니코티아나 벤타미안나에서 과도하게 표현된 IgG 융합 단백질의 생산

요약

우리는 니코티아나 벤타미안에서GFP에 융합된 재조합 인간 IgG의 발현, 추출 및 정제를 위한 간단한 방법을 여기에서 설명한다. 이 프로토콜은 열 크로마토그래피를 활용하는 수많은 단백질의 정제 및 시각화로 확장될 수 있습니다. 또한, 이 프로토콜은 직접 및 가상 대학 교육 실험실에 적용되어 프로젝트 기반 탐사를 제공합니다.

초록

다양한 전염성, 대사, 자가면역, 신플라스틱 및 기타 질병에 대한 치료 개입으로서 항체에 대한 수요가 높아지면서 재조합 항체 생산을 위한 효율적인 방법을 개발할 필요성이 증가하고 있다. 2019년 현재, FDA승인 단일클론 항체가 70개 이상 있었으며 기하급수적인 성장 잠재력이 있습니다. 그들의 약속에도 불구하고, 광범위한 사용에 대한 제한 요인은 제조 비용과 복잡성입니다. 잠재적으로 식물은 저비용, 안전하며 쉽게 확장 가능한 단백질 제조 전략을 제공합니다. 니코티아나 벤타미안과 같은 식물은 복잡한 포유류 단백질을 올바르게 접고 조립할 수 없을 뿐만 아니라 포유류 세포 배양에서 제공하는 것과 유사한 중요한 번역 후 수정을 추가할 수 있습니다. 본 작품에서는, 인간 단일클론 항체에 융합된 녹색 형광 단백질(GFP)의 원종 GFP 및 산안정변체를 사용하여, 우리는 N. 벤타미안 식물로부터 의 전체 과도 항체 발현 및 정화 과정을 시각화할 수 있었다. 실험의 목적에 따라 네이티브 GFP 융합은 식물의 발현 단계에서 쉽게 시각화할 수 있으며, 산안정성 GFP 융합은 다운스트림 처리 중에 시각화를 가능하게 합니다. 이 확장 가능하고 간단한 절차는 몇 가지 작은 식물을 사용하여 며칠 만에 고도로 순수한 항체 또는 항체 융합 단백질의 밀리그램 양을 생산하는 단일 연구원에 의해 수행 될 수있다. 이러한 기술은 식물 및 기타 발현 시스템에서 모든 유형의 항체 정제 공정 및 잠재적으로 많은 다른 단백질의 시각화로 확장될 수 있다. 또한, 이러한 기술은 가상 지침에 도움이 될 수 있으며 분자 생물학 기술에 대한 최소한의 사전 경험을 가진 학부 생에 의해 교육 실험실에서 실행될 수 있으며, 실제 응용 프로그램과 프로젝트 기반 탐사를위한 토대를 제공합니다.

서문

업계 보고서에 따르면 미국에서 가장 많이 매출을 기록한 20개 중 13개 약물은 생물학적 제제(단백질 기반 의약품)였으며, 그 중 9개가 항체였습니다. 2019년 현재, 다양한 임상 개발^상에서570개 이상의 항체(Ab) 치료제가^{1,2,3하였다.} 현재 글로벌 Ab 매출은 1,000억 달러를 초과하며, 단일클론 Ab(mAb) 치료제 시장은 2025년^1,4년까지최대 3,000억 달러를 창출할 것으로 예상됩니다. 이러한 높은 수요와 예상 된 수익 증가로, 연구원은 더 높은 품질과 낮은 비용으로, 그 어느 때보 다 큰 규모로 Ab 치료제를 생산하는 방법을 개발하기 위해 노력하고있다. 식물계 발현 시스템은 Ab 치료제^5,6의저렴하고 대규모 제조를 위해 전통적인 포유류 세포주보다 몇 가지 장점이 있다. 식물에서 단백질 치료제의 생산("분자 파밍")은 전통적인 포유류 세포 배양^기술7,8과같이 고가의 생물반응기 또는 세포 배양 시설을 필요로 하지 않는다. 식물은 인간의 병원균을 계약할 수 없으므로 잠재적 오염 을 최소화^{할 수 없습니다 9.} 과도 및 형질 전환 식물 기반 단백질 발현 은 포유류 또는 세균 성 생산 시스템^(10)에대한 저비용 대안으로 활용 될 수있다. 형질 전환 식물은 작물 생산을 위해 선호되지만,이 방법을 사용하여 재조합 단백질 생산은 몇 주에서 몇 달이 필요할 수 있습니다. 주사기 또는 진공 농약침을 통해 바이러스 벡터를 이용한 과도발현의 어드밴스는^{11일,12,13,14일에}원하는 단백질의 각각 소규모 및 대규모 생산을^{허용한다.} 에볼라, 뎅기열 및 지카 및 수많은 다른 재조합 단백질에 대한 mAbs의 생산은 N. 벤타미안 식물^{15,16,17,18,19에서}일시적인 발현을 사용하여 신속하고 효율적으로 생산및 정제되었다. 이러한 상황은 과도 식물 기반 발현을 다중 Ab 치료제 및 이^{프로토콜(20)에서}입증된 방법을 개발하기 위한 매력적인 옵션으로 만든다.

