Autoren
Kontakt

Anmelden

Zum Anzeigen dieser Inhalte ist ein JoVE-Abonnement erforderlich. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.

In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir beschreiben hier eine einfache Methode für die Expression, Extraktion und Reinigung von rekombinantem menschlichen IgG, das mit GFP in Nicotiana benthamianaverschmolzen wird. Dieses Protokoll kann auf die Reinigung und Visualisierung zahlreicher Proteine erweitert werden, die die Säulenchromatographie nutzen. Darüber hinaus ist das Protokoll an das persönlich und virtuelle College-Lehrlabor anpassbar und bietet projektbasierte Erkundungen.

Zusammenfassung

Die hohe Nachfrage nach Antikörpern als therapeutische Interventionen für verschiedene infektiöse, metabolische, autoimmune, neoplastische und andere Krankheiten erzeugt einen wachsenden Bedarf an der Entwicklung effizienter Methoden für die rekombinante Antikörperproduktion. Im Jahr 2019 gab es mehr als 70 FDA-zugelassene monoklonale Antikörper, und es gibt exponentielles Wachstumspotenzial. Trotz ihres Versprechens sind die Herstellungskosten und die Komplexität die Produktionskosten und die Komplexität begrenzend. Potenziell bieten Anlagen kostengünstige, sichere und leicht skalierbare Proteinherstellungsstrategien. Pflanzen wie Nicotiana benthamiana können nicht nur komplexe Säugetierproteine richtig falten und zusammenfügen, sondern auch kritische posttranslationale Modifikationen hinzufügen, die denen von Säugetierzellkulturen ähneln. In dieser Arbeit konnten wir mit nativem GFP und einer säurestabilen Variante des grünen fluoreszierenden Proteins (GFP), die mit menschlichen monoklonalen Antikörpern verschmolzen ist, den gesamten transienten Antikörperexpression und -reinigungsprozess aus N. benthamiana-Pflanzen visualisieren. Je nach Zweck des Experiments kann die native GFP-Fusion eine einfachere Visualisierung während der Expressionsphase in den Pflanzen gewährleisten, während die säurestabile GFP-Fusion eine Visualisierung während der Nachverarbeitung ermöglicht. Dieses skalierbare und unkomplizierte Verfahren kann von einem einzelnen Forscher durchgeführt werden, um Milligramm-Mengen an hochreinen Antikörper- oder Antikörperfusionsproteinen innerhalb weniger Tage mit nur wenigen kleinen Pflanzen herzustellen. Eine solche Technik kann auf die Visualisierung jeder Art von Antikörper-Reinigungsprozess und potenziell viele andere Proteine erweitert werden, sowohl in pflanzlichen als auch in anderen Expressionssystemen. Darüber hinaus können diese Techniken virtuellen Anweisungen zugute kommen und in einem Lehrlabor von Studenten durchgeführt werden, die über minimale Vorkenntnisse mit molekularbiologischen Techniken verfügen und eine Grundlage für projektbasierte Sonnungen mit realen Anwendungen bieten.

Einleitung

Branchenberichten zufolge handelte es sich bei dreizehn der zwanzig am höchsten einumsatzreichsten Arzneimittel in den Vereinigten Staaten um Biologika (Protein-basierte Arzneimittel), von denen neun Antikörper waren. Im Jahr 2019 gab es über 570 Antikörper (Ab) Therapeutika in verschiedenen klinischen Entwicklungsphasen1,2,3. Der aktuelle weltweite Ab-Umsatz übersteigt 100 Milliarden US-Dollar, und der monoklonale Ab (mAb) therapeutische Markt wird bis 2025 voraussichtlich bis zu 300 Milliarden US-Dollar generieren1,4. Angesichts der hohen Nachfrage und der prognostizierten Umsatzsteigerungen haben forscher daran gearbeitet, Wege zu entwickeln, Ab-Therapeutika in immer größerem Maßstab zu produzieren, mit höherer Qualität und niedrigeren Kosten. Pflanzenbasierte Expressionssysteme haben mehrere Vorteile gegenüber traditionellen Säugetierzelllinien für die erschwingliche und großflächige Herstellung von Ab-Therapeutika5,6. Die Herstellung von Proteintherapeutika in Pflanzen ("molekulares Pharming") erfordert keine teuren Bioreaktoren oder Zellkulturanlagen wie die traditionellen Säugetierzellkulturtechniken7,8. Pflanzen können sich keine menschlichen Krankheitserreger anstecken, wodurch eine mögliche Kontamination minimiert wird9. Sowohl die transiente als auch die transgene pflanzliche Proteinexpression können als kostengünstigere Alternativen zu Säugetier- oder Bakterienproduktionssystemen verwendet werden10. Obwohl transgene Pflanzen für die Pflanzenproduktion bevorzugt werden, kann die rekombinante Proteinproduktion mit dieser Methode Wochen bis Monate in Anspruch erfordern. Fortschritte in der transienten Expression mit viralen Vektoren durch Spritze oder Vakuum-Agroinfiltration ermöglichen eine kleine bzw. großflächige Produktion des gewünschten Proteins in Tagen11,12,13,14. Die Produktion von mAbs gegen Ebola, Dengue und, Zika und zahlreiche andere rekombinante Proteine wurden schnell und effizient mit transienter Expression in N. benthamiana Pflanzen15,16,17,18,19hergestellt und gereinigt. Diese Umstände machen vorübergehende pflanzenbasierte Expression zu einer attraktiven Option für die Entwicklung mehrerer Ab-Therapeutika und der in diesem Protokoll20demonstrierten Methoden.

