Produção de Proteínas IgG Fusion Transitóriamente Expressa em Nicotiana benthamiana

Resumo

Descrevemos aqui um método simples de expressão, extração e purificação de IgG humano recombinante fundido ao GFP em Nicotiana benthamiana. Este protocolo pode ser estendido à purificação e visualização de inúmeras proteínas que utilizam cromatografia de coluna. Além disso, o protocolo é adaptável ao laboratório de ensino presencial e virtual universitário, proporcionando exploração baseada em projetos.

Resumo

A alta demanda por anticorpos como intervenções terapêuticas para várias doenças infecciosas, metabólicas, autoimunes, neoplásicas e outras doenças cria uma necessidade crescente de desenvolver métodos eficientes para a produção de anticorpos recombinantes. Em 2019, havia mais de 70 anticorpos monoclonais aprovados pela FDA, e há um potencial de crescimento exponencial. Apesar de sua promessa, fatores limitantes para o uso generalizado são os custos de fabricação e a complexidade. Potencialmente, as plantas oferecem estratégias de fabricação de proteínas de baixo custo, seguras e facilmente escaláveis. Plantas como Nicotiana benthamiana não só podem dobrar e montar proteínas mamíferas complexas, mas também podem adicionar modificações pós-translacionais críticas semelhantes às oferecidas pelas culturas de células mamíferas. Neste trabalho, utilizando GFP nativo e uma variante ácido-estável de proteína fluorescente verde (GFP) fundida a anticorpos monoclonais humanos, pudemos visualizar todo o processo de expressão e purificação de anticorpos transitórios das plantas N. benthamiana. Dependendo do propósito do experimento, a fusão GFP nativa pode garantir uma visualização mais fácil durante a fase de expressão nas plantas, enquanto a fusão GFP ácido-estável permite a visualização durante o processamento a jusante. Este procedimento escalável e simples pode ser realizado por um único pesquisador para produzir quantidades miligramas de proteínas de fusão de anticorpos ou anticorpos altamente puros em questão de dias usando apenas algumas pequenas plantas. Tal técnica pode ser estendida à visualização de qualquer tipo de processo de purificação de anticorpos e potencialmente muitas outras proteínas, tanto em sistemas de vegetação quanto em outros sistemas de expressão. Além disso, essas técnicas podem beneficiar instruções virtuais e serem executadas em um laboratório de ensino por estudantes de graduação que possuem experiência mínima prévia com técnicas de biologia molecular, fornecendo uma base para a exploração baseada em projetos com aplicações reais.

Introdução

Relatórios da indústria indicam que treze dos vinte medicamentos de maior bilheteria nos Estados Unidos eram biológicos (medicamentos à base de proteína), dos quais nove eram anticorpos. Em 2019, foram mais de 570 terapêuticas de anticorpos (Ab) em várias fases de desenvolvimento clínico^1,2,3. As vendas globais globais da Ab excedem 100 bilhões de USD, e o mercado terapêutico monoclonal Ab (mAb) deve gerar até 300 bilhões de USD até 2025^1,4. Com uma demanda tão alta e aumentos projetados na receita, pesquisadores têm trabalhado para desenvolver maneiras de produzir a terapêutica Ab em uma escala cada vez maior, com maior qualidade e custos mais baixos. Os sistemas de expressão à base de plantas têm várias vantagens sobre as linhas tradicionais de células mamíferas para a fabricação acessível e em larga escala da terapêutica Ab^5,6. A produção de terapêutica proteica em plantas ("pharming molecular") não requer bioreatores caros ou instalações de cultura celular, assim como as técnicas tradicionais de cultura celular de mamíferos^7,8. As plantas não podem contrair patógenos humanos, minimizando a contaminação potencial⁹. Tanto a expressão proteica transitória quanto transgênica à base de plantas pode ser utilizada como alternativas de menor custo aos sistemas de produção de mamíferos ou bacterianos¹⁰. Embora as plantas transgênicas sejam preferidas para a produção de culturas, a produção de proteínas recombinantes usando este método pode exigir de semanas a meses. Os avanços na expressão transitória utilizando vetores virais através da seringa ou da agroinfiltração a vácuo permitem a produção em pequena e grande escala, respectivamente, da proteína desejada nos dias^11,12,13,14. A produção de mAbs contra o Ebola, a Dengue e o Zika, e inúmeras outras proteínas recombinantes, foram produzidas e purificadas de forma rápida e eficiente utilizando expressão transitória nas plantas de N. benthamiana ^{15,16,17,18,19}. Essas circunstâncias tornam a expressão transitória baseada em plantas uma opção atraente para o desenvolvimento de múltiplas terapêuticas Ab e os métodos demonstrados neste protocolo²⁰.