1세대 mAbs는 뮤린 유도체였으며, 인체^{실험(21)에서}사용될 때 비특이적 면역원성으로 귀결되었다. 시간이 지남에 따라, 키메라, 인간화, 그리고 결국, 완전히 인간 복근은 Ab 치료에 의해 유도된 면역원성을 감소시키기 위하여 생성되었다. 불행히도, 이러한 복근 중 일부는 여전히^{글리코실화(21)의}차이로 인해 숙주 면역원성을 유발한다. 식물 공학의 개발은 Ab glycans의 수정을 허용했으며, 이는 Ab의 안정성과 기능이 글리코실화^{상태(22)의}영향을 크게 받을 수 있기 때문에 필수적입니다. 어드밴스는 인간 글리칸을 함유하고 그 결과 대량 생산된 인간 약제^19,21의원하는 생물학적 특성을 포함하는 인간화된 mAbs의 높은 수준의 발현의 식물 시스템에서 생산을 허용하고 있다.

재조합 복근 이외에, Ab 융합 분자 (Ab 퓨전) 최근 수십 년 동안 다양한 목적을 위해 탐구되었습니다. Ab 퓨전은 종종 분자 또는 단백질에 융합된 Ab 또는 Ab 단편으로 구성되며 면역 이펙터^{세포(23)로부터}반응을 유도하도록 설계되었습니다. 이들 분자는암 및 자가면역^{질환(24,25,26,27)과}같은 다양한 병리를 치료하는 잠재적 치료 내정간섭으로 만들어졌다. 재조합 면역 복합체(RIC)는 백신^{지원자(28)로}채용된 또 다른 종류의 Ab 퓨전이다. RI는 Ab fusions의 Fc 영역을 인식하는 면역 계통의 능력을 이용하고 다른 백신^{플랫폼(29,30,31)과}결합될 때 면역원성을 향상시키는 것으로 밝혀졌다.

녹색 형광 단백질 (GFP)은 자외선^32,33에의해 흥분 될 때 녹색 빛을 방출 해파리 Aequorea 빅토리아에서 파생 된 생물 발광 단백질이다. 수년에 걸쳐, 유전자 발현의 시각적 마커로서의 GFP의 사용은 에샤리치아 대장균의 발현에서 N. 벤타미안 식물^{34,35,36,37,38을}포함한 수많은 단백질 발현 시스템으로 확장되었다. GFP와 같은 눈에 보이는 마커는 과학적 개념의 가르침과 학습에 풍부한 영향을 미칩니다. 수많은 엔트리 레벨 학생들은 가르쳐지는 아이디어가 분자 생물학 및 관련 분야^39의개념과 같은 육안으로 보이지 않을 때 과학적 개념을 파악하는 데 어려움을 설명합니다. GFP와 같은 시각적 마커는 과학적 과정과 관련된 정보 처리에 기여할 수 있으며 학생들이 수많은 과학적 개념을 배우는 데 보고하는 어려움을 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다.