MAbs der ersten Generation waren von muriner Ableitung, was zu einer unspezifischen Immunogenität führte, wenn sie in Studien am Menschen verwendet wurde21. Im Laufe der Zeit wurden chimäre, humanisierte und schließlich vollständig menschliche Abs produziert, um die durch Ab-Therapeutika induzierte Immunogenität zu mindern. Leider verursachen einige dieser Abs immer noch Wirtsimmunogenität aufgrund von Unterschieden in der Glykosylierung21. Entwicklungen im Anlagenbau haben die Modifikation von Abglycanen ermöglicht, was unerlässlich ist, da die Stabilität und Funktion eines Ab durch seinen Glykosylierungszustand erheblich beeinträchtigt werden kann22. Fortschritte haben die Produktion von hochgradig erdtämmigen Humangups, die menschliche Glykane und daraus resultierend die gewünschten biologischen Merkmale eines massenproduzierten Humanarzneimittels enthalten, in Pflanzensystemen ermöglicht19,21.

Neben rekombinanten Abs wurden in den letzten Jahrzehnten auch Ab-Fusionsmoleküle (Ab-Fusionen) für verschiedene Zwecke erforscht. Ab-Fusionen bestehen oft aus einem Ab- oder Ab-Fragment, das mit einem Molekül oder Protein verschmolzen ist, und sind so konzipiert, dass sie Reaktionen aus Immuneffektorzellen entlocken23. Diese Moleküle wurden als mögliche therapeutische Interventionen zur Behandlung verschiedener Pathologien wie Krebs und Autoimmunerkrankungen24,25,26,27geschaffen. Rekombinante Immunkomplexe (RICs) sind eine weitere Klasse von Ab-Fusionen, die als Impfstoffkandidaten eingesetzt wurden28. RICs nutzen die Fähigkeit des Immunsystems, Fc-Regionen von Ab-Fusionen zu erkennen und haben festgestellt, dass sie die Immunogenität verbessern, wenn sie mit anderen Impfstoffplattformen kombiniert werden29,30,31.

Green Fluorescent Protein (GFP) ist ein biolumineszierendes Protein aus der Qualle Aequorea Victoria, die grünes Licht aussendet, wenn sie von ultraviolettem Licht angeregt wird32,33. Im Laufe der Jahre hat sich die Verwendung von GFP als visueller Marker der Genexpression von der Expression in Escherichia coli auf zahlreiche Proteinexpressionssysteme ausgeweitet, darunter N. Benthamiana-Pflanzen 34,35,36,37,38. Sichtbare Marker wie GFP haben reichlich Auswirkungen auf das Lehren und Erlernen wissenschaftlicher Konzepte. Zahlreiche Einsteiger beschreiben Schwierigkeiten beim Verständnis wissenschaftlicher Konzepte, wenn die gelehrte Idee mit bloßem Auge nicht sichtbar ist, wie die Konzepte der Molekularbiologie und verwandter Felder39. Visuelle Marker, wie GFP, können somit zur Verarbeitung von Informationen im Zusammenhang mit den wissenschaftlichen Prozessen beitragen und dazu beitragen, die Schwierigkeiten zu lindern, die Studenten beim Erlernen zahlreicher wissenschaftlicher Konzepte melden.

Obwohl GFP oft als Marker verwendet wird, um Gen und Expression in vivoanzuzeigen, ist es schwierig, es in den nachgelagerten Prozessen zu visualisieren, wenn saure Bedingungen verwendet werden. Dieser Umstand liegt in erster Linie daran, dass das GFP seine Struktur und die resultierende Fluoreszenz bei einem niedrigenpH-Wert von 40nicht aufrechterhält. Vorübergehende saure Umgebungen sind oft in verschiedenen Reinigungsprozessen erforderlich, wie Protein G, Protein A und Protein L Chromatographie, oft für Ab-Reinigung41,42,43,44verwendet. GFP-Mutanten wurden verwendet, um Fluoreszenz unter sauren Bedingungen zu behalten45,46.

Hierin beschreiben wir eine einfache Methode zur Expression, Extraktion und Reinigung rekombinanter IgG-Fusionsproteine in N. benthamiana-Pflanzen. Wir produzierten traditionelle GFP, die mit dem N-Terminus einer humanisierten IgG-Schwerenkette verschmolzen wurde, wodurch eine GFP-IgG-Fusion entstand. Gleichzeitig entwickelten wir die Verschmelzung einer pflanzenkodonoptimierten Sequenz für ein säurestabiles GFP (asGFP) zum N-Terminus einer humanisierten IgG-Schwerkette, wodurch eine asGFP-IgG-Fusion entsteht. Zu den Vorteilen der Herstellung von GFP-IgG gehört die Möglichkeit, das Vorhandensein eines Zielproteins während der Expression zu visualisieren, während als GFP-IgG das Vorhandensein von rekombinantem Protein nicht nur in den Expressions- und Extraktionsschritten, sondern auch in den Reinigungsschritten des Proteins sieht. Dieses Protokoll kann für die Herstellung, Reinigung und Visualisierung einer Reihe von GFP-Fusionsproteinen angepasst werden, die in N. benthamiana hergestellt und mit Chromatographie-Techniken gereinigt werden, die einen niedrigen pH-Wert erfordern. Der Prozess kann auch auf verschiedene Mengen an Blattmaterial zugeschnitten werden. Während Abs und Fusionsproteine, die mit GFP oder asGFP markiert sind, nicht für Therapien verwendet werden sollen, können diese Methoden als Kontrollen während der Experimente nützlich sein und können auch als Lehrmittel für molekulare und zelluläre Biologie und Biotechnologie weiter genutzt werden, sowohl persönlich als auch virtuell.

