産生は1週間以内に達成できる。植物の発現、抽出、精製の全体的なワークフローを図1に示します。2週齢の苗、4週齢の植物、および6週...

ディスカッション

このプロトコルは、N.ベンタミアナ植物で産生される任意の組換えAbまたは組換えタンパク質の視覚的検証に利用することができ、カラム精製目的で酸性環境への一時的な暴露を必要とするものである42、43、44。さらに、異なる発現系における他のタンパク質へのasGFPの融合は、実験的な可視化および教育のための有...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL syringe	any	N/A
50 mL syringe	any	N/A
Agar	SIGMA-ALDRICH	A5306
Blender with cups	any	N/A
Bromophenol blue	Bio-Rad	1610404
DTT (DL-Dithiothreitol)	MP BIOMEDICALS	219482101
EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid	SIGMA-ALDRICH	E-6760
Ethanol	any	N/A
Glycerol	G-Biosciences	BTNM-0037
Glycine	SIGMA-ALDRICH	G7126-500G
HCl (Hydrochloric acid)	EMD MILLIPORE CORPORATION	HX0603-4
Heating block	any reputable supplier	N/A
Jiffy-7 727 w/hole peat pellets	Hummert International	14237000
Kanamycin	Gold Biotechnology Inc	K-120-100
KCl (Potassium Chloride)	SIGMA-ALDRICH	P9541-500G
KH2PO4 (Potassium Phosphate)	J.t.baker	3248-05
KOH (Potassium Hydroxide)	VWR	BDH0262
Magnesium sulfate heptahydrate	SIGMA-ALDRICH	M2773
MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid)	SIGMA-ALDRICH	M8250
Miracloth	Millipore	4 75855-1R
Moisture control potting mix	Miracle-Gro	755783
Na2HPO4 (Sodium Phosphate)	J.t.baker	3827-01
NaCl (Sodium Chloride)	Santa Cruz Biotechnology	sc-203274C
Nicotiana benthamiana seeds	any reputable supplier	N/A
PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride)	G-Biosciences	786-787
Polypropylene Column	any	N/A
Precision Plus Protein Dual Color Standards	Bio-Rad	1610394
Protein G resin	Thermo Fisher Scientific	20399
Rifampicin	Gold Biotechnology Inc	R-120-25
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)	G-Biosciences	DG093
Sodium Ascorbate	SIGMA-ALDRICH	A7631-500G
Spectrophotometer	any reputable supplier	N/A
Titan3 0.75 µm glass fiber filter	ThermoScientific	40725-GM
Tray for peat pellets with dome	any	N/A
TRIS Base	J.t.baker	4109-02
Tris-HCl	Amresco	M108-1KG
Tryptone	SIGMA-ALDRICH	17221
UV lamp	any	N/A
Water Soluble All Purpose Plant Food	Miracle-Gro	2000992
Yeast extract	SIGMA-ALDRICH	9182