Nicotiana benthamiana'da Geçici Olarak Ifade Edilen IgG Füzyon Proteinlerinin Üretimi

Özet

Burada ifade, çıkarma ve rekombinant insan IgG arınma için basit bir yöntem Nicotiana benthamianaGFP erimiş açıklar. Bu protokol, kolon kromatografisi kullanan çok sayıda proteinin saflaştırılması ve görselleştirilmesi için genişletilebilir. Ayrıca protokol, proje tabanlı keşif ler sağlayan, şahsenn ve sanal üniversite öğretim laboratuvarına uyarlanabilir.

Özet

Çeşitli enfeksiyöz, metabolik, otoimmün, neoplastik ve diğer hastalıklar için terapötik müdahaleler olarak antikorlar için yüksek talep rekombinant antikor üretimi için verimli yöntemler geliştirilmesinde artan bir ihtiyaç oluşturur. 2019 itibariyle 70'ten fazla FDA onaylı monoklonal antikor vardı ve üstel büyüme potansiyeli var. Onların sözüne rağmen, yaygın kullanım için sınırlayıcı faktörler üretim maliyetleri ve karmaşıklığı vardır. Potansiyel olarak, bitkiler düşük maliyetli, güvenli ve kolayca ölçeklenebilir protein üretim stratejileri sunar. Nicotiana benthamiana gibi bitkiler sadece doğru katlayabilir ve karmaşık memeli proteinleri monte ama aynı zamanda memeli hücre kültürleri tarafından sunulan benzer kritik post-çevirisel değişiklikler ekleyebilirsiniz. Bu çalışmada, yerli GFP ve insan monoklonal antikorlar erimiş yeşil floresan protein (GFP) bir asit kararlı varyantı kullanarak, n. benthamiana bitkilerden tüm geçici antikor ekspresyonu ve arıtma süreci görselleştirmek başardık. Deneyin amacına bağlı olarak, yerli GFP füzyonbitkilerde ifade aşamasında daha kolay görselleştirme sağlayabilir, asit kararlı GFP füzyon aşağı işleme sırasında görselleştirme sağlarken. Bu ölçeklenebilir ve basit prosedür sadece birkaç küçük bitkiler kullanarak birkaç gün içinde son derece saf antikor veya antikor füzyon proteinleri miligram miktarlarda üretmek için tek bir araştırmacı tarafından yapılabilir. Böyle bir teknik antikor saflaştırma süreci ve potansiyel olarak diğer birçok proteinlerin her türlü görselleştirme için genişletilebilir, bitki ve diğer ifade sistemlerinde hem de. Ayrıca, bu teknikler sanal talimatlardan yararlanabilir ve moleküler biyoloji teknikleri konusunda en az deneyime sahip lisans öğrencileri tarafından bir öğretim laboratuvarında yürütülebilir ve gerçek dünya uygulamaları ile proje tabanlı keşif için bir temel sağlar.

Giriş

Endüstri raporları, Amerika Birleşik Devletleri'nde en çok hasılat yapan yirmi ilaçtan 13'ünün biyolojik (protein bazlı ilaçlar) olduğunu ve bunların dokuzunun antikor olduğunu göstermektedir. 2019 yılı itibariyle, çeşitli klinik gelişim^evrelerinde570'in üzerinde antikor (Ab) terapötik1^,2,3idi. Mevcut küresel Ab satışları 100 milyar USD aşan ve monoklonal Ab (mAb) terapötik pazar 2025^1,4tarafından 300 milyar USD kadar üretmek bekleniyor. Bu kadar yüksek talep ve beklenen gelir artışları ile, araştırmacılar daha yüksek kalite ve daha düşük maliyetler ile, her zamankinden daha büyük bir ölçekte Ab terapötik üretmek için yollar geliştirmek için çalışıyoruz. Bitki tabanlı ifade sistemleri Ab terapötik uygun fiyatlı ve büyük ölçekli üretim için geleneksel memeli hücre hatları üzerinde çeşitli avantajları var^5,6. Bitkilerde protein terapötik üretimi ("moleküler pharming") pahalı biyoreaktörler veya hücre kültürü tesisleri geleneksel memeli hücre kültürü teknikleri⁷,⁸gibi gerektirmez. Bitkiler insan patojenlerine byüklenici olamaz, potansiyel kontaminasyonu en aza indirir^9. Hem geçici hem de transgenik bitki bazlı protein ekspresyonu memeli veya bakteri üretim sistemlerine daha düşük maliyetli alternatifler olarak kullanılabilir¹⁰. Mahsul üretimi için transgenik bitkiler tercih edilebilse de, bu yöntemi kullanarak rekombinant protein üretimi haftalar ile aylar arasında sürebilir. Şırınga veya vakum agroinfiltrasyon yoluyla viral vektörler kullanarak geçici ifade gelişmeler, sırasıyla, gün^{11, 12,13,14}istenilen proteinin küçük ve büyük ölçekli üretim için izin verir. Ebola, Dang ve Zika'ya karşı mAbs üretimi ve çok sayıda diğer rekombinant proteinler, hızlı ve verimli N. benthamiana ^bitkiler15geçici ifade kullanılarak üretilmiş ve saflaştırılmış 15^,16,17,18,19. Bu koşullar geçici bitki tabanlı ifade birden fazla Ab terapötik ve bu protokol²⁰gösterilen yöntemler geliştirmek için cazip bir seçenek olun.