Protokoll

1. Kultivieren N. benthamiana Pflanzen

  1. Bodentorfpellets auf eine Schale legen und zuvor gekochtes, noch heißes Wasser über die Torfpellets gießen, um sie vollständig auszupflanzen. Nachdem Pellets vollständig erweitert sind, legen Sie 2-3 N. Benthamiana Samen auf jedem Torfpellet mit Pinzette.
  2. Gießen Sie etwa 0,5 in Wasser, um den Boden des Tabletts zu bedecken. Beschriften Sie das Fach mit dem Aussaatdatum. Die Sämlinge täglich mit entsprechenden Mengen Dünger weiter gießen. Die Düngemittelkonzentration (wasserlösliche Allzweckpflanzennahrung) beträgt in der Regel 2,5-2,8 g/L.
  3. Bedecken Sie das Tablett mit einem Humidome-Top, wenn es in der Wachstumskammer platziert wird. Bewahren Sie die gesäten Torfpellets in der Wachstumskammer bei 23-25 °C auf, mit einer 16-stunden-Photoperiode und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60 %.
  4. Nach einer Woche, entfernen Sie zusätzliche Pflanzen verlassen jedes Pellet mit nur einem Sämling.
  5. Wenn die Pflanzen 2-3 Wochen alt sind, übertragen Sie jedes Torfpellet in einen einzelnen Topf, der feuchtigkeitsbefangene Böden enthält. Diese Demonstration verwendet Miracle-Gro Feuchtigkeitskontrolle Blumenerde.
  6. Täglich mit 1 g/L Dünger gießen. Lassen Sie den Boden niemals völlig trocken. Pflanzen sind bereit für die Infiltration, wenn sie 5-6 Wochen alt sind.

2. Herstellung von Agrobacterium tumefaciens zur Infiltration

HINWEIS: GFP-IgG-Fusionskonstrukte können wie in dieser Zeitung31beschrieben erhalten werden. Das asGFP-Gen wurde aus dieser Studie gewonnen und pflanzenoptimiert45. Die folgenden Schritte müssen neben einem Bunsenbrenner durchgeführt werden, und grundlegende aseptische Techniken sollten angewendet werden, um eine Kontamination zu vermeiden.

  1. Streifen A. tumefaciens EHA105 mit Bohnen-Gelb-Zwergvirus (BeYDV)19 Pflanzenexpressionsvektor für jedes Konstrukt (asGFP-IgG, GFP-IgG, Lichtkette) aus einem Glycerinbestand auf LB-Agar (10 g/L Tryptone, 10 g/L NaCl, 5 g Hefeextrakt, 15 g/L Agar, 50 g/m Kanamik)
  2. Wachsen Sie für einen Tag in einem 30 °C stehenden Inkubator. Isolieren Sie eine einzelne Kolonie zur Überprüfung durch Standard-Kolonie-Bildschirm PCR-Protokoll.
  3. Verwenden Sie für jedes Konstrukt eine verifizierte Kolonie. Konusierrohr mit 10 ml LB-Medien (10 g/L Trypton, 10 g/L NaCl, 5 g Hefeextrakt, 50 g/ml) füllen. Als Nächstes fügen Sie 10 l von 100 g/ml Kanamycin hinzu. Fügen Sie 10 l von 2,5 g/ml Rifampicin hinzu, um eine E. coli-Kontamination zu verhindern. Bei 30°C und 120-150 Rpm über Nacht inkubieren.
  4. Am nächsten Tag, wenn die Agrobacterium-Kultur auf OD600 = 0,6-0,9 angebaut wird, kann sie zur Infiltration verwendet werden. Wenn es überwuchert ist (OD600 > 1), 1-2 ml sollten auf frischeLB mit Antibiotika übertragen und auf die erforderliche OD600angebaut werden. Je nach Konzentration der Anfangskultur kann es möglicherweise zwei Tage dauern, bis od600 = 0,6-0,9 anwachsen.
  5. Einmal bei entsprechendem OD600,legen Sie die Kulturen in eine Zentrifuge, und pellet die Bakterien durch Zentrifugation bei 4.500 x g für 20 min, Raumtemperatur (RT).
  6. Dekantischer Überstand aus beiden Proben und dann jedes Pellet im 1x Infiltrationspuffer (10 mM 2-(N-morpholino) Ethansulfonsäure, 10 mM Magnesiumsulfat, angepasst auf pH 5,5 mit KOH), um endgültige OD600 = 0,4 zu erhalten. Dies sollte je nach anfänglicher Kulturdichte etwa 15-45 ml Infiltrationspuffer in Anspruch nehmen. Kombinieren Sie gleiche Volumina jedes IgG-Fusionskonstrukts mit dem Lichtkettenkonstrukt, um endgültige OD600 = 0,2 pro Konstrukt in jedem Rohr zu erhalten.