Os mAbs de primeira geração eram de derivação de murina, o que resultou em imunogenicidade não específica quando utilizados em testes em humanos²¹. Com o tempo, quiméricos, humanizados e, eventualmente, abs totalmente humanos foram produzidos para diminuir a imunogenicidade induzida pela terapêutica ab. Infelizmente, alguns desses Abs ainda causam imunogenicidade hospedeira devido a diferenças na glicossylation²¹. A evolução da engenharia vegetal permitiu a modificação dos glicos ab, o que é essencial, uma vez que a estabilidade e a função de um Ab podem ser significativamente afetadas pelo seu estado de glicosylation²². Os avanços permitiram a produção em sistemas vegetais de expressão de alto nível de mAbs humanizados, contendo glicanos humanos e, consequentemente, os traços biológicos desejados de um farmacêutico humano produzido em massa^19,21.

Além do Abs recombinante, as moléculas de fusão Ab (fusões Ab) têm sido exploradas para vários propósitos nas últimas décadas. As fusões abs geralmente consistem em um fragmento ab ou ab fundido a uma molécula ou proteína e são projetadas para obter respostas de células efeitos imunológicos²³. Essas moléculas foram criadas como potenciais intervenções terapêuticas para tratar diversas patologias, como câncer e doenças autoimunes^24,25,26,27. Os complexos imunológicos recombinantes (RICs) são outra classe de fusões Ab que têm sido empregadas como candidatos à vacina²⁸. Os RICs aproveitam a capacidade do sistema imunológico de reconhecer regiões de fusões ab e têm sido encontrados para melhorar a imunogenicidade quando combinados com outras plataformas de vacinas^29,30,31.

Proteína Fluorescente Verde (GFP) é uma proteína bioluminescente derivada da água-viva Aequorea Victoria, que emite luz verde quando excitada pela luz ultravioleta^32,33. Ao longo dos anos, o uso do GFP como marcador visual da expressão genética expandiu-se da expressão em Escherichia coli para numerosos sistemas de expressão proteica, incluindo as plantas N. benthamiana ^{34,35,36,37,38}. Marcadores visíveis, como o GFP, têm implicações abundantes no ensino e aprendizagem de conceitos científicos. Inúmeros alunos de nível básico descrevem dificuldades para compreender conceitos científicos quando a ideia que está sendo ensinada não é visível a olho nu, como os conceitos de biologia molecular e campos relacionados³⁹. Marcadores visuais, como o GFP, podem, assim, contribuir para o processamento de informações relacionadas aos processos científicos e podem ajudar a diminuir as dificuldades que os alunos relatam na aprendizagem de inúmeros conceitos científicos.

Embora o GFP seja frequentemente usado como marcador para indicar gene e expressão in vivo,é difícil visualizá-lo nos processos a jusante se usar condições ácidas. Esta circunstância é principalmente porque a GFP não mantém sua estrutura e fluorescência resultante a um pH⁴⁰baixo . Ambientes ácidos temporários são frequentemente necessários em diversos processos de purificação, como proteína G, proteína A e cromatografia proteica L, muitas vezes utilizada para purificação de Ab^41,42,43,44. Mutantes GFP têm sido usados para reter fluorescência sob condições ácidas^45,46.

Aqui descrevemos um método simples de expressão, extração e purificação de proteínas de fusão IgG recombinantes em plantas N. benthamiana. Produzimos gfp tradicional fundido ao N-terminus de uma cadeia pesada IgG humanizada, criando uma fusão GFP-IgG. Simultaneamente, desenvolvemos a fusão de uma sequência otimizada por don de plantas para um GFP ácido-estável (asGFP) para o N-terminus de uma cadeia pesada IgG humanizada, criando uma fusão asGFP-IgG. As vantagens da produção de GFP-IgG incluem a capacidade de visualizar a presença de uma proteína alvo durante a expressão, enquanto asgFP-IgG permite ver a presença de proteína recombinante não apenas nas etapas de expressão e extração, mas também nas etapas de purificação da proteína. Este protocolo pode ser adaptado para a produção, purificação e visualização de uma gama de proteínas de fusão GFP produzidas em N. benthamiana e purificadas usando técnicas de cromatografia que requerem baixo pH. O processo também pode ser adaptado a várias quantidades de material de folha. Embora as proteínas abs e de fusão marcadas com GFP ou asGFP não sejam destinadas a ser usadas para terapias, esses métodos podem ser úteis como controles durante experimentos e também podem ser utilizados como uma ferramenta de ensino para biologia molecular e celular e biotecnologia, tanto presencialmente quanto virtualmente.