Birinci nesil mAb'ler murine türevidir, bu da insan deneylerinde kullanıldığında spesifik olmayan immünjenite ile sonuçlanır²¹. Zamanla, şeymerik, insancıl, ve sonunda, tamamen insan Abs Ab terapötik tarafından indüklenen immünjenite yi tirmek için üretildi. Ne yazık ki, bu Abs bazıları hala glikozilasyon farklılıkları nedeniyle konak immünojenite neden²¹. Tesis mühendisliğindeki gelişmeler Ab glikanlarının modifikasyonuna olanak sağlamıştır, bu da ab'nin stabilitesi ve fonksiyonu glikozilasyon durumundan önemli ölçüde etkilenebileceğinden gereklidir²². Gelişmeler insanca mAbs üst düzey ifade bitki sistemlerinde üretim izin verdi, insan glikaniçeren ve sonuçta bir kitle üretilen insan ilaç istenilen biyolojik özellikleri^19,21.

Rekombinant Abs ek olarak, Ab füzyon molekülleri (Ab füzyon) son yıllarda çeşitli amaçlar için araştırılmıştır. Ab füzyonları genellikle bir molekül veya proteine kaynaşmış bir Ab veya Ab parçasından oluşur ve bağışıklık efektörü hücrelerinden yanıt almak için tasarlanmıştır^23. Bu moleküller kanser ve otoimmün hastalıklar^24,25,26,27gibi çeşitli patolojiler tedavi etmek için potansiyel terapötik müdahaleler olarak oluşturulmuştur. Rekombinant bağışıklık kompleksleri (RİCs) aşı adayları²⁸olarak istihdam edilmiştir Ab füzyon başka bir sınıftır. RiCs ab füzyon Fc bölgeleri tanımak için bağışıklık sisteminin yeteneğini yararlanmak ve diğer aşı platformları ile kombine edildiğinde immünojenite geliştirmek için bulunmuştur^29,30,31.

Yeşil Floresan Protein (GFP) denizanası Aequorea Victoria elde edilen bir biyolüminesans protein, hangi ultraviyole ışık tarafından heyecanlı yeşil ışık yayan^32,33. Yıllar içinde, gen ekspresyonu görsel bir belirteç olarak GFP kullanımı Escherichia coli ifade den çok sayıda protein ekspresyonu sistemleri, N. benthamiana bitkiler³⁴dahil olmak üzere genişletilmiş^,35,36,37,38. GFP gibi görünür işaretlerin bilimsel kavramların öğretive öğreniminde çok sayıda etkisi vardır. Çok sayıda giriş seviyesi öğrencisi, öğretilen fikrin çıplak gözle görülemediğinde, moleküler biyoloji ve ilgili alanlar gibi bilimsel kavramları kavramanın zorluklarını^{anlatırlar 39}. GFP gibi görsel belirteçler, böylece bilimsel süreçlerle ilgili bilgilerin işlenmesine katkıda bulunabilir ve öğrencilerin çok sayıda bilimsel kavramı öğrenmede rapor etme deki zorlukları nazına yardımcı olabilir.