3. Nadellose Spritzen-Agrofiltration

  1. Nehmen Sie eine begradigte Büroklammer und 5-6 Wochen alte N. benthamiana Pflanzen aus Schritt 1. Mit der scharfen Kante der Büroklammer, machen Sie eine kleine Punktion in der ersten epidermalen Schicht des Blattes auf der adaxialen Oberfläche. Vermeiden Sie es, es den ganzen Weg durch zu punktieren.
    HINWEIS: Die unteren Blätter sind leichter für die Infiltration, während die Blätter auf der Oberseite der Pflanze härter sind. Im Allgemeinen ist die Expression rekombinanter Proteine in den Blättern in der Mitte einer Pflanze am höchsten, und diese Blätter werden auch weniger nekrotisch.
  2. Füllen Sie eine 1 ml Spritze ohne Nadel, mit der vorbereiteten Agrobacterium-Lösung aus Schritt 2. Bedecken Sie das Loch, das im vorherigen Schritt gemacht wurde, mit dem Ende der Spritze und schieben Sie langsam, um die Bakterien in das Blatt zu injizieren, während Sie sanften Gegendruck von hinter dem Blatt anwenden. Beobachten Sie, wie sich das Blatt verdunkelt, während die Lösung injiziert wird, ohne zu viel Druck auf die Spritze auszuüben.
  3. Versuchen Sie, den größten Teil der Blattfläche maximal 3-4 Mal zu infiltrieren – übermäßige Blattschäden können die Proteinausbeute behindern. Das infiltrierte Pflanzenblatt erscheint von der unteren Ansicht meist dunkel.
    HINWEIS: Diese bakterielle Lösung sollte für mindestens 3-4 Pflanzen pro Konstrukt ausreichen. Autoklavjede verbleibende bakterielle Lösung vor dem Verwerfen.

4. Wachsen und beobachten Sie die infiltrierte N. benthamiana

  1. Infiltrierte Pflanzen wieder in die Wachstumskammer geben und täglich weiter wässern.
  2. Beobachten Sie die Blätter für Chlorose und Nekrose in infiltrierten Gebieten. Beobachten Sie Pflanzen zur GFP-Fluoreszenz (wenn GFP vorhanden ist) unter einer lang- und kurzwelligen UV-Lampe.
  3. Tag 4-5 zeigt die höchste Fluoreszenz beider GFP-Konstrukte in den Blättern. Ernten Sie alle Blätter bei 4-5 dpi (Tage nach der Infiltration) und wiegen Sie das gesamte Blattmaterial.
  4. Verwenden Sie es sofort für die Weiterverarbeitung oder lagern Sie bei -80 °C, bis sie einsatzbereit sind.

5. Proteinextraktion

  1. Puffer und Mixerbecher vor Gebrauch auf Eis oder bei 4 °C aufbewahren.
  2. 2-3 ml eiskalter Extraktionspuffer (100 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 8 mit HCl) pro 1 g Pflanzenmaterial vorbereiten. Fügen Sie 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) aus Lager (100 mM) und 50 mM Natriumascorbat kurz vor der Extraktion in den Extraktionspuffer.
  3. Pflanzengewebe aus Schritt 4 in den vorgekühlten Mixerbecher legen. Fügen Sie dem Mixerbecher eine gemessene Menge an gekühltem Extraktionspuffer hinzu (wie in Schritt 5.2 angegeben). Legen Sie den Mixerbecher auf den Mixer. Nehmen Sie ein vorgeschnittenes Blatt Parafilm und dehnen Sie es über die Oberseite des Mixer-Bechers. Mit 20-Sekunden-Intervallen zu Homogenität verschmelzen und bei Bedarf zwischen den Mischzyklen gut rühren.
  4. Übertragen Sie Mischmaterial auf einen Becher. Fügen Sie einen Rührstab hinzu und rühren Sie bei 4 °C für 30 min, um die Proteinlöslichkeit zu verbessern und die Ausfällung von Feststoffen zu ermöglichen.
  5. Legen Sie 2 Schichten Miracloth über einen sauberen Becher auf Eis und gießen Sie den Extrakt durch sie, um große Blattablagerungen zu entfernen. Nachdem der Extrakt gegossen ist, falten Sie das Miracloth, um den Restblattextrakt zu drücken. Der Extrakt sollte dunkelgrün ohne sichtbare Partikel erscheinen.
  6. Übertragen Sie 50 l dieser Probe in ein neues 1,5 ml-Rohr und etikettieren Sie "Gesamtextrakt" für eine spätere Analyse. Übertragen Sie den Extrakt in Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie den Rest des Pflanzenextrakts bei 16.000 x g für 20 min, 4 °C und übertragen Sie den Überstand in ein konisches Rohr.
  7. Filtern Sie den löslichen Extrakt mit einer 50 ml Spritze und einem Spritzenglasfaserfilter (0,75 m).
  8. Sammeln Sie 50 l einer Probe nach zentrifugieren, Etikett "löslicher Extrakt" für spätere Analyse.

6. Protein-G-Säulenchromatographie-Verfahren

HINWEIS: Das hier beschriebene Protokoll ist für die Schwerkraft-Flow-Chromatographie mit Pierce Protein G Agaroseharz. Wenn Sie ein anderes Harz verwenden, beachten Sie die Anweisungen des Herstellers für Anpassungen. Lassen Sie das Harz niemals trocken laufen und verhindern Sie, dass die gesamte Flüssigkeit abfließt. Recap den Ausgang nach Bedarf.