GFP는 생체 내에서유전자와 발현을 나타내는 마커로 자주 사용되지만 산성 조건을 사용하는 경우 다운스트림 공정에서 시각화하기가 어렵습니다. 이러한 상황은 주로 GFP가 낮은 pH^40에서구조및 그 결과 형광을 유지하지 않기 때문이다. 일시적인 산성 환경은 단백질 G, 단백질 A 및 단백질 L 크로마토그래피와 같은 다양한 정제 공정에서 종종 요구되며, 종종 Ab 정제^{41,42,43,44에}활용된다. GFP 돌연변이체는 산성 조건 하에서 형광을 유지하기 위해 사용되어 왔다^45,46.

본 원에서 우리는 N. 벤타미안 식물에서 재조합 IgG 융합 단백질의 발현, 추출 및 정제를 위한 간단한 방법을 설명합니다. 우리는 인간화된 IgG 헤비 체인의 N 종단에 융합된 전통적인 GFP를 생산하여 GFP-IgG 융합을 만들었습니다. 동시에, 우리는 인간화 된 IgG 무거운 체인의 N 종기에 산 안정 GFP (asGFP)에 대한 식물 코돈 최적화 서열의 융합을 개발하여 asGFP-IgG 융합을 만들었습니다. GFP-IgG를 생산하는 장점은 발현 중에 표적 단백질의 존재를 시각화하는 기능을 포함하고, asGFP-IgG는 발현 및 추출 단계뿐만 아니라 단백질의 정제 단계에서 재조합 단백질의 존재를 볼 수 있게 한다. 이 프로토콜은 N. benthamiana에서 생산된 다양한 GFP 융합 단백질의 생산, 정제 및 시각화에 적응하고 낮은 pH를 요구하는 크로마토그래피 기술을 사용하여 정제될 수 있다. 이 과정은 또한 잎 재료의 다양한 양에 맞게 조정할 수 있습니다. GFP 또는 asGFP로 태그된 Abs 및 융합 단백질은 치료에 사용되지 않지만, 이러한 방법은 실험 중 대조군으로 유용할 수 있으며, 직접 및 사실상 분자 및 세포 생물학 및 생명 공학을 위한 교육 도구로 더 활용될 수 있습니다.

프로토콜

1. N. 벤타미안 식물 을 재배

1. 토양 토탄 펠릿을 트레이에 놓고 이전에 삶은, 여전히 뜨거운 (~ 40-45 °C), 전체 확장을위한 토탄 펠릿 위에 물을 부어. 펠릿이 완전히 확장된 후 핀셋을 사용하여 각 토탄 펠릿에 2-3 N. 벤타미안 씨앗을 놓습니다.
2. 트레이의 바닥을 덮기 위해 물 에서 약 0.5를 붓습니다. 트레이에 시드 날짜로 레이블을 지정합니다. 매일 모종에 적절한 양의 비료로 물을 계속 합니다. 비료(수용성 다목적 식물 식품) 농도는 일반적으로 2.5-2.8g/L이다.
3. 성장 챔버에 놓을 때 휴미돔 상의로 트레이를 덮습니다. 16h 포토기간과 60% 상대 습도를 가진 23-25°C의 성장 챔버에 시드 토탄 펠릿을 보관하십시오.
4. 1 주일 후, 한 모종으로 각 펠릿을 떠나 여분의 식물을 제거합니다.
5. 식물이 2-3 주 오래되면 각 토탄 펠릿을 수분 제어 토양을 포함하는 개별 냄비로 옮기십시오. 이 데모는 기적-그로 수분 제어 포팅 토양을 사용했습니다.
6. 매일 1 g/L 비료로 물을 섭취하십시오. 토양을 완전히 건조하게 두지 마십시오. 식물은 5-6 주 된 때 침투 할 준비가되어 있습니다.

2. 침투를 위한 아그로박테리움 tumefaciens의 준비

참고: GFP-IgG 융합 구문은 본^제31에기재된 바와 같이 얻을 수 있다. asGFP 유전자는 이 연구 결과로부터 수득및 식물에^{최적화되었다(45)}. 다음 단계는 Bunsen 버너 옆에 수행해야하며 오염을 방지하기 위해 기본 무균 기술을 적용해야합니다.