GFP genellikle in vivogen ve ekspresyonu belirtmek için bir belirteç olarak kullanılmasına rağmen, asidik koşullar kullanıyorsanız downstream süreçlerinde görselleştirmek zordur. GFP düşük pH⁴⁰yapısını ve ortaya çıkan floresan korumak değil çünkü bu durum öncelikle. Geçici asidik ortamlar genellikle protein G, protein A ve protein L kromatografisi gibi çeşitli arıtma süreçlerinde gereklidir, genellikle Ab arıtma için kullanılan^41,42,43,44. GFP mutantları asidik koşullar altında floresan korumak için kullanılmıştır^45,46.

Burada n. benthamiana bitkilerinde rekombinant IgG füzyon proteinlerinin ekspresyonu, ekstraksiyonu ve saflaştırılması için basit bir yöntem açıklıyoruz. İnsanlaştırılmış bir IgG ağır zincirinin N-terminusuna kaynaşmış geleneksel GFP ürettik ve gfp-igg füzyonu yarattık. Aynı anda, insanlaşmış bir IgG ağır zincirinin N-terminus'una asit-kararlı GFP (asGFP) için bitki kodonu optimize edilmiş bir dizinin füzyonu geliştirdik ve bir asGFP-IgG füzyonu oluşturduk. GFP-IgG üretmenin avantajları arasında ifade sırasında hedef proteinin varlığını görselleştirme yeteneği yer alırken, asGFP-IgG sadece ifade ve ekstraksiyon adımlarında değil, aynı zamanda proteinin saflaştırma adımlarında rekombinant proteinin varlığını da görmenizi sağlar. Bu protokol, N. benthamiana'da üretilen ve düşük pH gerektiren kromatografi teknikleri kullanılarak saflaştırılan bir dizi GFP füzyon proteininin üretimi, saflaştırılması ve görselleştirilmesi için uyarlanabilir. Süreç aynı zamanda yaprak malzeme çeşitli miktarlarda uyarlanmış olabilir. GFP veya asGFP ile etiketlenmiş Abs ve füzyon proteinleri tedaviler için kullanılmak üzere tasarlanmasa da, bu yöntemler deneyler sırasında kontrol olarak yararlı olabilir ve aynı zamanda moleküler ve hücresel biyoloji ve biyoteknoloji için hem bizzat hem de sanal olarak bir öğretim aracı olarak kullanılabilir.

Protokol

1. N. benthamiana bitkileri yetiştirmek

1. Bir tepsiye toprak turba pelet yerleştirin ve daha önce haşlanmış dökün, hala sıcak (~ 40-45 °C), tam genişleme için turba pelet üzerinde su. Peletler tamamen genişletildikten sonra, cımbız kullanarak her turba pelet üzerinde 2-3 N. benthamiana tohumları yerleştirin.
2. Tepsinin altını kaplayacak şekilde yaklaşık 0,5 su dökün. Tepsiyi tohumlama tarihiyle etiketleyin. Fideleri her gün uygun miktarda gübre ile sulamaya devam edin. Gübre (suda çözünen çok amaçlı bitki gıda) konsantrasyonu genellikle 2.5-2.8 g/L'dir.
3. Büyüme odasına yerleştirildiğinde tepsiyi bir humidome üst ile kaplayın. Tohumlu turba peletlerini 16 saat fotoperiod ve %60 bağıl nem oranıyla 23-25 °C'de büyüme odasında tutun.
4. Bir hafta sonra, sadece bir fide ile her pelet bırakarak ekstra bitkiler kaldırın.
5. Bitkiler 2-3 haftalık olduğunda, her bir turba peletnem kontrol toprak içeren ayrı bir pota aktarın. Bu gösteride Miracle-Gro nem kontrol çömlekçilik toprağı kullanılmıştır.
6. Günlük 1 g/L gübre ile su. Toprağı asla tamamen kuru bırakmayın. Bitkiler 5-6 haftalıkolduklarında sızmaya hazırdırlar.