  1. Richten Sie eine Polypropylensäule ein, die 20 ml Proben enthält.
  2. Schätzen Sie die benötigte Güllemenge in Abhängigkeit vom Zielimmunglobulintyp und seiner Affinität zum Harz. Im Allgemeinen reichen 3 ml Gesamtgülle mit 1,5 ml Bettvolumen für die Reinigung mehrerer Milligramm Ab aus.
  3. Gießen Sie vorsichtig die erforderliche Menge an resuspendierter Gülle in die gekappte Säule. Öffnen Sie den Spaltenausgang vom unteren Rand der Spalte, und lassen Sie ihn abfließen, bis der größte Teil des Puffers weg ist.
  4. Sofort 10 ml Waschpuffer 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7.4 mit HCl) oben drauf gießen. Lassen Sie es abtropfen und wiederholen Sie diesen Waschschritt 2x.
  5. Wenden Sie die gefilterte Probe aus Schritt 5 auf die Spalte an, und erfassen Sie den Durchfluss – aliquot 50 L Flowthrough für eine spätere Analyse. Speichern Sie den Rest des Durchflusses, falls das Ab nicht an das Harz bindet.
    ANMERKUNG: Das erneute Anwenden von Flowthrough auf eine neue Spalte führt in der Regel nicht zu einer guten Ausbeute. Daher wird empfohlen, mit neuem Blattmaterial zu beginnen.
  6. Waschen Sie das Harz zweimal mit 10 ml 1x PBS, um die unspezifische Bindung zu reduzieren. Falls gewünscht, wird aliquot 50 l waschen, wenn der Puffer durch die Spalte abfließt, um sicherzustellen, dass das Ziel Ab nicht mit einem Waschpuffer eluiert wird.
  7. 5 Tuben mit 125 l sterilem 1 M Tris-HCl bei pH 8 aufstellen und beschriften. Dies ist die Abs im sauren Elutionspuffer zu neutralisieren, um mögliche strukturelle Veränderungen zu vermeiden. Alternativ können Sie 30 L von 2 M Tris-Basis hinzufügen, um eine weniger verdünnte Probe zu erhalten.
    VORSICHT: Während der Elution kann UV-Licht zur Visualisierung verwendet werden. Dies muss nicht für die Dauer der Elution erfolgen. Wenn UV verwendet wird, achten Sie darauf, geeignete PSA zu tragen, um Schäden an Augen und Haut zu vermeiden. Ein UV-Licht muss während des Elutionsschritts nicht verwendet werden.
  8. Elute the Abs durch Auftragen von 5 ml Elutionspuffer (100 mM Glycin, pH 2,5 mit HCl) auf die Säule und sammeln Sie 1 ml Brüche auf jedes vorgesehene Rohr aus dem vorherigen Schritt.
  9. Regenerieren Sie die Säule sofort, indem Sie 20 ml Waschpuffer auftragen, gefolgt von 10 ml Waschpuffer. Stellen Sie sicher, dass das Harz nicht längere Zeit in einer sauren Umgebung zurückgelassen wird. Elutionen sollten fluoreszierend erscheinen, oft ist die höchste Fluoreszenz in der zweiten Elution zu sehen, kann aber von Extraktion zu Extraktion variieren.
  10. Zur Lagerung das Harz mit 10 ml 20% Ethanol in PBS waschen und halbabfließen lassen. Recap die Oberseite, dann die Unterseite der Säule, und halten Sie aufrecht bei 4 °C.
    HINWEIS: Im Allgemeinen können Protein-G-Harze bis zu 10-mal ohne signifikanten Effizienzverlust wiederverwendet werden. Spezifische Details finden Sie in den Herstellerrichtlinien.
  11. Bestimmen Sie die Ab-Konzentration mit einem Spektralphotometer, indem Sie die Absorption bei 280 nm messen, indem Sie den Elutionspuffer als Rohling verwenden. Bewahren Sie die Eluate in -80 °C und aliquot 50 l jeder Fraktion zur weiteren Analyse in einem separaten Rohr auf.

7. SDS-PAGE zur GFP-Ig-Fusionserkennung

  1. Bereiten Sie alle Beispiele vor, bevor Sie die SDS-PAGE einrichten.
    1. Fügen Sie 4 l Probenpuffer hinzu (6x reduzierender Probenpuffer: 3,0 ml Glycerin, 0,93 g DTT, 1 g SDS, 7 ml 4x Tris (pH 6,8) 0,5 M, 1,2 mg Bromphenolblau); (6x nicht reduzierender Probenpuffer: 3,0 ml Glycerin, 1 g SDS, 7 ml 4x Tris (pH 6,8) 0,5 M, 1,2 mg Bromphenolblau) bis 20 l jeder Probe (Gesamtextrakt, löslicher Extrakt, Durchfluss, Waschen, alle Elutionsfraktionen) für die Analyse. Stellen Sie sicher, dass Rohrkappen sicher befestigt sind.
    2. Nur 5 min in einem kochenden Wasserbad reduzierende Proben behandeln und dann proben für 5 min auf Eis legen. Spinnen Sie Proben in einer Mikrozentrifuge für 5 s und laden Sie 20 l jeder Probe in der Reihenfolge der Entnahme in die Gelbrunnen. Laden Sie 3 l dual-color Proteinleiter in einem separaten Brunnen.
  2. Führen Sie das SDS-PAGE Gel mit einer konstanten 100 V auf gewünschte Proteinbandtrennung; es dauert etwa 1,5 Stunden. Überwachen Sie die Leiter als Indikator für die Proteintrennung.
  3. Visualisieren Sie das Gel unter dem UV, um die GFP-Fluoreszenz zu beobachten.
  4. Auf Wunsch färben Sie das Gel mit Coomassie-Färbung, um das Gesamtprotein in jeder Probe zu bewerten. Alternativ können Sie einen westlichen Blot ausführen, um das Zielprotein mit bestimmten Abs zu bewerten.
    HINWEIS: Sowohl Coomassie Färbung und Western Blot kann durch die folgenden Standardprotokolle47,48durchgeführt werden.

