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* 이 저자들은 동등하게 기여했습니다
우리는 니코티아나 벤타미안에서GFP에 융합된 재조합 인간 IgG의 발현, 추출 및 정제를 위한 간단한 방법을 여기에서 설명한다. 이 프로토콜은 열 크로마토그래피를 활용하는 수많은 단백질의 정제 및 시각화로 확장될 수 있습니다. 또한, 이 프로토콜은 직접 및 가상 대학 교육 실험실에 적용되어 프로젝트 기반 탐사를 제공합니다.
다양한 전염성, 대사, 자가면역, 신플라스틱 및 기타 질병에 대한 치료 개입으로서 항체에 대한 수요가 높아지면서 재조합 항체 생산을 위한 효율적인 방법을 개발할 필요성이 증가하고 있다. 2019년 현재, FDA승인 단일클론 항체가 70개 이상 있었으며 기하급수적인 성장 잠재력이 있습니다. 그들의 약속에도 불구하고, 광범위한 사용에 대한 제한 요인은 제조 비용과 복잡성입니다. 잠재적으로 식물은 저비용, 안전하며 쉽게 확장 가능한 단백질 제조 전략을 제공합니다. 니코티아나 벤타미안과 같은 식물은 복잡한 포유류 단백질을 올바르게 접고 조립할 수 없을 뿐만 아니라 포유류 세포 배양에서 제공하는 것과 유사한 중요한 번역 후 수정을 추가할 수 있습니다. 본 작품에서는, 인간 단일클론 항체에 융합된 녹색 형광 단백질(GFP)의 원종 GFP 및 산안정변체를 사용하여, 우리는 N. 벤타미안 식물로부터 의 전체 과도 항체 발현 및 정화 과정을 시각화할 수 있었다. 실험의 목적에 따라 네이티브 GFP 융합은 식물의 발현 단계에서 쉽게 시각화할 수 있으며, 산안정성 GFP 융합은 다운스트림 처리 중에 시각화를 가능하게 합니다. 이 확장 가능하고 간단한 절차는 몇 가지 작은 식물을 사용하여 며칠 만에 고도로 순수한 항체 또는 항체 융합 단백질의 밀리그램 양을 생산하는 단일 연구원에 의해 수행 될 수있다. 이러한 기술은 식물 및 기타 발현 시스템에서 모든 유형의 항체 정제 공정 및 잠재적으로 많은 다른 단백질의 시각화로 확장될 수 있다. 또한, 이러한 기술은 가상 지침에 도움이 될 수 있으며 분자 생물학 기술에 대한 최소한의 사전 경험을 가진 학부 생에 의해 교육 실험실에서 실행될 수 있으며, 실제 응용 프로그램과 프로젝트 기반 탐사를위한 토대를 제공합니다.
업계 보고서에 따르면 미국에서 가장 많이 매출을 기록한 20개 중 13개 약물은 생물학적 제제(단백질 기반 의약품)였으며, 그 중 9개가 항체였습니다. 2019년 현재, 다양한 임상 개발상에서570개 이상의 항체(Ab) 치료제가1,2,3하였다. 현재 글로벌 Ab 매출은 1,000억 달러를 초과하며, 단일클론 Ab(mAb) 치료제 시장은 2025년1,4년까지최대 3,000억 달러를 창출할 것으로 예상됩니다. 이러한 높은 수요와 예상 된 수익 증가로, 연구원은 더 높은 품질과 낮은 비용으로, 그 어느 때보 다 큰 규모로 Ab 치료제를 생산하는 방법을 개발하기 위해 노력하고있다. 식물계 발현 시스템은 Ab 치료제5,6의저렴하고 대규모 제조를 위해 전통적인 포유류 세포주보다 몇 가지 장점이 있다. 식물에서 단백질 치료제의 생산("분자 파밍")은 전통적인 포유류 세포 배양기술7,
1. N. 벤타미안 식물 을 재배
이 연구는 재조합 단백질을 생성하고 다운스트림 프로세스 전반에 걸쳐 시각화하는 쉽고 빠른 방법을 보여줍니다. N. 벤타미안을 사용하고 제공된 프로토콜을 따르고, 여기에 설명된 재조합 단백질 생산은 1주일 이내에 달성될 수 있다. 식물 발현, 추출 및 정제의 전체 워크플로우가 도 1에표시됩니다. 2주 된 묘목, 4주 된 식물, 6주 된 식물의 식물 성장 단계는 각각 도 .......