2. Sızma için Agrobacterium tumefaciens hazırlanması

NOT: GFP-IgG füzyon yapıları bu yazıda açıklandığı gibi elde edilebilir³¹. AsGFP geni elde edilmiş ve bu çalışmadan bitki optimize⁴⁵. Bunsen brülöryanında aşağıdaki adımlar yapılmalı ve kontaminasyonu önlemek için temel aseptik teknikler uygulanmalıdır.

1. Streak A. tumefaciens EHA105 her yapı için fasulye sarı cüce virüs barındıran EHA105 (asGFP-IgG, GFP-IgG, ışık zinciri) LB agar bir gliserol stok (10 g /L Tryptone, 10 g /L NaCl, 5 g maya ekstresi, 15 g/L agar, 50 μg/mLaac kanami)
2. 30 °C'lik ayakta kuvözde bir gün büyüyün. Standart koloni ekranı PCR protokolü ile doğrulanması için tek bir koloniyi yalıtın.
3. Her yapı için doğrulanmış koloni kullanın. Konik tüpü 10 mL LB media (10 g/L tripton, 10 g/L NaCl, 5 g maya özü, 50 g/mL) ile doldurun. Daha sonra 10 μL 100 g/mL kanamisin ekleyin. E. coli kontaminasyonunu önlemek için 10 μL 2,5 g/mL rifampisin ekleyin. Bir gecede 30°C ve 120-150 rpm'de kuluçkaya yatırın.
4. Ertesi gün, Agrobacterium kültürü OD₆₀₀ = 0.6-0.9'a yetiştirilirse, sızma için kullanılabilir. Aşırı büyümüşse (OD₆₀₀ > 1), 1-2 mL antibiyotikle taze LB'ye aktarılmalı ve gerekli OD_600'eyetiştirilmelidir. İlk kültürün konsantrasyonuna bağlı olarak, OD₆₀₀ = 0.6-0.9'a büyümesi iki gün sürebilir.
5. Bir kez uygun OD₆₀₀, bir santrifüj kültürleri yerleştirin ve 20 dakika için 4.500 x g santrifüj ile bakteri pelet, oda sıcaklığında (RT).
6. Her iki örnekten de dekant supernatant, ve sonra son OD almak için 1x infiltrasyon tampon (10 mM 2-(N-morfolino) etanesülfonik asit, 10 mM magnezyum sülfat, koh ile pH 5.5 ayarlanmış her pelet resuspend₆₀₀ = 0.4. Bu, ilk kültür yoğunluğuna bağlı olarak yaklaşık 15-45 mL infiltrasyon tamponu almalıdır. Her IgG füzyon yapısının eşit hacimli kısmını, her tüpteki yapı başına son OD₆₀₀ = 0,2'yi elde etmek için ışık zinciri yapısıyla birleştirin.

3. İğnesiz şırınga agroinfiltrasyon

1. Adım 1 bir düzleştirilmiş ataş ve 5-6 haftalık N. benthamiana bitkiler alın. Ataş'ın keskin kenarını kullanarak, adaxial yüzeyde yaprağın ilk epidermal tabakasında küçük bir delik açın. Sonuna kadar delmekten kaçının.
   NOT: Alt yapraklar infiltrasyon için daha kolay, bitkinin üst yaprakları ise daha zordur. Genellikle, rekombinant proteinlerin ekspresyonu bir bitkinin ortasında bulunan yaprakları en yüksek, ve bu yaprakları da daha az nekrotik olsun.
2. Adım 2'den hazırlanan Agrobacterium çözeltisi ile 1 mL şırınga, bir iğne bağlı olmadan doldurun. Şırınganın ucuyla önceki adımda yapılan deliği kapatın ve yaprağın arkasından yumuşak karşı basınç uygularken bakterileri yaprağa enjekte etmeye yavaşça bastırın. Çözelti şırıngaya çok fazla basınç uygulamadan enjekte edilirken yaprağın koyulaşmasına dikkat edin.
3. Yaprak alanının çoğuna en fazla 3-4 kez sızmaya çalışın – aşırı yaprak hasarı protein verimini engelleyebilir. Sızmış bitki yaprağı çoğunlukla alt görünümden karanlık görünür.
   NOT: Bu bakteriyel çözelti yapı başına en az 3-4 bitki için yeterli olmalıdır. Otoklav atmadan önce kalan bakteriyel çözelti.