Ergebnisse

Diese Studie zeigt eine einfache und schnelle Methode zur Herstellung rekombinanter Proteine und deren Visualisierung in allen nachgelagerten Prozessen. Mit N. benthamiana und nach dem bereitgestellten Protokoll kann die hier beschriebene rekombinante Proteinproduktion in weniger als einer Woche erreicht werden. Der gesamte Arbeitsablauf von Pflanzenexpression, Extraktion und Reinigung ist in Abbildung 1dargestellt. Die Stadien des Pflanzenwachstums von 2 Wochen alten Sämlingen, 4 ...

Diskussion

Dieses Protokoll kann für die visuelle Überprüfung von rekombinanten Ab oder rekombinanten Protein enduden in N. benthamiana Pflanzen verwendet werden, einschließlich derjenigen, die vorübergehende Exposition gegenüber sauren Umgebungen für Säulenreinigung Zwecke42,43,44. Darüber hinaus kann die Fusion von asGFP mit anderen Proteinen in verschiedenen Expressionssystemen ein nützliches Werkzeug für experimente...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Wir danken Maria Pia DiPalma für die Bearbeitung des Videos. Wir danken auch dem Office of Educational Outreach and Student Services an der Arizona State University für die großzügige Unterstützung der Publikationsgebühren. Die Forschung für dieses Protokoll wurde von der School of Life Sciences, Arizona State University, unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
5 mL syringeanyN/A
50 mL syringeanyN/A
AgarSIGMA-ALDRICHA5306
Blender with cupsanyN/A
Bromophenol blueBio-Rad1610404
DTT (DL-Dithiothreitol)MP BIOMEDICALS219482101
EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acidSIGMA-ALDRICHE-6760
EthanolanyN/A
GlycerolG-BiosciencesBTNM-0037
GlycineSIGMA-ALDRICHG7126-500G
HCl (Hydrochloric acid)EMD MILLIPORE CORPORATIONHX0603-4
Heating blockany reputable supplierN/A
Jiffy-7 727 w/hole peat pelletsHummert International14237000
KanamycinGold Biotechnology IncK-120-100
KCl (Potassium Chloride)SIGMA-ALDRICHP9541-500G
KH2PO4 (Potassium Phosphate)J.t.baker3248-05
KOH (Potassium Hydroxide)VWRBDH0262
Magnesium sulfate heptahydrateSIGMA-ALDRICHM2773
MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid)SIGMA-ALDRICHM8250
MiraclothMillipore4 75855-1R
Moisture control potting mixMiracle-Gro755783
Na2HPO4 (Sodium Phosphate)J.t.baker3827-01
NaCl (Sodium Chloride)Santa Cruz Biotechnologysc-203274C
Nicotiana benthamiana seedsany reputable supplierN/A
PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride)G-Biosciences786-787
Polypropylene ColumnanyN/A
Precision Plus Protein Dual Color StandardsBio-Rad1610394
Protein G resinThermo Fisher Scientific20399
RifampicinGold Biotechnology IncR-120-25
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)G-BiosciencesDG093
Sodium AscorbateSIGMA-ALDRICHA7631-500G
Spectrophotometerany reputable supplierN/A
Titan3 0.75 µm glass fiber filterThermoScientific40725-GM
Tray for peat pellets with domeanyN/A
TRIS BaseJ.t.baker4109-02
Tris-HClAmrescoM108-1KG
TryptoneSIGMA-ALDRICH17221
UV lampanyN/A
Water Soluble All Purpose Plant FoodMiracle-Gro2000992
Yeast extractSIGMA-ALDRICH9182