Protocolo

1. Cultivar plantas N. benthamiana

1. Coloque as pelotas de turfa do solo em uma bandeja e despeje previamente fervida, ainda quente (~40-45 °C), água sobre as pelotas de turfa para expansão total. Depois que as pelotas forem totalmente expandidas, coloque 2-3 sementes de N. benthamiana em cada pelota de turfa usando pinças.
2. Despeje cerca de 0,5 em água para cobrir o fundo da bandeja. Rotule a bandeja com a data de semeadura. Continue regando as mudas diariamente com quantidades adequadas de fertilizante. A concentração de fertilizantes (alimentos vegetais solúveis em água) é geralmente de 2,5-2,8 g/L.
3. Cubra a bandeja com um topo de humidome quando colocado na câmara de crescimento. Mantenha as pelotas de turfa semeadas na câmara de crescimento a 23-25 °C, com um fotoperíodo de 16 horas e 60% de umidade relativa.
4. Após uma semana, remova plantas extras deixando cada pelota com apenas uma muda.
5. Quando as plantas estiverem com 2-3 semanas de idade, transfira cada pelota de turfa para um pote individual contendo o solo de controle de umidade. Esta demonstração usou o controle de umidade Miracle-Gro em vasos de solo.
6. Água diariamente com fertilizante 1 g/L. Nunca deixe o solo completamente seco. As plantas estão prontas para infiltração quando tiverem de 5 a 6 semanas.

2. Preparação de tumefaciens de agrobacterium para infiltração

NOTA: Os construtos de fusão GFP-IgG podem ser obtidos conforme descrito neste artigo³¹. O gene asGFP foi obtido e otimizado a partir deste estudo⁴⁵. As etapas a seguir devem ser feitas ao lado de um queimador Bunsen, e técnicas assépticas básicas devem ser aplicadas para evitar contaminação.

1. Streak A. tumefaciens EHA105 abrigando vírus anã amarelo-feijão (BeYDV)¹⁹ vetor de expressão vegetal para cada construção (asGFP-IgG, GFP-IgG, cadeia leve) de um estoque de glicerol no ágar LB (10 g/L Tryptone, 10 g/L NaCl, extrato de levedura de 5 g, 15 g/L agar, 50 μg/mL kanamycin).
2. Cresça por um dia em uma incubadora em pé de 30 °C. Isole uma única colônia para verificação pelo protocolo PCR de tela colônia padrão.
3. Use colônia verificada para cada construção. Encha o tubo cônico com 10 mL de mídia LB (10 g/L tryptone, 10 g/L NaCl, 5 g de extrato de levedura, 50 μg/mL). Em seguida, adicione 10 μL de 100 μg/mL kanamycin. Adicione 10 μL de 2,5 μg/mL rifampicina para evitar a contaminação de E. coli. Incubar a 30°C e 120-150 rpm durante a noite.
4. No dia seguinte, se a cultura Agrobacterium for cultivada para OD₆₀₀ = 0,6-0,9, ela poderá ser usada para infiltração. Se for overgrown (OD₆₀₀ > 1), 1-2 mL deve ser transferido para LB fresco com antibióticos e cultivado para o OD₆₀₀necessário . Dependendo da concentração da cultura inicial, pode levar dois dias para crescer até OD₆₀₀ = 0,6-0,9.
5. Uma vez no apropriado OD₆₀₀, coloque as culturas em uma centrífuga, e pelota as bactérias por centrifugação a 4.500 x g por 20 min, temperatura ambiente (RT).
6. Supernante decante de ambas as amostras, e então resuspenda cada pelota em 1x tampão de infiltração (10 mM 2-(N-morpholino) ácido esulfônico, 10 mM sulfato de magnésio, ajustado para pH 5,5 com KOH) para obter o LM_{final 600} = 0,4. Isso deve levar aproximadamente 15-45 mL de tampão de infiltração, dependendo da densidade da cultura inicial. Combine volumes iguais de cada construção de fusão IgG com a construção da cadeia de luz para obter OD_{final 600} = 0,2 por construção em cada tubo.