4. Büyümek ve sızmış N. benthamiana gözlemlemek

1. Sızmış bitkileri büyüme odasına geri yerleştirin ve her gün su almaya devam edin.
2. İnmiş bölgelerde kloroz ve nekroz için yaprakları gözlemleyin. Uzun ve kısa dalga UV lambası altında GFP floresan (GFP varsa) için bitkileri gözlemleyin.
3. Gün 4-5 yapraklarında her iki GFP yapıları en yüksek floresan gösterir. Hasat tüm yaprakları 4-5 dpi (gün sonrası infiltrasyon) ve toplam yaprak malzeme tartmak.
4. Kullanıma hazır olana kadar -80 °C'de akış aşağı işleme veya depolamak için hemen kullanın.

5. Protein ekstraksiyonu

1. Kullanmadan önce arabellek ve blender bardaklarını buzda veya 4 °C'de saklayın.
2. 1 g bitki malzemesi başına 2-3 mL buz gibi ekstraksiyon tamponu (100 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, hcl ile pH 8) hazırlayın. Ekstraksiyondan hemen önce ekstraksiyon tamponuna stoktan 2 mM fenilmetilsülfonil florür (PMSF) ve 50 mM sodyum askorbat ekleyin.
3. Adım 4'ten bitki dokusunu önceden soğutulmuş blender kabına yerleştirin. Blender kabına ölçülen miktarda soğutulmuş ekstraksiyon tamponu ekleyin (adım 5.2'de belirtildiği gibi). Blender kabını blender'ın üzerine yerleştirin. Parafilm önceden kesilmiş bir levha alın ve blender fincan üstüne streç. Gerektiğinde karışım döngüleri arasında iyice karıştırarak, 20 sn aralıklarla homojenliğe karıştırın.
4. Harmanlanmış malzemeyi bir kabına aktarın. Bir karıştırma çubuğu ekleyin ve protein çözünürlüğünü artırmak ve katıların yağış sağlamak için 30 dakika boyunca 4 °C'de karıştırın.
5. Buz üzerinde temiz bir beher üzerinde Miracloth 2 kat yerleştirin ve büyük yaprak enkaz kaldırmak için üzerinden özü dökün. Tüm özü dökülür sonra, artık yaprak ekstresi sıkmak için Miracloth katlayın. Ekstre görünür partiküller olmadan koyu yeşil görünmelidir.
6. Bu numunenin 50 μL'sini yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın ve daha sonraki analizler için "toplam ekstresi" etiketini etiketlendirin. Özü santrifüj tüplerine aktarın. 20 dk, 4 °C için 16.000 x g bitki ekstresinin geri kalanını santrifüj ve konik bir tüp için supernatant aktarın.
7. Çözünür ekstresini 50 mL şırınga ve şırınga cam elyaf filtresi (0,75 m) kullanarak filtreleyin.
8. Santrifüjden sonra bir numunenin 50 μL'sini toplayın, daha sonra analiz için "çözünür ekstresi" etiketini etiketedin.

6. Protein G kolon kromatografisi prosedürü

NOT: Burada açıklanan protokol Pierce Protein G agarose resin kullanılarak yerçekimi akımı kromatografisi içindir. Farklı bir reçin kullanıyorsanız, ayarlamalar için üreticinin talimatlarına bakın. Resenin kurumasına asla izin vermeyin ve tüm sıvının dışarı akmasını önleyin. Gerektiğinde çıkışı yeniden özetleyin.