이러한 프로토콜은 N. 벤타미안 식물에서 생산되는 임의의 재조합 Ab 또는 재조합 단백질의 시각적 검증을 위해 활용될 수 있으며, 여기에는 열 정화목적42,43,44에대한 산성 환경에 일시적으로 노출이 필요한 단백질이 포함된다. 더욱이, 다른 발현 시스템에서 다른 단백질에 asGFP의 융합은 실험적인 시각화 및 교육을 위한.......
저자는 공개 할 것이 없습니다.
우리는 비디오를 편집 마리아 피아 디팔마 감사합니다. 우리는 또한 그들의 관대 한 출판 수수료 지원에 대한 애리조나 주립 대학의 교육 봉사 및 학생 서비스 사무실에 감사드립니다. 이 프로토콜에 대한 연구는 생명 과학 의 학교에 의해 지원되었다, 애리조나 주립 대학.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
5 mL syringe | any | N/A | |
50 mL syringe | any | N/A | |
Agar | SIGMA-ALDRICH | A5306 | |
Blender with cups | any | N/A | |
Bromophenol blue | Bio-Rad | 1610404 | |
DTT (DL-Dithiothreitol) | MP BIOMEDICALS | 219482101 | |
EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid | SIGMA-ALDRICH | E-6760 | |
Ethanol | any | N/A | |
Glycerol | G-Biosciences | BTNM-0037 | |
Glycine | SIGMA-ALDRICH | G7126-500G | |
HCl (Hydrochloric acid) | EMD MILLIPORE CORPORATION | HX0603-4 | |
Heating block | any reputable supplier | N/A | |
Jiffy-7 727 w/hole peat pellets | Hummert International | 14237000 | |
Kanamycin | Gold Biotechnology Inc | K-120-100 | |
KCl (Potassium Chloride) | SIGMA-ALDRICH | P9541-500G | |
KH2PO4 (Potassium Phosphate) | J.t.baker | 3248-05 | |
KOH (Potassium Hydroxide) | VWR | BDH0262 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | SIGMA-ALDRICH | M2773 | |
MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid) | SIGMA-ALDRICH | M8250 | |
Miracloth | Millipore | 4 75855-1R | |
Moisture control potting mix | Miracle-Gro | 755783 | |
Na2HPO4 (Sodium Phosphate) | J.t.baker | 3827-01 | |
NaCl (Sodium Chloride) | Santa Cruz Biotechnology | sc-203274C | |
Nicotiana benthamiana seeds | any reputable supplier | N/A | |
PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride) | G-Biosciences | 786-787 | |
Polypropylene Column | any | N/A | |
Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 1610394 | |
Protein G resin | Thermo Fisher Scientific | 20399 | |
Rifampicin | Gold Biotechnology Inc | R-120-25 | |
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | G-Biosciences | DG093 | |
Sodium Ascorbate | SIGMA-ALDRICH | A7631-500G | |
Spectrophotometer | any reputable supplier | N/A | |
Titan3 0.75 µm glass fiber filter | ThermoScientific | 40725-GM | |
Tray for peat pellets with dome | any | N/A | |
TRIS Base | J.t.baker | 4109-02 | |
Tris-HCl | Amresco | M108-1KG | |
Tryptone | SIGMA-ALDRICH | 17221 | |
UV lamp | any | N/A | |
Water Soluble All Purpose Plant Food | Miracle-Gro | 2000992 | |
Yeast extract | SIGMA-ALDRICH | 9182 |
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