1. 줄무늬 A. tumefaciens EHA105 항두 노란 왜성 바이러스 (BeYDV)¹⁹ 각 구조에 대한 식물 발현 벡터 (asGFP-IgG, GFP-IgG, 라이트 체인) LB 한천에 글리세롤 주식에서 (10 g/L 트립톤, 10 g/L NaCl, 5 g 효모 추출물, 15 g/L/L/l/ lgar) 5g/ lgar.
2. 30°C 서 인큐베이터에서 하루 동안 성장하십시오. 표준 콜로니 스크린 PCR 프로토콜에 의해 검증을 위해 단일 콜로니를 분리합니다.
3. 각 구문에 대해 검증된 콜로니를 사용합니다. 10mL의 LB 미디어(10g/L 트립톤, 10g/L NaCl, 효모 추출물 5g, 50 μg/mL)로 원뿔튜브를 채웁니다. 다음으로 100 μg/mL 카나마이신의 10 μL을 추가합니다. 대장균 오염을 방지하기 위해 2.5 μg/mL 리팜피신의 10 μL을 추가합니다. 하룻밤 사이에 30°C및 120-150 rpm에서 배양하십시오.
4. 다음 날, 아그로박테리움 배양이 OD₆₀₀ = 0.6-0.9로 성장하면 침투에 사용될 수 있다. 자란 경우(OD₆₀₀ > 1), 1-2mL은 항생제로 신선한 LB로 이전되어야 하며 필요한 OD_600으로성장해야 한다. 초기 배시의 농도에 따라 OD₆₀₀ = 0.6-0.9로 성장하는 데 2 일이 걸릴 수 있습니다.
5. 적절한 OD_600에한 번, 원심분리기에 배양을 배치하고, 20분 동안 4,500 x g, 실온(RT)으로 원심분리로 박테리아를 펠렛한다.
6. 두 샘플모두에서 극치상, 1x 침투 완충제(10mMM 2-(N-morpholino) 에탄설포닉산, 10mM 마그네슘 황산, KOH로 pH 5.5로 조정된 각 펠릿을 최종 OD₆₀₀ = 0.4로 재연한다. 이것은 초기 배양 밀도에 따라 침투 버퍼의 대략 15-45 mL를 취해야 합니다. 각 IgG 퓨전 구조와 라이트 체인 구조의 동일한 볼륨을 결합하여 각 튜브의 구조당 최종 OD₆₀₀ = 0.2를 얻습니다.

3. 바늘없는 주사기 농나무 침전

1. 1단계에서 는 곧게 펴진 종이 클립과 5-6주 된 N. 벤타미안 식물을 가져 가라. 종이 클립의 날카로운 가장자리를 사용하여 adaxial 표면에 있는 잎의 첫 번째 표피 층에 작은 구멍을 만듭니다. 끝까지 구멍을 뚫지 마십시오.
   참고: 하부 잎은 침투가 더 쉬운 반면 식물 의 상단의 잎은 더 어렵습니다. 일반적으로, 재조합 단백질의 발현은 식물의 중간에 있는 잎에서 가장 높으며, 이러한 잎은 또한 덜 괴사합니다.
2. 2단계에서 준비된 아그로박테리움 용액을 바늘없이 1mL 주사기를 채우세요. 주사기의 끝으로 이전 단계에서 만든 구멍을 덮고 천천히 잎 뒤에서 부드러운 반압을 적용하면서 잎에 박테리아를 주입밀어. 주사기에 너무 많은 압력을 가하지 않고 용액이 주입됨에 따라 잎이 어두워지는 것을 지켜보십시오.
3. 잎 부위의 대부분을 최대 3-4배까지 침투하여 과도한 잎 손상으로 인해 단백질 수율을 저해할 수 있습니다. 침투된 식물 잎은 아래쪽 보기에서 대부분 어둡게 나타납니다.
   참고: 이 세균용 용액은 구조당 적어도 3-4 식물에 충분해야 합니다. 폐기하기 전에 남은 세균용 용액을 자동 복제합니다.

4. 침투한 N. 벤타미안나 에서 성장하고 관찰

1. 침수된 식물을 다시 성장 챔버에 놓고 매일 물을 계속합니다.
2. 침투 된 지역에서 클로로시스와 괴사잎을 관찰하십시오. 길고 단파 UV 램프 아래에서 GFP 형광(GFP가 존재하는 경우)에 대한 식물을 관찰한다.
3. 일 4-5 잎에서 두 GFP 구조의 가장 높은 형광을 보여줍니다. 모든 잎을 4-5 dpi(침전 후 일)로 수확하고 총 잎 재료의 무게를 측정합니다.
4. 다운스트림 처리또는 -80°C에서 사용할 준비가 될 때까지 즉시 사용하십시오.

5. 단백질 추출

1. 사용 전에 버퍼와 블렌더 컵을 얼음이나 4°C로 유지하십시오.
2. 식물 재료 1 g 당 2-3 mL의 얼음 냉기 추출 버퍼 (100 m Tris-HCl, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 8 HCl)를 준비하십시오. 추출 직전에 추출 버퍼에 재고(100mMMM)와 50mM 나트륨 아스코르베이트에서 2m mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF)를 추가합니다.
3. 4단계에서 식물 조직을 미리 냉각된 블렌더 컵에 넣습니다. 블렌더 컵에 측정된 양의 냉장 추출 버퍼를 추가합니다(5.2단계에서 나타낸 대로). 블렌더 컵을 블렌더에 놓습니다. 파라필름의 사전 컷 시트를 가지고 블렌더 컵의 상단에 스트레칭. 20초 간격으로 균일성에 블렌딩하여 필요에 따라 블렌드 사이클 간에 잘 저어줍니다.
4. 혼합 된 재료를 비커로 옮기. 교반 바를 넣고 단백질 용해도를 높이고 고체의 강수량을 허용하기 위해 30 분 동안 4 °C에서 저어줍니다.
5. 얼음 위에 깨끗한 비커 위에 미라클로스 2층을 놓고 추출물을 부어 큰 잎 파편을 제거합니다. 모든 추출물을 붓은 후 미라클로스를 접어 잔류 잎 추출물을 짜냅니다. 추출은 눈에 보이는 미립자 없이 어두운 녹색 으로 표시 되어야 합니다.
6. 이 샘플의 50 μL을 새로운 1.5mL 튜브로 옮기고 나중에 분석을 위해 "총 추출물"을 라벨로 지정합니다. 추출물을 원심분리기 튜브로 옮기습니다. 원심 분리기 는 20 분, 4 °C에 대한 16,000 x g에서 식물 추출물의 나머지를 원심 분리하고 원적 튜브로 상류체를 전송합니다.
7. 50mL 주사기 및 주사기 유리 섬유 필터(0.75 μm)를 사용하여 수용성 추출물을 필터링합니다.
8. 원심분리 후 시료의 50μL을 수집하고, 나중에 분석을 위해 "용해 추출물"이라고 라벨을 붙입니다.

6. 단백질 G 컬럼 크로마토그래피 시술

참고: 여기서 설명된 프로토콜은 피어스 단백질 G 아가로즈 수지의 중력 흐름 크로마토그래피를 위한 것입니다. 다른 수지를 사용하는 경우 제조업체의 조정 지침을 참조하십시오. 수지가 건조하게 달리지 말고 모든 액체가 배수되는 것을 방지하십시오. 필요에 따라 콘센트를 다시 캡합니다.

1. 20mL의 시료를 포함하는 폴리프로필렌 컬럼을 설정합니다.
2. 대상 면역글로불린 유형및 수지에 대한 선호도에 따라 필요한 슬러리의 양을 추정한다. 일반적으로, 총 슬러리 3mL1.5 mL 침대 부피를 가진 Ab의 여러 밀리그램의 정화에 충분하다.
3. 필요한 양의 재일시 슬러리를 덮은 기둥에 조심스럽게 붓습니다. 열 아래쪽에서 열 콘센트를 열고 대부분의 버퍼가 사라질 때까지 드레인할 수 있습니다.
4. 즉시 10mL의 워시 버퍼 1x PBS(137m NaCl, 2.7m KCl, 10mM Na₂HPO_4,1.8 mM KH₂PO_4,pH 7.4)를 위에 붓습니다. 이 세척 단계를 2x로 배출하고 반복하십시오.
5. 5단계에서 컬럼에 여과된 샘플을 적용하고 흐름통과(이후 분석을 위해 50μl의 흐름)를 수집합니다. Ab가 수지에 바인딩되지 않은 경우 흐름의 나머지 부분을 저장합니다.
   참고: 새 열에 흐름을 다시 적용해도 일반적으로 좋은 수율을 초래하지는 않습니다. 따라서 새로운 잎 재료로 시작하는 것이 좋습니다.
6. 수지 10mL1x PBS로 두 번 세척하여 비특이적 결합을 줄입니다. 원하는 경우, 버퍼가 컬럼을 통해 배수됨에 따라 알리쿼트 50 μL의 세척을 알리쿼트하여 대상 Ab가 세척 버퍼로 용출되지 않았는지 확인합니다.
7. pH 8에서 멸균 1M Tris-HCl의 125 μL로 5개의 튜브를 설정하고 라벨을 부착합니다. 이는 잠재적인 구조적 변화를 피하기 위해 산성 용출 버퍼에서 Abs를 중화시키는 것입니다. 또는 2M Tris 베이스의 30 μL을 추가하여 희석된 시료를 적게 얻습니다.
   주의: 용출 시 UV 광이 시각화에 사용될 수 있습니다. 용출 기간 동안 이 작업을 수행할 필요가 없습니다. 자외선을 사용하는 경우 눈과 피부의 손상을 피하기 위해 적절한 PPE를 착용하십시오. 용출 단계에서 는 UV 광을 사용할 필요가 없습니다.
8. 열에 5mL의 용출 버퍼(100m 글리신, HCl로 pH 2.5)를 적용하여 복근을 엘테우트와 이전 단계로부터 지정된 각 튜브에 1mL 분획을 수집한다.
9. 20mL의 워시 버퍼를 적용하고 10mL의 워시 버퍼를 적용하여 컬럼을 즉시 재생합니다. 수지는 장시간 산성 환경에 남아 있지 않은지 확인합니다. 용출은 형광으로 나타나야하며, 종종 가장 높은 형광은 두 번째 용출에서 보이지만 추출에서 추출에 이르기까지 다를 수 있습니다.
10. 수지용으로 는 PBS에서 20% 에탄올의 10mL로 수지세척하여 중간배수하게 합니다. 상단을 다시 한 다음 열의 아래쪽을 다시 한 번 4°C에서 똑바로 세워보세요.
    참고: 일반적으로 단백질 G 수지는 효율성의 상당한 손실 없이 최대 10회 재사용할 수 있습니다. 특정 세부 사항에 대 한 제조업체의 지침을 참조 하십시오.
11. 용출 버퍼를 공백으로 사용하여 280 nm에서 흡광도를 측정하여 분광계를 사용하여 Ab 농도를 결정합니다. 추가 분석을 위해 각 분획의 -80°C 및 알리쿼트 50 μL에 용출을 저장합니다.

7. GFP-Ig 융합 검출을 위한 SDS-PAGE

1. SDS-PAGE를 설정하기 전에 모든 샘플을 준비합니다.
   1. 샘플 버퍼 4 μL 추가 (6 x 감소 샘플 버퍼: 글리세롤 3.0 mL, DTT의 0.93 g, SDS 1 g, 4 x Tris의 7 mL (pH 6.8) 0.5 M, 브로모페놀 블루의 1.2 mg); (6x 비감소 시료 버퍼: 글리세롤 3.0mL, SDS 1g, 4x Tris(pH 6.8) 0.5M, 브로모페놀 블루 1.2 mg) ~ 20 μL(총 추출물, 용해 추출물, 유동, 세척, 모든 용출 분수) 분석. 튜브 캡을 안전하게 고정해야 합니다.
   2. 끓는 수조에서 5분 동안 만 샘플을 줄이는 데 만 치료한 다음 얼음에 5분 동안 샘플을 넣습니다. 마이크로센심분리기에서 샘플을 ~5s로 스핀하고 각 샘플의 20 μL을 젤 우물에 수집하는 순서로 로드합니다. 이중 색 단백질 사다리의 3 μL을 별도의 우물에 적재합니다.
2. 원하는 단백질 밴드 분리에 일정한 100 V에서 SDS-PAGE 젤을 실행; 약 1.5시간이 걸립니다. 단백질 분리의 지표로 사다리를 모니터링합니다.
3. GFP 형광을 관찰하기 위해 UV 아래의 젤을 시각화합니다.
4. 원하는 경우, 각 샘플에서 총 단백질을 평가하기 위해 Coomassie 얼룩으로 젤을 얼룩지게합니다. 대안적으로, 특정 Abs를 사용하여 표적 단백질을 평가하기 위하여 서쪽 얼룩을 능력을 발휘합니다.
   참고: 쿠마시 염색 및 서부 얼룩 모두 표준 프로토콜^47,48에따라 수행될 수 있다.

결과

이 연구는 재조합 단백질을 생성하고 다운스트림 프로세스 전반에 걸쳐 시각화하는 쉽고 빠른 방법을 보여줍니다. N. 벤타미안을 사용하고 제공된 프로토콜을 따르고, 여기에 설명된 재조합 단백질 생산은 1주일 이내에 달성될 수 있다. 식물 발현, 추출 및 정제의 전체 워크플로우가 도 1에표시됩니다. 2주 된 묘목, 4주 된 식물, 6주 된 식물의 식물 성장 단계는 각각 도 ...

토론

이러한 프로토콜은 N. 벤타미안 식물에서 생산되는 임의의 재조합 Ab 또는 재조합 단백질의 시각적 검증을 위해 활용될 수 있으며, 여기에는 열 정화^{목적42,43,44에}대한 산성 환경에 일시적으로 노출이 필요한 단백질이 포함된다. 더욱이, 다른 발현 시스템에서 다른 단백질에 asGFP의 융합은 실험적인 시각화 및 교육을 위한...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL syringe	any	N/A
50 mL syringe	any	N/A
Agar	SIGMA-ALDRICH	A5306
Blender with cups	any	N/A
Bromophenol blue	Bio-Rad	1610404
DTT (DL-Dithiothreitol)	MP BIOMEDICALS	219482101
EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid	SIGMA-ALDRICH	E-6760
Ethanol	any	N/A
Glycerol	G-Biosciences	BTNM-0037
Glycine	SIGMA-ALDRICH	G7126-500G
HCl (Hydrochloric acid)	EMD MILLIPORE CORPORATION	HX0603-4
Heating block	any reputable supplier	N/A
Jiffy-7 727 w/hole peat pellets	Hummert International	14237000
Kanamycin	Gold Biotechnology Inc	K-120-100
KCl (Potassium Chloride)	SIGMA-ALDRICH	P9541-500G
KH2PO4 (Potassium Phosphate)	J.t.baker	3248-05
KOH (Potassium Hydroxide)	VWR	BDH0262
Magnesium sulfate heptahydrate	SIGMA-ALDRICH	M2773
MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid)	SIGMA-ALDRICH	M8250
Miracloth	Millipore	4 75855-1R
Moisture control potting mix	Miracle-Gro	755783
Na2HPO4 (Sodium Phosphate)	J.t.baker	3827-01
NaCl (Sodium Chloride)	Santa Cruz Biotechnology	sc-203274C
Nicotiana benthamiana seeds	any reputable supplier	N/A
PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride)	G-Biosciences	786-787
Polypropylene Column	any	N/A
Precision Plus Protein Dual Color Standards	Bio-Rad	1610394
Protein G resin	Thermo Fisher Scientific	20399
Rifampicin	Gold Biotechnology Inc	R-120-25
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)	G-Biosciences	DG093
Sodium Ascorbate	SIGMA-ALDRICH	A7631-500G
Spectrophotometer	any reputable supplier	N/A
Titan3 0.75 µm glass fiber filter	ThermoScientific	40725-GM
Tray for peat pellets with dome	any	N/A
TRIS Base	J.t.baker	4109-02
Tris-HCl	Amresco	M108-1KG
Tryptone	SIGMA-ALDRICH	17221
UV lamp	any	N/A
Water Soluble All Purpose Plant Food	Miracle-Gro	2000992
Yeast extract	SIGMA-ALDRICH	9182