1. 20 mL numune tutan bir polipropilen sütun ayarlayın.
2. Hedef immünglobulin tipine ve rezorine olan yakınlığına bağlı olarak gerekli bulamaç miktarını tahmin edin. Genel olarak, 1,5 mL yatak hacmi ile toplam bulamaç 3 mL Ab birkaç miligram saflaştırma için yeterlidir.
3. Dikkatlice kapaklı sütuniçine resuspended bulamaç gerekli miktarda dökün. Sütun çıkışını sütunun altındakinden açın ve arabellek gidene kadar boşalmasını bekleyin.
4. Hemen üzerine yıkama tampon 1x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1.8 mM KH₂PO₄, pH 7.4 HCl ile) dökün. Drenaj ve bu yıkama adım 2x tekrarlayın.
5. Filtrelenmiş numuneyi 5. Ab'nin rezorne bağlanmaması ihtimaline karşı akışın geri kalanını kaydedin.
   NOT: Yeni bir sütuna yeniden akış uygulamak genellikle iyi bir verim ile sonuçlanmaz; bu nedenle yeni yaprak malzeme ile başlamak için tavsiye edilir.
6. Spesifik olmayan bağlamayı azaltmak için reçiyiyi 10 mL 1x PBS ile iki kez yıkayın. İstenirse, arabellek sütundan geçerken aliquot 50 μL yıkama, hedef Ab'nin bir yıkama tamponuyla dolu olmadığını doğrulamak için sütundan geçer.
7. PH 8'de 125 μL steril 1 M Tris-HCl ile beş tüp kurun ve etiketlendi. Bu olası yapısal değişiklikleri önlemek için asidik elüs tampon Abs nötralize etmektir. Alternatif olarak, daha az seyreltilmiş numune almak için 30 μL 2 M Tris taban ekleyin.
   DİkKAT: Elüsyon sırasında görselleştirme için UV ışığı kullanılabilir. Bunun elüsiyon süresi boyunca yapılması gerekmez. UV kullanılıyorsa, gözlere ve cilde zarar vermemek için uygun PPE kullandığınızdan emin olun. Uv ışığının elüsyon adımı sırasında kullanılması gerekmez.
8. Abs'i kolona 5 mL elüsyon tamponu (100 mM glisin, pH 2.5 HCl) uygulayarak ve bir önceki adımdan belirlenen her tüpiçin 1 mL fraksiyon toplayarak elüsyonu saplayın.
9. 20 mL yıkama tamponu uygulayarak kolonu hemen yeniler, ardından 10 mL yıkama tamponu uygulayın. Resenin asidik bir ortamda uzun süre bırakılmadığından emin olun. Elutions floresan görünmelidir, genellikle en yüksek floresan ikinci elüsiyon görülür ama ekstraksiyon için ekstraksiyon değişebilir.
10. Depolama için reçini PBS'de %20 etanolün 10 mL'si ile yıkayın ve yarıya kadar boşaltın. Üst, sonra sütunun alt recap ve 4 °C dik tutun.
    NOT: Genellikle protein G recineleri önemli verimlilik kaybı olmadan 10 kata kadar yeniden kullanılabilir. Belirli ayrıntılar için üreticinin yönergelerine bakın.
11. Elüsyon tamponu boş olarak kullanarak, 280 nm'de emiciliği ölçerek bir spektrofotometre kullanarak Ab konsantrasyonu belirleyin. Eluatları -80 °C'de ve her fraksiyonun 50 μL'lik kısmını daha fazla analiz için ayrı bir tüpe saklayın.

7. GFP-Ig füzyon algılama için SDS-PAGE

1. SDS-PAGE'i kurmadan önce tüm örnekleri hazırlayın.
   1. 4 μL numune tamponu ekleyin (örnek tamponu 6kat azaltArak: 3,0 mL gliserol, 0,93 g DTT, 1 g SDS, 7 mL 4x Tris (pH 6.8) 0.5 M, 1.2 mg bromofenol mavisi); (6x non-reducing örnek tampon: 3.0 mL gliserol, 1 g SDS, 7 mL 4x Tris (pH 6.8) 0.5 M, 1.2 mg bromofenol mavisi) için 20 μL her örnek (toplam ekstresi, çözünür ekstresi, akış, yıkama, tüm elution fraksiyonları) analiz için. Tüp kapaklarının güvenli bir şekilde sabitlendirilmesini sağlayın.
   2. Sadece bir kaynar su banyosunda 5 dakika için örnekleri azaltarak tedavi ve sonra buz üzerinde 5 dakika için örnekleri koyun. ~5 s için mikrosantrifüj de spin örnekleri ve jel kuyuları içine toplama sırasına göre her örnek 20 μL yükleyin. Ayrı bir kuyuda 3 μL çift renkli protein merdiveni yükleyin.
2. SDS-PAGE jelini sabit 100 V'de istenilen protein bandı ayrımına çalıştırın; yaklaşık 1,5 saat sürer. Protein ayrımının bir göstergesi olarak merdiveni izleyin.
3. GFP floresansını gözlemlemek için jeli UV'nin altında görselleştirin.
4. İstenirse, her örnekte toplam proteindeğerlendirmek için Coomassie leke ile jel leke. Alternatif olarak, belirli Abs kullanarak hedef protein değerlendirmek için batı leke yapmak.
   NOT: Hem Coomassie boyama ve batı leke standart protokolleri 47 ,⁴⁸aşağıdaki yapılabilir.

Sonuçlar

Bu çalışma, rekombinant proteinler üretmek ve aşağı akım süreçleri boyunca görselleştirmek için kolay ve hızlı bir yöntem göstermektedir. N. benthamiana kullanılarak ve sağlanan protokolü izleyerek, burada açıklanan rekombinant protein üretimi bir haftadan kısa bir sürede sağlanabilir. Bitki ekspresyonu, ekstraksiyonu ve saflaştırmanın genel iş akışı Şekil 1'degösterilmiştir. Şekil 1B nekroz(Şek...

Tartışmalar

Bu protokol, sütun arıtma amaçlı asidik ortamlara geçici maruz kalma gerektirenler de dahil olmak üzere, N. benthamiana tesislerinde üretilen herhangi bir rekombinant Ab veya rekombinant proteinin görsel doğrulaması için kullanılabilir^42,43,44. Ayrıca, farklı ifade sistemlerinde diğer proteinler için ASGFP füzyon deneysel görselleştirme ve eğitim için yararlı bir araç olabilir. Buradaki protokol, ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL syringe	any	N/A
50 mL syringe	any	N/A
Agar	SIGMA-ALDRICH	A5306
Blender with cups	any	N/A
Bromophenol blue	Bio-Rad	1610404
DTT (DL-Dithiothreitol)	MP BIOMEDICALS	219482101
EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid	SIGMA-ALDRICH	E-6760
Ethanol	any	N/A
Glycerol	G-Biosciences	BTNM-0037
Glycine	SIGMA-ALDRICH	G7126-500G
HCl (Hydrochloric acid)	EMD MILLIPORE CORPORATION	HX0603-4
Heating block	any reputable supplier	N/A
Jiffy-7 727 w/hole peat pellets	Hummert International	14237000
Kanamycin	Gold Biotechnology Inc	K-120-100
KCl (Potassium Chloride)	SIGMA-ALDRICH	P9541-500G
KH2PO4 (Potassium Phosphate)	J.t.baker	3248-05
KOH (Potassium Hydroxide)	VWR	BDH0262
Magnesium sulfate heptahydrate	SIGMA-ALDRICH	M2773
MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid)	SIGMA-ALDRICH	M8250
Miracloth	Millipore	4 75855-1R
Moisture control potting mix	Miracle-Gro	755783
Na2HPO4 (Sodium Phosphate)	J.t.baker	3827-01
NaCl (Sodium Chloride)	Santa Cruz Biotechnology	sc-203274C
Nicotiana benthamiana seeds	any reputable supplier	N/A
PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride)	G-Biosciences	786-787
Polypropylene Column	any	N/A
Precision Plus Protein Dual Color Standards	Bio-Rad	1610394
Protein G resin	Thermo Fisher Scientific	20399
Rifampicin	Gold Biotechnology Inc	R-120-25
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)	G-Biosciences	DG093
Sodium Ascorbate	SIGMA-ALDRICH	A7631-500G
Spectrophotometer	any reputable supplier	N/A
Titan3 0.75 µm glass fiber filter	ThermoScientific	40725-GM
Tray for peat pellets with dome	any	N/A
TRIS Base	J.t.baker	4109-02
Tris-HCl	Amresco	M108-1KG
Tryptone	SIGMA-ALDRICH	17221
UV lamp	any	N/A
Water Soluble All Purpose Plant Food	Miracle-Gro	2000992
Yeast extract	SIGMA-ALDRICH	9182