3. Agroinfiltração de seringas sem agulha

1. Pegue um clipe de papel endireitado e plantas N. benthamiana de 5-6 semanas de idade a partir do passo 1. Usando a borda afiada do clipe de papel, faça uma pequena punção na primeira camada epidérmica da folha na superfície adaxial. Evite perfurar o tempo todo.
   NOTA: As folhas inferiores são mais fáceis de infiltrar, enquanto as folhas na parte superior da planta são mais duras. Geralmente, a expressão de proteínas recombinantes é mais alta nas folhas localizadas no meio de uma planta, e essas folhas também ficam menos necróticas.
2. Encha uma seringa de 1 mL, sem agulha presa, com a solução agrobacterium preparada a partir do passo 2. Cubra o orifício feito na etapa anterior com a extremidade da seringa e empurre lentamente para injetar as bactérias na folha enquanto aplica contrapressão suave por trás da folha. Observe a folha escurecer à medida que a solução é injetada sem aplicar muita pressão sobre a seringa.
3. Tente se infiltrar na maior parte da área da folha em um máximo de 3-4 vezes – danos excessivos nas folhas podem dificultar o rendimento da proteína. A folha de plantas infiltrada aparecerá na maior parte escura da vista inferior.
   NOTA: Esta solução bacteriana deve ser suficiente para pelo menos 3-4 plantas por construção. Autoclave qualquer solução bacteriana restante antes de descartar.

4. Cresça e observe a N. benthamiana infiltrada

1. Coloque plantas infiltradas de volta na câmara de crescimento e continue a regar diariamente.
2. Observe as folhas para clorose e necrose em áreas infiltradas. Observe as plantas para fluorescência GFP (se o GFP estiver presente) sob uma lâmpada UV de ondas longas e curtas.
3. O dia 4-5 mostra a maior fluorescência de ambas as construções de GFP nas folhas. Colher todas as folhas em 4-5 dpi (dias pós-infiltração) e pesar o material total da folha.
4. Use-o imediatamente para processamento a jusante ou armazene a -80 °C até estar pronto para uso.

5. Extração de proteína

1. Mantenha tampões e copos de liquidificador no gelo ou a 4 °C antes de usar.
2. Prepare 2-3 mL de tampão de extração gelada (100 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 8 com HCl) por 1 g de material vegetal. Adicione 2 mM de flúor de fenilmetilsulfonil (PMSF) do estoque (100 mM) e 50 mM de sódio ascorbate ao tampão de extração pouco antes da extração.
3. Coloque o tecido vegetal do passo 4 no copo do liquidificador pré-ciclimado. Adicione uma quantidade medida de tampão de extração refrigerado ao copo do liquidificador (conforme indicado na etapa 5.2). Coloque o copo do liquidificador no liquidificador. Pegue uma folha pré-cortada de parafilm e estique-a sobre a parte superior do copo do liquidificador. Misture à homogeneidade com intervalos de 20 segundos, mexendo bem entre os ciclos de mistura conforme necessário.
4. Transfira material misturado para um béquer. Adicione uma barra de mexida e mexa a 4 °C por 30 minutos para aumentar a solubilidade da proteína e permitir a precipitação de sólidos.
5. Coloque 2 camadas de Miracloth sobre um béquer limpo no gelo e despeje o extrato através dele para remover grandes detritos de folhas. Depois de todo o extrato ser derramado, dobre o Pano de Mira para espremer o extrato residual da folha. O extrato deve parecer verde escuro sem partículas visíveis.
6. Transfira 50 μL desta amostra para um novo tubo de 1,5 mL e rotule "extrato total" para análise posterior. Transfira o extrato para tubos de centrífuga. Centrifugar o restante do extrato vegetal a 16.000 x g por 20 min, 4 °C e transferir o sobrenante para um tubo cônico.
7. Filtre o extrato solúvel utilizando uma seringa de 50 mL e filtro de fibra de vidro de seringa (0,75 μm).
8. Colete 50 μL de uma amostra após a centrifugação, rotular "extrato solúvel" para análise posterior.

6. Procedimento de cromatografia da coluna proteína G

NOTA: O protocolo descrito aqui é para cromatografia de fluxo de gravidade usando resina de agarose Pierce Protein G. Se usar uma resina diferente, consulte as instruções do fabricante para ajustes. Nunca deixe a resina secar e evite que todo o líquido se escorra. Recapitulando a tomada conforme necessário.

1. Configure uma coluna de polipropileno que contém 20 mL de amostra.
2. Estimar a quantidade de chorume necessária dependendo do tipo de imunoglobulina alvo e sua afinidade com a resina. Geralmente, 3 mL de chorume total com volume de cama de 1,5 mL é suficiente para a purificação de vários miligramas de Ab.
3. Despeje cuidadosamente a quantidade necessária de chorume resuspended na coluna tampada. Abra a saída da coluna a partir da parte inferior da coluna e deixe-a drenar até que a maior parte do buffer se vá.
4. Despeje imediatamente 10 mL de tampão de lavagem 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄, pH 7.4 com HCl) na parte superior. Deixe escorrer e repita esta etapa de lavagem 2x.
5. Aplique a amostra filtrada da etapa 5 para a coluna e colete o fluxo — aliquot 50 μL de fluxo para análise posterior. Guarde o resto do fluxo no caso de o Ab não se ligar à resina.
   NOTA: Reaplicar fluxo através de uma nova coluna geralmente não resulta em um bom rendimento; por isso é aconselhável começar com novo material de folha.
6. Lave a resina duas vezes com 10 mL de 1x PBS para reduzir a ligação não específica. Se desejar, alíquota de 50 μL de lavagem à medida que o buffer escorre pela coluna para verificar se o ab alvo não está elucido com um tampão de lavagem.
7. Configurar e rotular cinco tubos com 125 μL de estéril 1 M Tris-HCl em pH 8. Isto é para neutralizar o Abs no tampão de eluição ácida para evitar possíveis mudanças estruturais. Alternativamente, adicione 30 μL de base de 2 M Tris para obter uma amostra menos diluída.
   ATENÇÃO: Durante a eluição, a luz UV pode ser usada para visualização. Isso não precisa ser feito durante a elução. Se o UV estiver sendo usado, certifique-se de usar EPI apropriado para evitar danos aos olhos e à pele. Uma luz UV não precisa ser usada durante a etapa de eluição.
8. Elute o Abs aplicando 5 mL de tampão de elução (100 mM de glicina, pH 2.5 com HCl) na coluna e coletar frações de 1 mL a cada tubo designado da etapa anterior.
9. Regenere imediatamente a coluna aplicando 20 mL de tampão de lavagem, seguido por 10 mL de tampão de lavagem. Certifique-se de que a resina não seja deixada em um ambiente ácido por um tempo prolongado. As eluções devem parecer fluorescentes, muitas vezes a maior fluorescência é vista na segunda elução, mas pode variar de extração para extração.
10. Para armazenamento, lave a resina com 10 mL de 20% de etanol no PBS e deixe escorrer no meio do caminho. Recapitule a parte superior, depois a parte inferior da coluna, e mantenha-se ereto a 4 °C.
    NOTA: Geralmente, as resinas G da proteína podem ser reutilizadas até 10 vezes sem perda significativa de eficiência. Consulte as diretrizes do fabricante para obter detalhes específicos.
11. Determine a concentração de Ab usando um espectrofotômetro medindo a absorvância a 280 nm, usando o tampão de elução como um branco. Armazene os eluatos em -80 °C e aliquot 50 μL de cada fração a um tubo separado para análise posterior.

7. SDS-PAGE para detecção de fusão GFP-Ig

1. Prepare todas as amostras antes de configurar o SDS-PAGE.
   1. Adicionar 4 μL de tampão de amostra (6x reduzindo o tampão amostra: 3,0 mL de glicerol, 0,93 g de DTT, 1 g de SDS, 7 mL de 4x Tris (pH 6.8) 0,5 M, 1,2 mg de azul bromofenol); (6x tampão amostral não redutor: 3,0 mL de glicerol, 1 g de SDS, 7 mL de 4x Tris (pH 6,8) 0,5 M, 1,2 mg de azul bromofenol) a 20 μL de cada amostra (extrato total, extrato solúvel, fluxo de fluxo, lavagem, todas as frações de elução) para análise. Certifique-se de que as tampas do tubo estão bem fixadas.
   2. Trate apenas amostras redutoras por 5 minutos em um banho de água fervente, e depois coloque amostras por 5 minutos no gelo. Gire amostras em um microcentrifuge para ~5 s e carregue 20 μL de cada amostra na ordem de coleta nos poços de gel. Carregue 3 μL de escada de proteína de cor dupla em um poço separado.
2. Execute o gel SDS-PAGE a 100 V constantes até a separação desejada da banda de proteína; leva cerca de 1,5 horas. Monitore a escada como um indicador de separação de proteínas.
3. Visualize o gel sob o UV para observar a fluorescência GFP.
4. Se desejar, manche o gel com a mancha de Coomassie para avaliar a proteína total em cada amostra. Alternativamente, realize a mancha ocidental para avaliar a proteína alvo usando abdominais específicos.
   NOTA: Tanto a coloração coomassie quanto a mancha ocidental podem ser realizadas seguindo os protocolos padrão^47,48.

Resultados

Este estudo demonstra um método fácil e rápido para produzir proteínas recombinantes e visualizá-las em todos os processos a jusante. Usando N. benthamiana e seguindo o protocolo fornecido, a produção de proteína recombinante descrita aqui pode ser alcançada em menos de uma semana. O fluxo de trabalho global da expressão, extração e purificação da planta é mostrado na Figura 1. Os estágios de crescimento vegetal de mudas de 2 semanas, plantas de 4 semanas de idade e ...

Discussão

Este protocolo pode ser utilizado para a verificação visual de qualquer ab recombinante ou proteína recombinante produzida em plantas N. benthamiana, incluindo aquelas que requerem exposição temporária a ambientes ácidos para fins de purificação de^{colunas 42,43,44}. Além disso, a fusão do asGFP para outras proteínas em diferentes sistemas de expressão pode ser uma ferramenta útil para visualização experim...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL syringe	any	N/A
50 mL syringe	any	N/A
Agar	SIGMA-ALDRICH	A5306
Blender with cups	any	N/A
Bromophenol blue	Bio-Rad	1610404
DTT (DL-Dithiothreitol)	MP BIOMEDICALS	219482101
EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid	SIGMA-ALDRICH	E-6760
Ethanol	any	N/A
Glycerol	G-Biosciences	BTNM-0037
Glycine	SIGMA-ALDRICH	G7126-500G
HCl (Hydrochloric acid)	EMD MILLIPORE CORPORATION	HX0603-4
Heating block	any reputable supplier	N/A
Jiffy-7 727 w/hole peat pellets	Hummert International	14237000
Kanamycin	Gold Biotechnology Inc	K-120-100
KCl (Potassium Chloride)	SIGMA-ALDRICH	P9541-500G
KH2PO4 (Potassium Phosphate)	J.t.baker	3248-05
KOH (Potassium Hydroxide)	VWR	BDH0262
Magnesium sulfate heptahydrate	SIGMA-ALDRICH	M2773
MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid)	SIGMA-ALDRICH	M8250
Miracloth	Millipore	4 75855-1R
Moisture control potting mix	Miracle-Gro	755783
Na2HPO4 (Sodium Phosphate)	J.t.baker	3827-01
NaCl (Sodium Chloride)	Santa Cruz Biotechnology	sc-203274C
Nicotiana benthamiana seeds	any reputable supplier	N/A
PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride)	G-Biosciences	786-787
Polypropylene Column	any	N/A
Precision Plus Protein Dual Color Standards	Bio-Rad	1610394
Protein G resin	Thermo Fisher Scientific	20399
Rifampicin	Gold Biotechnology Inc	R-120-25
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)	G-Biosciences	DG093
Sodium Ascorbate	SIGMA-ALDRICH	A7631-500G
Spectrophotometer	any reputable supplier	N/A
Titan3 0.75 µm glass fiber filter	ThermoScientific	40725-GM
Tray for peat pellets with dome	any	N/A
TRIS Base	J.t.baker	4109-02
Tris-HCl	Amresco	M108-1KG
Tryptone	SIGMA-ALDRICH	17221
UV lamp	any	N/A
Water Soluble All Purpose Plant Food	Miracle-Gro	2000992
Yeast extract	SIGMA-ALDRICH	9182