在尼科蒂亚娜本 thamiana中瞬态表达IgG融合蛋白的生产

摘要

我们在这里描述了一个简单的方法，表达，提取和纯化重组人类IgG融合到GGFP 在尼科蒂亚娜本thamiana。该协议可以扩展到使用柱色谱的众多蛋白质的纯化和可视化。此外，该协议还适用于本学院教学实验室的亲上和虚拟教学实验室，提供基于项目的探索。

摘要

对抗体作为各种传染性、代谢性、自身免疫性、肿瘤性和其他疾病的治疗干预措施的高需求，对开发有效的重组抗体生产方法的需求日益增长。截至2019年，有70多个FDA批准的单克隆抗体，并且有指数增长的潜力。尽管他们承诺，广泛使用的限制因素是制造成本和复杂性。工厂可能提供低成本、安全和易于扩展的蛋白质制造策略。像 Nicotiana benthamiana 这样的植物不仅能够正确折叠和组装复杂的哺乳动物蛋白质，还可以添加与哺乳动物细胞培养物类似的关键的翻译后修饰。在这项工作中，通过使用原生GP和绿色荧光蛋白（GFP）与人单克隆抗体融合的酸稳定变种，我们能够可视化来自 N.benthamiana 植物的整个瞬态抗体表达和纯化过程。根据实验的目的，本机 GFP 融合可以确保在植物的表达阶段更容易可视化，而酸稳定的 GFP 融合允许在下游处理期间实现可视化。这种可扩展和直接的程序可以由单个研究人员执行，只需几天就使用少数小植物就产生毫克量的高纯抗体或抗体融合蛋白。这种技术可以扩展到任何类型的抗体纯化过程和潜在的许多其他蛋白质的可视化，无论是植物和其他表达系统。此外，这些技术可以有利于虚拟指令，并在教学实验室由拥有分子生物学技术经验最少的本科生在教学实验室中执行，为基于项目的探索和实际应用奠定了基础。

引言

行业报告显示，在美国20种最毛额的药物中，有13种是生物制剂（蛋白质为基础的药物），其中9种是抗体。截至2019年，在1、2、3等不同临床开发阶段，有570多种抗体^{（Ab）治疗。}目前全球Ab销售额超过1000亿美元，到2025年¹月4日，单克隆Ab（mAb）治疗市场有望创造高达3000^亿美元。由于需求如此之高，预计收入将增加，研究人员一直在努力开发各种方法，以更高的质量和更低的成本，在更大范围下生产Ab疗法。植物表达系统比传统的哺乳动物细胞系具有若干优势，可以负担得起和大规模制造Ab治疗^剂5，6。在植物中生产蛋白质疗法（"分子法基"）不需要像传统的哺乳动物细胞培养技术^7、8那样需要昂贵的生物反应器或细胞^培养设施。植物不能收缩人类病原体，最大限度地减少潜在的^污染。瞬态和转基因植物蛋白表达都可以作为哺乳动物或细菌生产系统的低成本替代品^。虽然转基因植物是作物生产的首选，但使用这种方法重组蛋白质的生产可能需要数周到数月的时间。使用病毒载体通过注射器或真空农业渗透的瞬态表达方面的进步，允许在第^{11天、第12天、第13}天、^第14天分别对所需的蛋白质进行小规模^{和大规模生产}。在N.Benthamiana植物^{15、16、17、18、19中，}利用瞬态表达^，生产了埃博拉、登革热和寨卡和许多其他重组蛋白的mAbs。这些情况使得瞬态植物表达成为开发多种Ab疗法的有吸引力的选择，并且本协议^{20中演示的方法}。

第一代mAbs是喃自语衍生的，在^{人体试验21}中使用时导致非特异性免疫原性。随着时间的推移，嵌合，人性化，并最终，完全人类Abs产生，以减轻免疫原性诱导Ab治疗。不幸的是，其中一些Abs仍然导致宿主免疫原性，由于糖基化^21的差异。植物工程的发展允许对Ab甘油进行改造，这一点至关重要，因为Ab的稳定性和功能可能受到其糖化状态^{22的显著影响}。进步使得植物系统中能够生产出含有人类甘油的高水平表达，并因此产生了大量生产的人类药物^{19、21所需的生物特性}。

近几十年来，除了重组Abs之外，Ab聚变分子（Ab融合）还被探索用于各种目的。Ab融合通常由融合到分子或蛋白质的Ab或Ab片段组成，旨在引起免疫效应细胞^23的反应。这些分子已被创建为潜在的治疗干预措施，以治疗各种病理，如癌症和自身免疫性疾病24，25，26，27。重组免疫复合物（RICs）是另一类Ab融合，已被采用作为疫苗候选^28。RIC利用免疫系统识别Ab融合的Fc区域的能力，并被发现与其他疫苗平台^{29，30，31相结合，以提高免疫原性}。

绿色荧光蛋白（GFP）是一种生物发光蛋白，源自维多利亚水母，当被紫外线^{照射时发出绿光32，33。}多年来，GFP作为基因表达的视觉标记的使用已经从大肠杆菌的表达扩展到许多蛋白质表达系统，包括N.Benthamiana植物34，35，36，37，38。可见标记，如GP，对科学概念的教学和学习有着丰富的意义。许多入门级学生描述在所教导的想法肉眼看不见时，如分子生物学的概念和相关领域³⁹时，掌握科学概念的困难。因此，视觉标记（如GP）有助于处理与科学过程有关的信息，并有助于减轻学生报告学习许多科学概念时遇到的困难。

虽然GP经常被用作体内指示基因和表达的标记物，但如果使用酸性条件，很难在下游过程中显示它。这种情况的主要原因是GP不保持其结构和由此产生的荧光在低^pH40。在各种纯化过程中，通常需要临时酸性环境，如蛋白质G、蛋白质 A和蛋白质L色谱，通常用于Ab纯化41、42、43、44。GFP突变体已用于在酸性条件下保持荧光^45，46。

在这里，我们描述了一个简单的方法，用于表达、提取和纯化重组IgG融合 蛋白在N.Benthamiana植物 。我们生产传统的GP融合到人性化IgG重链的N术语，创造了一个GP-IgG融合。同时，我们开发了一种植物共融优化序列的融合，用于酸性稳定 GFP （asGFP） 与人性化 IgG 重链的 N 术语，从而创建 asGFP-IgG 融合。生产GFP-IgG的优点包括能够在表达过程中可视化目标蛋白的存在，而SigFP-IgG则允许在表达和提取步骤中，而且在蛋白质的纯化步骤中看到重组蛋白的存在。该协议可用于生产、纯化和可视化一系列在 N. benthamiana 中生产的 GFP 融合蛋白， 并使用需要低 pH 值的色谱技术进行纯化。该工艺还可以针对各种数量的叶料进行定制。虽然用GFP或 asGFP 标记的 Abs 和融合蛋白并不可用于治疗，但这些方法在实验期间可用作控制，还可以作为分子和细胞生物学和生物技术的教学工具，无论是亲自还是虚拟。

研究方案

1. 培育 N. 本特塔米亚纳植物

1. 将土壤泥炭颗粒放在托盘上，将以前煮沸、仍然热（+40-45 °C）的泥浆倒在泥炭颗粒上，进行完全膨胀。颗粒完全膨胀后，使用钳子将 2-3 N. 本特纳米纳种子放在每个泥炭颗粒上。
2. 倒入约0.5入水以盖住托盘底部。将托盘与播种日期标记。继续每天用适当数量的肥料给幼苗浇水。肥料（水溶性多用途植物食品）浓度一般为2.5-2.8克/升。
3. 放入生长室时，用湿润罩顶部盖住托盘。将生长室的种子泥炭颗粒保持23-25°C，具有16小时光度和60%的相对湿度。
4. 一周后，去除额外的植物，让每个颗粒只留下一个幼苗。
5. 当植物2-3周大时，将每个泥炭颗粒转移到含有水分控制土壤的单个锅中。这个演示使用了奇迹-格罗水分控制盆栽土壤。
6. 每天用1克/升肥料浇水。切不要使土壤完全干燥。植物在5-6周大时已经做好了渗透的准备。

2. 准备用于渗透的农业细菌

注:GFP-IgG融合构造可如本文^{31所述获得}。从本研究中获得并优化了 asGFP^基因。必须在 Bunsen 燃烧器旁边执行以下步骤，并且应应用基本的无菌技术以避免污染。

1. 条纹 A. tumefaciens EHA105 窝藏豆黄矮病毒 （BeydV）¹⁹ 植物表达载体， 每个结构 （asgFP - Igg， GFP-IgG，轻链）从甘油库存在LB阿加（10克/升 Tryptone，10 g/L NaCl，5 g酵母提取物，15克/升加糖，50μg/mL卡那霉素）板。
2. 在30°C站立的培养箱中生长一天。隔离单个殖民地，通过标准殖民地屏幕 PCR 协议进行验证。
3. 对每个构造使用经过验证的殖民地。用 10 mL 介质填充锥形管（10 g/L tryptone，10 g/L NaCl，5 g 酵母提取物，50 μg/mL）。接下来，加入10μL的100μg/mL卡那霉素。加入 10 μL 的 2.5 μg/mL 利福平， 以防止大肠杆菌 污染。在 30°C 和 120-150 rpm 过夜孵育。
4. 第二天， 如果农业细菌培养 成OD₆₀₀ = 0.6-0.9，它可用于渗透。如果它过度生长 （OD₆₀₀ > 1），1-2 mL 应转移到新鲜 LB 与抗生素，并成长为所需的 OD₆₀₀。根据初始培养物的浓度，可能需要两天时间才能增长到 OD₆₀₀ = 0.6-0.9。
5. 一旦在适当的OD_600，将培养物放在离心机，并在4，500 x g的离心下对细菌进行颗粒，20分钟室温（RT）。
6. 从两个样品中去除上清液，然后将每个颗粒重新注入 1x 渗透缓冲液（10 mM 2-（N-morpholino）乙烷硫酸，10 mM 硫酸镁，与 KOH 一起调整为 pH 5.5），以获得最终 OD₆₀₀ = 0.4。这大约需要 15-45 mL 的渗透缓冲液，具体取决于初始培养密度。将每个IgG融合构造的相等体积与光链构造相结合，获得每个管中每个构造的最终OD₆₀₀ = 0.2。

3. 无针注射器农业渗透

1. 从第 1 步开始，采取拉直的回形针和 5-6 周大的 N. benthamiana 植物。使用回形针的锋利边缘，在面膜表面的叶子的第一表皮层上做一个小穿刺。避免一路穿刺。
   注:较低的叶子更容易渗透，而植物顶部的叶子更难。一般来说，重组蛋白的表达在植物中间的叶子中含量最高，这些叶子的坏死性也较小。
2. 填充 1 mL 注射器，不连接针头，使用步骤 2 中准备好的 农业细菌溶液。用注射器的端子盖住上一步中制造的孔，然后缓慢地推动将细菌注入叶子，同时从叶子后面施加温和的反压。在注射溶液时，注意叶变暗，而不会对注射器施加太大的压力。
3. 尝试在最多3-4次时渗透大部分叶区 - 过量的叶损伤可能会阻碍蛋白质的产生。从底部的视图中，渗透的植物叶将大多显示为深色。
   注:这种细菌溶液应该足够至少3-4个植物每个结构。在丢弃之前，请先将任何剩余的细菌溶液中解。

4. 生长和观察渗透的 N. 本thamiana

1. 将渗透的植物放回生长室，每天继续浇水。
2. 观察渗透区域的叶叶的氯酸和坏死。观察长波和短波紫外灯下有GP荧光（如果存在GP的话）的植物。
3. 第 4-5 天显示叶子中两个 GFP 构造的最高荧光。以 4-5 dpi（渗透后天）收获所有叶子，并称重总叶材料。
4. 立即将其用于下游处理或储存在 -80°C，直到准备使用。

5. 蛋白质提取

1. 使用前，将缓冲液和搅拌杯放在冰上或4°C。
2. 每1克植物材料准备2-3 mL的冰冷萃取缓冲液（100 mM Tris-HCl，50 mM NaCl，2 mM EDTA，pH 8 与 HCl）。在提取前，从库存（100 mM）和50 mM中加入2 mM苯基硫磺醇氟化物（PMSF）和50 mM丙酸钠。
3. 将植物组织从步骤 4 放入预冷搅拌杯中。在搅拌杯中加入测量量的冰镇萃取缓冲液（如步骤 5.2 所示）。将搅拌杯放在搅拌机上。拿一张预切的副膜片，把它伸展到搅拌杯的顶部。以 20 秒间隔混合到均匀性，根据需要在混合循环之间搅拌良好。
4. 将混合材料转移到烧杯上。加入搅拌棒，在4°C搅拌30分钟，以提高蛋白质溶解度，并允许固体沉淀。
5. 将 2 层 Miracloth 放在干净的烧杯上，然后将提取物倒入冰上，以清除大叶碎屑。浇注所有提取物后，折叠米拉布挤压残留的叶子提取物。提取物应显示为深绿色，没有可见的颗粒物。
6. 将样品的 50 μL 转移到新的 1.5 mL 管中，并标记"总提取物"，供以后分析。将萃取器转移到离心管。将植物提取物的剩余以16，000 x g离心20分钟，4°C，将上流液转移到锥形管中。
7. 使用 50 mL 注射器和注射器玻璃纤维过滤器（0.75 μm）过滤可溶性提取物。
8. 离心后采集50μL样品，标签"可溶性提取物"供以后分析。

6. 蛋白质G柱色谱程序

注:此处描述的协议是使用穿孔蛋白 G 加糖树脂进行重力流色谱。如果使用其他树脂，请参阅制造商的调整说明。切不要让树脂干燥，防止所有液体排出。根据需要重新回顾插座。

1. 设置一个包含 20 mL 样品的聚丙烯柱。
2. 根据目标免疫球蛋白类型及其与树脂的亲和力估计所需的浆量。一般来说，3 mL 的总浆料与 1.5 mL 床体积足以纯化几毫克的 Ab。
3. 小心地将所需数量的重新浇注的泥浆倒入盖柱中。从柱底部打开柱出口，并允许其排出，直到大部分缓冲区消失。
4. 立即倒 10 mL 洗涤缓冲液 1x PBS （137 mM NaCl， 2.7 mM KCl， 10 mM Na₂HPO₄， 1.8 mM KH₂PO₄， pH 7.4 与 HCl） 的顶部。让它排空，重复这个洗涤步骤2x。
5. 将步骤 5 中筛选的样本应用于列，并收集流通 - 等值 50 μL 流通，供以后分析。保存其余流经，以防 Ab 未与树脂结合。
   注:重新应用流到新列通常不会产生良好的收益;因此，建议从新的叶材料开始。
6. 用 10 mL 的 1x PBS 清洗树脂两次，以减少非特异性结合。如果需要，当缓冲液通过柱排出时，等同 50 μL 的洗涤液，以验证目标 Ab 未使用洗涤缓冲液洗涤。
7. 在 pH 8 下设置并标注五管，125 μL 无菌 1 M Tris-HCl。这是为了中和酸性洗脱缓冲液中的 Abs，以避免潜在的结构变化。或者，添加 30 μL 的 2 M Tris 基座，以获得稀释较少的样品。
   注意:在洗脱过程中，紫外线可用于可视化。在洗脱期间不需要这样做。如果使用紫外线，请务必佩戴适当的 PPE，以避免对眼睛和皮肤造成伤害。在洗脱步骤期间不需要使用紫外线。
8. 通过将 5 mL 的洗脱缓冲液（100 mM 甘氨酸，pH 2.5 带 HCl）应用于柱，从上一步收集 1 mL 分数到每个指定管。
9. 通过应用 20 mL 洗涤缓冲液，然后应用 10 mL 洗涤缓冲液，立即重新生成柱。确保树脂长时间不留在酸性环境中。洗脱应出现荧光，通常最高荧光出现在第二洗脱中，但可能因提取而异。
10. 储存时，用 PBS 中 10 mL 的 20% 乙醇清洗树脂，让它半排干。回顾顶部，然后列的底部，并保持直立在4°C。
    注:一般来说，蛋白质G树脂可重复使用多达10次，而不会造成重大效率损失。有关具体详情，请参阅制造商指南。
11. 使用分光光度计测量 280 nm 的吸光度，使用洗脱缓冲液作为空白确定 Ab 浓度。将每分馏物的 eluate 储存在 -80 °C 中，每个分数的等分为 50 μL，并储存到单独的管中，以作进一步分析。

7. 用于 GFP-Ig 融合检测的 SDS-PAGE

1. 在设置 SDS-PAGE 之前准备所有示例。
   1. 加入 4 μL 样品缓冲液（6 倍还原样品缓冲液:3.0 mL 甘油、0.93 g DTT、1 g SDS、7 mL 4x Tris （pH 6.8） 0.5 M、1.2 mg 肉酚蓝色）;（6x非还原样品缓冲液:3.0 mL甘油，1克SDS，7 mL 4x Tris（pH 6.8） 0.5 M，1.2毫克的布罗莫酚蓝色）至20μL的每个样品（总提取物，可溶性提取物，流经，洗涤，所有洗脱分数）进行分析。确保管盖牢固固定。
   2. 在沸水浴中只处理减少样品5分钟，然后将样品放在冰上5分钟。将样品在微离心中旋转±5 s，并按收集顺序将每个样品的20μL加载到凝胶孔中。将 3 μL 的双色蛋白梯装进单独的井中。
2. 以恒定的100 V运行SDS-PAGE凝胶，以达到所需的蛋白带分离;大约需要 1.5 小时监测梯子作为蛋白质分离的指标。
3. 在紫外线下可视化凝胶，观察 GFP 荧光。
4. 如果需要，用库马西污渍染色凝胶，以评估每个样品中的总蛋白质。或者，执行西部印迹，使用特定的 Abs 评估目标蛋白质。
   注:库马西染色和西部印迹都可以通过遵循标准协议^{47，48执行}。

结果

这项研究演示了一种简单而快速的方法，可以产生重组蛋白，并在整个下游过程中可视化它们。使用N. benthamiana并遵循所提供的协议，可在不到一周内实现此处描述的重组蛋白生产。植物表达、提取和纯化的总体工作流程如图1所示。图1 A（1-3）显示了2周大幼苗、4周岁幼苗和6周岁幼苗的生长阶段，而图1B则描绘了因

讨论

该协议可用于视觉验证在N.Benthamiana植物生产的任何重组Ab或重组蛋白，包括那些需要暂时暴露在酸性环境中用于柱纯化^{目的42，43，44。}此外，ASGFP与不同表达系统中的其他蛋白质的融合是实验可视化和教育的有用工具。此处的协议可以进一步缩放到更大和更小的叶材料，以产生所需的重组蛋白量。所述方法利用了先前的?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL syringe	any	N/A
50 mL syringe	any	N/A
Agar	SIGMA-ALDRICH	A5306
Blender with cups	any	N/A
Bromophenol blue	Bio-Rad	1610404
DTT (DL-Dithiothreitol)	MP BIOMEDICALS	219482101
EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid	SIGMA-ALDRICH	E-6760
Ethanol	any	N/A
Glycerol	G-Biosciences	BTNM-0037
Glycine	SIGMA-ALDRICH	G7126-500G
HCl (Hydrochloric acid)	EMD MILLIPORE CORPORATION	HX0603-4
Heating block	any reputable supplier	N/A
Jiffy-7 727 w/hole peat pellets	Hummert International	14237000
Kanamycin	Gold Biotechnology Inc	K-120-100
KCl (Potassium Chloride)	SIGMA-ALDRICH	P9541-500G
KH2PO4 (Potassium Phosphate)	J.t.baker	3248-05
KOH (Potassium Hydroxide)	VWR	BDH0262
Magnesium sulfate heptahydrate	SIGMA-ALDRICH	M2773
MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid)	SIGMA-ALDRICH	M8250
Miracloth	Millipore	4 75855-1R
Moisture control potting mix	Miracle-Gro	755783
Na2HPO4 (Sodium Phosphate)	J.t.baker	3827-01
NaCl (Sodium Chloride)	Santa Cruz Biotechnology	sc-203274C
Nicotiana benthamiana seeds	any reputable supplier	N/A
PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride)	G-Biosciences	786-787
Polypropylene Column	any	N/A
Precision Plus Protein Dual Color Standards	Bio-Rad	1610394
Protein G resin	Thermo Fisher Scientific	20399
Rifampicin	Gold Biotechnology Inc	R-120-25
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)	G-Biosciences	DG093
Sodium Ascorbate	SIGMA-ALDRICH	A7631-500G
Spectrophotometer	any reputable supplier	N/A
Titan3 0.75 µm glass fiber filter	ThermoScientific	40725-GM
Tray for peat pellets with dome	any	N/A
TRIS Base	J.t.baker	4109-02
Tris-HCl	Amresco	M108-1KG
Tryptone	SIGMA-ALDRICH	17221
UV lamp	any	N/A
Water Soluble All Purpose Plant Food	Miracle-Gro	2000992
Yeast extract	SIGMA-ALDRICH	9182