Referenzen

  1. Lu, R. M., et al. Development of therapeutic antibodies for the treatment of diseases. Journal of Biomedical Science. 27 (1), (2020).
  2. Kaplon, H., Reichert, J. M. Antibodies to watch in 2019. mAbs. 11 (2), 219-238 (2019).
  3. The top 20 drugs by U.S. sales. FiercePharma Available from: https://www.fiercepharma.com/special-report/top-20-drugs-by-2018-u-s-sales (2018)
  4. Grilo, A. L., Mantalaris, A. The Increasingly Human and Profitable Monoclonal Antibody Market. Trends in Biotechnology. 37 (1), 9-16 (2019).
  5. Kim, M. -. Y., et al. Novel vaccination approach for dengue infection based on recombinant immune complex universal platform. Vaccine. 33 (15), 1830-1838 (2015).
  6. Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. Transgenic plants in the biopharmaceutical market. Expert Opinion on Emerging Drugs. 10 (1), 185-218 (2005).
  7. Stoger, E., Fischer, R., Moloney, M., Ma, J. K. -. C. Plant Molecular Pharming for the Treatment of Chronic and Infectious Diseases. Annual Review of Plant Biology. 65 (1), 743-768 (2014).
  8. Buyel, J. F., Fischer, R. Predictive models for transient protein expression in tobacco (Nicotiana tabacum L.) can optimize process time, yield, and downstream costs. Biotechnology and Bioengineering. 109 (10), 2575-2588 (2012).
  9. Yao, J., Weng, Y., Dickey, A., Wang, K. Y. Plants as factories for human pharmaceuticals: Applications and challenges. International Journal of Molecular Sciences. 16 (12), 28549-28565 (2015).
  10. Mor, T. S., Moon, Y. -. S., Palmer, K. E., Mason, H. S. Geminivirus vectors for high-level expression of foreign proteins in plant cells. Biotechnology and Bioengineering. 81 (4), 430-437 (2003).
  11. Hefferon, K. L. Plant virus expression vectors set the stage as production platforms for biopharmaceutical proteins. Virology. 433 (1), 1-6 (2012).
  12. Yamamoto, T., et al. Improvement of the transient expression system for production of recombinant proteins in plants. Scientific Reports. 8 (1), 4755 (2018).
  13. Zhong, G. Y., et al. Commercial production of aprotinin in transgenic maize seeds. Molecular Breeding. 5 (4), 345-356 (1999).
  14. Giddings, G., Allison, G., Brooks, D., Carter, A. Transgenic plants as factories for biopharmaceuticals. Nature Biotechnology. 18 (11), 1151-1155 (2000).
  15. Fulton, A., Lai, H., Chen, Q., Zhang, C. Purification of monoclonal antibody against Ebola GP1 protein expressed in Nicotiana benthamiana. Journal of Chromatography A. 1389, 128-132 (2015).
  16. Diamos, A., et al. A highly expressing, soluble, and stable plant-made IgG fusion carrying Zika virus envelope domain III elicits potent immunogenic responses in mice without adjuvant. Frontiers in immunology. 3140 (11), (2020).
  17. Hunter, J. G. L., et al. Evaluation of a toxoid fusion protein vaccine produced in plants to protect poultry against necrotic enteritis. PeerJ. 2019 (3), 6600 (2019).
  18. Dent, M., et al. Plant-produced anti-dengue virus monoclonal antibodies exhibit reduced antibody-dependent enhancement of infection activity. Journal of General Virology. 97 (12), 3280-3290 (2016).
  19. Diamos, A. G., et al. High Level Production of Monoclonal Antibodies Using an Optimized Plant Expression System. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 472 (2020).
  20. Olinger, G. G., et al. Delayed treatment of Ebola virus infection with plant-derived monoclonal antibodies provides protection in rhesus macaques. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), 18030-18035 (2012).
  21. Mastrangeli, R., Palinsky, W., Bierau, H. Glycoengineered antibodies: towards the next-generation of immunotherapeutics. Glycobiology. 29 (3), 199-210 (2019).
  22. Montero-Morales, L., Steinkellner, H. Advanced Plant-Based Glycan Engineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 81 (2018).
  23. Joosten, V., Lokman, C., vanden Hondel, C. A. M. J. J., Punt, P. J. The production of antibody fragments and antibody fusion proteins by yeasts and filamentous fungi. Microbial Cell Factories. 2 (1), 1-15 (2003).
  24. Müller, D. Antibody fusions with immunomodulatory proteins for cancer therapy. Pharmacology and Therapeutics. 154, 57-66 (2015).
  25. Bootz, F., Neri, D. Immunocytokines: A novel class of products for the treatment of chronic inflammation and autoimmune conditions. Drug Discovery Today. 21 (1), 180-189 (2016).
  26. Jafari, R., Zolbanin, N. M., Rafatpanah, H., Majidi, J., Kazemi, T. Fc-fusion Proteins in Therapy: An Updated View. Current Medicinal Chemistry. 24 (12), (2017).
  27. Brinkmann, U., Kontermann, R. E. The making of bispecific antibodies. mAbs. 9 (2), 182-212 (2017).
  28. Mason, H. S. Recombinant immune complexes as versatile and potent vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 12 (4), 988-989 (2016).
  29. Mason, H. S. Recombinant immune complexes as versatile and potent vaccines. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 12 (4), 988-989 (2016).
  30. Diamos, A. G., et al. Vaccine synergy with virus-like particle and immune complex platforms for delivery of human papillomavirus L2 antigen. Vaccine. 37 (1), 137-144 (2019).
  31. Diamos, A. G., et al. Codelivery of improved immune complex and virus-like particle vaccines containing Zika virus envelope domain III synergistically enhances immunogenicity. Vaccine. 38 (18), 3455-3463 (2020).
  32. Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene. 111 (2), 229-233 (1992).
  33. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  34. Palm, M., Baumstark-Khan, C., Horneck, G. Green Fluorescent Protein (GFP) Expression in Mammalian Cells After UV-Irradiation. Fundamentals for the Assessment of Risks from Environmental Radiation. , 311-316 (1999).
  35. Paemeleire, K., et al. Intercellular calcium waves in HeLa cells expressing GFP-labeled connexin 43, 32, or 26. Molecular Biology of the Cell. 11 (5), 1815-1827 (2000).
  36. Harper, B. K., Stewart, C. N. Patterns of Green Fluorescent Protein Expression in Transgenic Plants. Plant Molecular Biology Reporter. 18 (2), 141 (2000).
  37. Kaishima, M., Ishii, J., Matsuno, T., Fukuda, N., Kondo, A. Expression of varied GFPs in Saccharomyces cerevisiae: Codon optimization yields stronger than expected expression and fluorescence intensity. Scientific Reports. 6, (2016).
  38. . Glow in the Dark: Fluorescent Proteins as Cell and Tissue-Specific Markers in Plants Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21772029/ (2020)
  39. Mnguni, L. E. The theoretical cognitive process of visualization for science education. SpringerPlus. 3 (1), 1-9 (2014).
  40. Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120 (24), 4247-4260 (2007).
  41. Bjorck, L., Kronvall, G. Purification and some properties of streptococcal protein G, a novel IgG-Binding reagent. The Journal of Immunology. 133 (2), (1984).
  42. Andrew, S. M., Titus, J. A. Purification of Immunoglobulin G. Current Protocols in Immunology. 21 (1), 1-12 (2001).
  43. Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein A chromatography for antibody purification. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 848 (1), 40-47 (2007).
  44. Vola, R., Lombardi, A., Tarditi, L., Björck, L., Mariani, M. Recombinant proteins L and LG: efficient tools for purification of murine immunoglobulin G fragments. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 668 (2), 209-218 (1995).
  45. Shinoda, H., Ma, Y., Nakashima, R., Sakurai, K., Matsuda, T., Nagai, T. Acid-Tolerant Monomeric GFP from Olindias formosa. Cell Chemical Biology. 25 (3), 330-338 (2018).
  46. Roberts, T. M., et al. Identification and Characterisation of a pH-stable GFP. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  47. Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
  48. Mahmood, T., Western Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  49. Vessoni Penna, T. C., Ishii, M., Cholewa, O., de Souza, L. C. Thermal characteristics of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) extracted from Escherichia coli. Letters in Applied Microbiology. 38 (2), 135-139 (2004).
  50. Kang, S. J., Park, E. A., Lee, D. H., Hong, K. W. Comparison of the stability of eGFP displayed on the Bacillus subtilis spore surface using CotB and C-terminally truncated CotB proteins as an anchoring motif under extreme conditions. Applied Biological Chemistry. 62 (1), 41 (2019).
  51. Kuta, D. D., Tripathi, L. Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer. African Journal of Biotechnology. 4 (8), 752-757 (2005).
  52. Qiusheng, Z., Bao, J., Likun, L., Xianhua, X. Effects of antioxidants on the plant regeneration and GUS expressive frequency of peanut (Arachis hypogaea) explants by Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 81 (1), 83-90 (2005).
  53. Diamos, A. G., Rosenthal, S. H., Mason, H. S. H.S. 5' and 3' Untranslated Regions Strongly Enhance Performance of Geminiviral Replicons in Nicotiana benthamiana Leaves. Frontiers in Plant Science. 7, 200 (2016).
  54. Huang, Z., Chen, Q., Hjelm, B., Arntzen, C., Mason, H. A DNA replicon system for rapid high-level production of virus-like particles in plants. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 706-714 (2009).
  55. Diamos, A. G., Mason, H. S. Modifying the Replication of Geminiviral Vectors Reduces Cell Death and Enhances Expression of Biopharmaceutical Proteins in Nicotiana benthamiana Leaves. Frontiers in Plant Science. 9, 1974 (2019).
  56. Gordon-Kamm, W., et al. Stimulation of the cell cycle and maize transformation by disruption of the plant retinoblastoma pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11975-11980 (2002).
  57. Villemont, E., Dubois, F., Sangwan, R. S., Vasseur, G., Bourgeois, Y., Sangwan-Norreel, B. S. Role of the host cell cycle in the Agrobacterium-mediated genetic transformation of Petunia: Evidence of an S-phase control mechanism for T-DNA transfer. Planta. 201 (2), 160-172 (1997).
  58. Regnard, G. L., Halley-Stott, R. P., Tanzer, F. L., Hitzeroth, I. I., Rybicki, E. P. High level protein expression in plants through the use of a novel autonomously replicating geminivirus shuttle vector. Plant Biotechnology Journal. 8 (1), 38-46 (2010).
  59. Chen, Q., He, J., Phoolcharoen, W., Mason, H. S. Geminiviral vectors based on bean yellow dwarf virus for production of vaccine antigens and monoclonal antibodies in plants. Human Vaccines. 7 (3), 331-338 (2011).
  60. Morton, T. G., Gold, A. J., Sullivan, W. M. Influence of Overwatering and Fertilization on Nitrogen Losses from Home Lawns. Journal of Environmental Quality. 17 (1), 124-130 (1988).
  61. Brown, J. C. Iron Chlorosis in Plants. Advances in Agronomy. 13, 329-369 (1961).
  62. Morton, E. R., Fuqua, C. Laboratory Maintenance of Agrobacterium. Current Protocols in Microbiology. , (2012).

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Weitere Artikel entdecken

BiologieAusgabe 167Antik rpermonoklonaler Antik rpermolekulare PharmingAgroinfiltrationtransiente ExpressionNicotiana benthamianagr nes fluoreszierendes Proteins urestabiles gr nes fluoreszierendes ProteinAntik rperfusionIgG FusionProtein G Reinigung

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Kontakt

BIBLIOTHEKS-EMPFEHLUNG

JoVE-Newsletter

Forschung

Lehre

Autoren

Bibliothekare

ÜBER JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten