JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يقدم هذا البروتوكول نظاما جديدا وقويا وقابلا للاستنساخ لتوليد وزراعة كرويات ثلاثية الأبعاد من خلايا الورم الغدي القولون Caco2. تقدم النتائج أول دليل على المفهوم لعدم ملاءمة هذا النهج لدراسة بيولوجيا الخلايا الجذعية السرطانية ، بما في ذلك الاستجابة للعلاج الكيميائي.

Abstract

تتميز سرطانات القولون والمستقيم بعدم التجانس ومنظمة هرمية تضم مجموعة من الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs) المسؤولة عن تطور الورم وصيانته ومقاومته للأدوية. وبالتالي، فإن الفهم الأفضل لخصائص CSC لاستهدافها المحدد هو شرط مسبق للعلاج الفعال. ومع ذلك، هناك ندرة في النماذج السابقة السريرية المناسبة لإجراء تحقيقات متعمقة. على الرغم من أن خطوط الخلايا السرطانية ثنائية الأبعاد (2D) في المختبر توفر رؤى قيمة في بيولوجيا الورم ، إلا أنها لا تكرر عدم تجانس الورم الظاهري والوراثي. في المقابل، تعالج النماذج ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) وتتكاثر تعقيد السرطان شبه الفسيولوجي وتغايرية الخلايا. وكان الهدف من هذا العمل تصميم نظام ثقافة ثلاثي الأبعاد قوي وقابل للاستنساخ لدراسة بيولوجيا CSC. تصف المنهجية الحالية تطوير وتحسين الظروف لتوليد كرويدات ثلاثية الأبعاد ، وهي متجانسة في الحجم ، من خلايا الكاكو2 الغدية القولونية ، وهو نموذج يمكن استخدامه للثقافة على المدى الطويل. والأهم من ذلك، داخل كرويدات، الخلايا التي نظمت حول هياكل تشبه التجويف، وتتميز أنماط انتشار الخلايا التفاضلية ووجود CSCs التعبير عن لوحة من علامات. توفر هذه النتائج أول دليل على المفهوم لعدم ملاءمة هذا النهج ثلاثي الأبعاد لدراسة تغايرية الخلايا وبيولوجيا CSC ، بما في ذلك الاستجابة للعلاج الكيميائي.

Introduction

سرطان القولون والمستقيم (CRC) لا يزال السبب الرئيسي الثاني للوفيات المرتبطة بالسرطان في العالم1. تطوير لجنة حقوق الطفل هو نتيجة لاكتساب تدريجي وتراكم الطفرات الوراثية و / أو التعديلات اللاجينية2،3، بما في ذلك تفعيل الأورام وتثبيط الجينات المثبطة للورم3،4. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تسهم العوامل غير الوراثية (مثل البيئة الدقيقة) في التحول الجيني ومن ثم المشاركة في تطور مراكز مكافحة الأمراض العصبية5. الأهم من ذلك، تتكون CRCs من مجموعات خلايا مختلفة، بما في ذلك CSCs غير المتمايزة والخلايا السرطانية السائبة التي تظهر بعض الصفات التفاضلية، والتي تشكل بنية هرمية تذكرنا بتنظيم الظهارة في سرداب القولون العادي6،7.

تعتبر CSCs مسؤولة عن ظهور الورم8، والحفاظ عليه ونموه ، وقدرته النقيلية ، ومقاومة العلاجات التقليدية6،7. داخل الأورام، والخلايا السرطانية، بما في ذلك CSCs، عرض مستوى عال من التغايرية والتعقيد من حيث ملامحها الطفرة واللاجينية متميزة، والاختلافات المورفولوجية والظاهرية، والتعبير الجيني، والتمثيل الغذائي، ومعدلات الانتشار، والإمكانات النقيلي9. لذلك ، لفهم أفضل بيولوجيا السرطان ، وتطور الورم ، واكتساب المقاومة للعلاج وترجمته إلى علاجات فعالة ، فإن النماذج قبل السريرية البشرية التي تلتقط عدم التجانس والتسلسل الهرمي للسرطان مهمة10،11.

في المختبر 2D خطوط الخلايا السرطانية قد استخدمت لفترة طويلة وتوفير رؤى قيمة في تطور الورم والآليات الكامنة وراء فعالية الجزيئات العلاجية. ومع ذلك ، فإن تقييدها فيما يتعلق بعدم وجود التغايرية الظاهرية والجينية الموجودة في الأورام الأصلية معترف بها الآن على نطاق واسع12. وعلاوة على ذلك، لا يتم استنساخ المواد الغذائية والأوكسجين، وتدرجات الحموضة، والفيروسات الدقيقة الورم، والبيئة الدقيقة كونها مهمة بشكل خاص للحفاظ على أنواع مختلفة من الخلايا بما في ذلك CSCs11،12. للتغلب على هذه العيوب الرئيسية، تم تطوير العديد من النماذج ثلاثية الأبعاد لمعالجة وإعادة إنتاج تعقيد وتغاير السرطانات تجريبيا. في الواقع، هذه النماذج تلخيص الورم التغايرية الخلوية، والتفاعلات الخلية الخلية، والهندسة المعمارية المكانية، مماثلة لتلك التي لوحظت في الجسم الحي12،13،14. الأجهزة السرطانية الأولية التي أنشئت من الأورام الطازجة، فضلا عن كرويدات خط الخلية المشتقة، وتستخدم إلى حد كبير15،16.

يمكن استزراع الكرويات بطريقة خالية من السقالات أو السقالات لإجبار الخلايا على التشكل والنمو في مجاميع الخلايا. تستند الطرق الخالية من السقالات على ثقافة الخلايا في ظل ظروف غير ملتزمة (على سبيل المثال ، طريقة الشنق أو لوحات المرفق المنخفضة للغاية) ، في حين تعتمد النماذج القائمة على السقالات على المواد الحيوية الطبيعية أو الاصطناعية أو الهجينة لخلايا الثقافة12و13و14. السقالة القائمة على كرويدات تقديم مساوئ مختلفة كما تشكيل كروية النهائي سوف تعتمد على طبيعة وتكوين المواد (الحيوية) المستخدمة. على الرغم من أن طرق كروية خالية من السقالة المتاحة حتى الآن لا تعتمد على طبيعة الركيزة ، فإنها تولد كرويدات تختلف في الهيكل والحجم17،18.

كان الهدف من هذا العمل تصميم نظام ثقافة ثلاثي الأبعاد قوي وقابل للاستنساخ من الكرويات ، وهي متجانسة في الحجم ، تتكون من خلايا الكاكو2 الغدية القولونية لدراسة بيولوجيا CSC. خلايا Caco2 ذات أهمية خاصة نظرا لقدرتها على التفريق مع مرور الوقت19،20، مما يشير بقوة إلى إمكانات تشبه الجذعية. وبناء على ذلك، كشفت الثقافة طويلة الأجل للشفرات وجود مجموعات مختلفة من CSC مع استجابات مختلفة للعلاج الكيميائي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ملاحظة: يتم سرد تفاصيل جميع الكواشف والمواد في جدول المواد.

1. تشكيل كروي

  1. وسائط ثقافة كروية
    1. إعداد المتوسط القاعدية التي تتكون من دولبيكو متوسط النسر المعدلة (DMEM) تكملها مع 4 MM L-ألانيل-L-الجلوتامين ديببتيد.
    2. إعداد DMEM المتوسطة كاملة تحتوي على 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) و 1٪ البنسلين-streptomycin (القلم / ستريب) في المتوسط القاعدي من الخطوة 1.1.1.
    3. إعداد DMEM / الطابق السفلي مصفوفة الغشاء المتوسطة التي تحتوي على 2.5٪ مصفوفة غشاء الطابق السفلي، 10٪ FBS، و 1٪ القلم / ستريب في المتوسط القاعدي من الخطوة 1.1.1.
  2. إعداد لوحات لتشكيل كروي
    1. دافئ القاعدية وDMEM / الطابق السفلي مصفوفة غشاء المتوسطة في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 20 دقيقة تقريبا.
    2. Pretreat الآبار من لوحة 24 جيدا مخصصة لتشكيل كروية بإضافة 500μL من المضادة للالتزام حل الشطف لكل بئر.
      ملاحظة: في هذه اللوحات، يتكون كل بئر من 1200 ميكروويل.
    3. الطرد المركزي لوحة في 1200 × غرام لمدة 5 دقائق في الدوار دلو يتأرجح مع محولات لوحات.
      ملاحظة: إذا تم استخدام لوحة واحدة فقط، قم بإعداد لوحة قياسية إضافية مملوءة بالماء لموازنة الوزن.
    4. شطف كل بئر مع 2 مل من المتوسط القاعدي الدافئ، وتنشق المتوسطة من الآبار.
    5. مراقبة لوحة تحت المجهر لضمان أن فقاعات قد أزيلت تماما من microwells. إذا ظلت الفقاعات محاصرة، طارد مركزي مرة أخرى في 1200 × غرام لمدة 5 دقائق للقضاء على الفقاعات.
    6. كرر الخطوات الشطف 1.2.4-1.2.5.
    7. إضافة 1 مل من DMEM الدافئة / الطابق السفلي مصفوفة غشاء المتوسطة لكل بئر.
  3. جيل من كرويات
    1. تنمو خلايا Caco2 في أحادية 2D في المتوسط DMEM تكملها مع 10٪ FBS و 1٪ القلم / ستريب في 37 درجة مئوية في جو رطب يحتوي على 5٪ CO2 (يشار إليها فيما بعد باسم 37 درجة مئوية / 5٪ CO2).
      ملاحظة: الحد الأقصى لعدد مقاطع الخلايا التي سيتم استخدامها هو 80.
    2. عندما يتم الوصول إلى 80٪ من التقاء، وغسل الخلايا مع الفوسفات العازلة المالحة (PBS) 1x (5 مل لطبق 10 سم)، إضافة تريبسين-إيثيلينديامين حمض رباعي الأسيتيك (EDTA) (2 مل لطبق 10 سم)، واحتضان لمدة 2-5 دقيقة في 37 درجة مئوية / 5٪ CO2.
    3. فحص مفرزة الخلية تحت المجهر، وتحييد التريبسين بإضافة 4 مل من DMEM متوسطة كاملة لكل طبق 10 سم.
    4. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم لتحديد العدد الإجمالي للخلايا.
    5. الطرد المركزي تعليق الخلية في 1200 × غرام لمدة 5 دقائق. تجاهل supernatant، وإعادة إنفاق بيليه في حجم مناسب من DMEM / الطابق السفلي مصفوفة الغشاء المتوسط.
    6. راجع الجدول 1 لتحديد عدد الخلايا المطلوبة لكل بئر لتحقيق العدد المطلوب من الخلايا لكل ميكروويل. بدلا من ذلك، حساب عدد الخلايا باستخدام الصيغة التالية للوحة 24 جيدا، مع الأخذ في الاعتبار كل بئر يحتوي على 1200 ميكروويل
      العدد المطلوب من الخلايا لكل بئر = العدد المطلوب من الخلايا لكل ميكروويل × 1200
    7. إضافة الحجم المطلوب من تعليق الخلية إلى كل بئر لتحقيق رقم الخلية المطلوب في حجم النهائي من 1 مل.
    8. إضافة 1 مل من DMEM / الطابق السفلي مصفوفة غشاء المتوسطة لكل بئر للوصول إلى الحجم النهائي من 2 مل لكل بئر (انظر أيضا الخطوة 1.2.7).
      ملاحظة: يجب الحرص على عدم إدخال فقاعات في microwells.
    9. الطرد المركزي لوحة فورا في 1200 × غرام لمدة 5 دقائق لالتقاط الخلايا في microwells. إذا لزم الأمر، موازنة الطرد المركزي مع لوحة قياسية مليئة بالماء.
    10. مراقبة لوحة تحت المجهر للتحقق من أن يتم توزيع الخلايا بالتساوي بين microwells.
    11. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية / 5 ٪CO2 لمدة 48 ساعة دون إزعاج لوحة.
      ملاحظة: وفقا للبروتوكول الأصلي21، على الرغم من أن العديد من خطوط الخلايا يمكن أن تشكل كرويدات في غضون 24 ساعة ، وبعضها يتطلب وقتا أطول الحضانة. في هذا البروتوكول، 48 ساعة كافية لتشكيل كروي.
  4. حصاد كرويدات من microwells
    1. قم بتدفئة مصفوفة الغشاء القاعدية وDMEM/الطابق السفلي في RT لمدة 20 دقيقة تقريبا.
    2. باستخدام ماصة المصلية، وإزالة نصف المتوسطة الثقافة (1 مل) من كل بئر.
    3. إضافة المتوسطة مرة أخرى على سطح البئر لطرد كرويدات من microwells.
      ملاحظة: لا تلمس أو تريتورات كرويدات.
    4. ضع مصفاة قابلة للعكس 37 ميكرومتر (أو مصفاة قياسية 40 ميكرومتر) على الجزء العلوي من أنبوب مخروطي سعة 15 مل لجمع الكرويات.
      ملاحظة: إذا كنت تستخدم مصفاة قياسية 40 ميكرومتر، ضعها رأسا على عقب.
    5. يستنشق بلطف كرويدات طرد (من الخطوة 1.4.3)، وتمرير تعليق كروي من خلال مصفاة.
      ملاحظة: ستبقى spheroids على عامل التصفية; سوف تتدفق الخلايا المفردة من خلال مع المتوسط.
    6. باستخدام ماصة المصلية، والاستغناء عن 1 مل من المتوسط القاعدي الدافئ عبر كامل سطح البئر لطرد أي كرويدات المتبقية واستردادها على مصفاة.
    7. كرر خطوة الغسيل هذه 1.4.6 مرتين.
    8. مراقبة لوحة تحت المجهر لضمان أن جميع كرويدات قد أزيلت من microwells. كرر الغسيل إذا لزم الأمر (الخطوات 1.4.6-1.4.7).
    9. عكس مصفاة، ووضعه على أنبوب مخروطي 15 مل جديدة. جمع كرويدات عن طريق غسل مصفاة مع DMEM / الطابق السفلي مصفوفة الغشاء المتوسط.
      ملاحظة: تكون كرويدات المجموعة جاهزة للتطبيقات والتحليلات المتلقين للمعلومات.
  5. ثقافة كروية طويلة الأمد
    1. إعداد محلول الآغاروز 1.5٪ في الوسط القاعدي، وتعقيمه عن طريق الالاستعباد التلقائي (دورة قياسية).
    2. في حين أن محلول الآغاروز دافئ ولا يزال سائلا ، قم بتغليف آبار أطباق الثقافة القياسية أو الأطباق ، كما هو موضح في الجدول 2.
      ملاحظة: ارتفاع درجة حرارة الطبق / لوحة في الفرن سوف تسهل خطوة الطلاء. يمكن ترك الأطباق المغلفة / الأطباق في RT لمدة تصل إلى 10 أيام في بيئة معقمة ومحمية من الضوء.
    3. بذور كرويدات حصادها (من الخطوة 1.4.9) في لوحات المغلفة agarose، وإضافة DMEM / الطابق السفلي مصفوفة الغشاء المتوسطة لتحقيق الحجم النهائي اعتمادا على حجم لوحة.
      ملاحظة: لتجنب المجاميع الكروية، البذور لهم في الكثافة المثلى من 22 كرويات / سم2. لاحظ أن الطلاء ليس مسطحا تماما ، ويرتفع نحو الحافة ، مما يخلق قعقعة خفيفة في وسط اللوحة. إذا كان عدد كرويدات مرتفعة جدا، هم أكثر عرضة للالتزام ببعضها البعض.
    4. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية / 5 ٪CO2 حتى استعادة كرويدات لتحليلاتمحددة.
  6. علاج كرويات مع أدوية العلاج الكيميائي
    1. كرويات اللوحة من الخطوة 1.5.4، وتنمو لهم لمدة 2 أيام. بدءا من اليوم الثالث (د3)، عالجهم ب FOLFIRI (5-Fluorouracil، 50 ميكروغرام/مل؛ إيرينوتيكا، 100 ميكروغرام/مل؛ ليوكورين، 25 ميكروغرام/مل) أو مع فولفFOX (5-فلوراسيل، 50 ميكروغرام/مل؛ أوكساليبلاتين، 10 ميكروغرام/مل؛ Leucovorin, 25 ميكروغرام / مل) تركيبات نظام العلاج الكيميائي تستخدم بشكل روتيني لعلاج المرضى CRC22,23,24,25, أو الحفاظ عليها في (السيطرة) غير المعالجة (NT) حالة.
    2. جمع كرويدات بعد 3 أيام من العلاج باستخدام ماصة مع قطع طرف (1000 ميكرولتر تلميح)، وضمان أن يتم تمثيل كل شرط من قبل ما لا يقل عن ثلاثة يكرر. طاردة مركزية لهم في 1000 × غرام لمدة 3 دقائق، ومن ثم إزالة supernatant.
    3. إصلاح الكريات في 2٪ بارافورمالديهايد (PFA) للتحليل النسيجي (انظر القسم 3)، أو استخدام الكريات لاستخراج الحمض النووي الريبي (انظر القسم 4).
    4. لتحليل موت الخلية، واحتضان كرويدات من الخطوة 1.6.1 في لوحات آبار الثقافة السوداء في DMEM / الطابق السفلي مصفوفة الغشاء المتوسط لمدة 30 دقيقة مع وصمة عار حمض النوى (1:5000 التخفيف) التي لا تتخلل الخلايا الحية، ولكن تخترق الأغشية للخطر من الخلايا الميتة26. قياس تراكم الفلورسينس مع قارئ microplate.

2. رصد نمو كروية

  1. باستخدام المجهر المقلوب، والحصول على صور تمثيلية من كرويدات الحفاظ عليها في ظل ظروف مختلفة طوال الأيام في الثقافة.
  2. تحليل الصور عن طريق قياس ثلاثة أقطار تمثيلية مختلفة من كل كروية باستخدام البرامج المناسبة.
  3. استخدم الصيغة التالية للحصول على حجم المجال المقدر.
    figure-protocol-7599

    ملاحظة: المصطلحات d1 d2 و d3 هي ثلاثة أقطار من كروية.

3. الفلورة المناعية (IF) وتلطيخ النسيجية

  1. التثبيت وتضمين البارافين
    1. جمع كرويدات في نقاط زمنية محددة باستخدام ماصة مع تلميح قطع كما هو موضح في الخطوة 1.6.2، وإصلاحها لمدة 30 دقيقة في RT في 2٪ PFA.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، تخزين العينات في هذه الخطوة عند 4 درجة مئوية حتى استخدامها.
    2. لتضمين البارافين، اغسل كرويدات 3x مع برنامج تلفزيوني 1x، وإعادة إنفاقها في الإيثانول 70٪. بعد إدراج البارافين وتقسمه، قم بإجراء تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين (H&.E) للتحليل النسيجي.
  2. الاعتلاء المناعي لأقسام البارافين
    ملاحظة: استخدم مقاطع سمكها 5 ميكرومتر لاحتواء المناعة بشكل غير مباشر.
    1. احتضان الشرائح في 60 درجة مئوية لمدة 2 ساعة لإذابة الشمع وتحسين إزالة البارافينين.
    2. غسل الشرائح مرتين لمدة 3 دقائق في ميثيلسيكلوهيكسان.
    3. غسل الشرائح لمدة 3 دقائق في 1:1 ميثيلسيكلوهيكسان: الإيثانول 100٪.
    4. غسل الشرائح مرتين لمدة 3 دقائق في الإيثانول 100٪.
      ملاحظة: تنفيذ كافة عمليات التلاعب للخطوة 3.2.2 إلى الخطوة 3.2.4 في غطاء محرك السيارة الكيميائية.
    5. غسل الشرائح لمدة 3 دقائق في الإيثانول 90٪.
    6. غسل الشرائح لمدة 3 دقائق في الإيثانول 75٪.
    7. غسل الشرائح لمدة 3 دقائق في الإيثانول 50٪.
    8. غسل الشرائح تحت مياه الصنبور.
    9. إعادة ترطيب الشرائح في الماء المقطر لمدة 5 دقائق.
    10. إعداد 700 مل من 0.01 متر سيترات العازلة، درجة الحموضة 6.0، وإضافته إلى حاوية مناسبة (العرض: 11.5 سم، طول: 17 سم، الارتفاع: 7 سم)؛ غمر الشرائح فيه. سخني الحاوية في الميكروويف لمدة 9-10 دقائق بسرعة 700 واط، وعندما يبدأ الغليان، قللي الطاقة إلى 400-450 واط.
    11. دع الشرائح تبرد في المخزن المؤقت إلى RT لمدة 30-40 دقيقة تقريبا.
    12. غسل الشرائح مرتين في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
    13. رسم دائرة حول المقاطع بقلم علامة لإنشاء حاجز للسوائل المطبقة على المقاطع.
    14. احتضان كل قسم مع 50 ميكروغرام من العازلة حجب (10٪ مصل الماعز العادي، 1٪ ألبوم مصل البقر (BSA)، و 0.02٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني) لمدة 30 دقيقة على الأقل في RT.
    15. إزالة العازلة حجب، وإضافة 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المخففة في العازلة حضانة (1٪ مصل الماعز العادي، 0.1٪ BSA، و 0.02٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني). حضانة لمدة 2 ساعة في RT أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
    16. إزالة الأجسام المضادة الأساسية، وغسل الشرائح 3x في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
    17. احتضان الشرائح مع 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية الفلورية المخففة في العازلة حضانة لمدة 1 ساعة في RT.
    18. إزالة الأجسام المضادة الثانوية، وغسل الشرائح 3x في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
    19. إضافة 50 ميكرولتر من تصاعد المتوسطة مع 4′,6-diamidino-2-phenylindole إلى كل قسم, ووضع غطاء الزجاج على القسم.

4. استخراج الحمض النووي الريبي، النسخ العكسي-البوليميراز سلسلة من ردود الفعل (RT-PCR)، والكمية RT-PCR (qRT-PCR)

  1. جمع كرويدات في نقاط زمنية مختلفة، كل نقطة ممثلة بثلاث نسخ متماثلة على الأقل. طاردة مركزية لهم في 1000 × غرام لمدة 3 دقائق، ومن ثم إزالة supernatant.
    ملاحظة: الكريات يمكن استخدامها مباشرة لاستخراج الحمض النووي الريبي أو تخزينها في -20 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام.
  2. عزل إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام عدة العزل الجيش الملكي النيبالي التجارية، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  3. عكس نسخ 500 نانوغرام من كل عينة الحمض النووي الريبي في الحمض النووي التكميلي (cDNA) مع عدة تجارية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  4. بعد النسخ العكسي، قم بإجراء تحليل PCR على 1 ميكرولتر من cDNA لتضخيم جين التدبير المنزلي مع التمهيديات الموجودة في exons مختلفة.
    ملاحظة: تمكن هذه الخطوة من التحقق من عدم وجود أي تلوث الحمض النووي الجينومي في الاستعدادات الحمض النووي الريبي. لهذا البروتوكول، تم استخدام البرايمرات peptidylprolyl ايزوميراز B(PPIB).
  5. إجراء تضخيم qPCR على 4 ميكرولتر من cDNA المخفف سابقا (1:10 في الماء المقطر المزدوج الخالي من RNAse) باستخدام التمهيديات المحددة للجينات ذات الاهتمام. في كل عينة، تحديد تعبير مرنا محددة باستخدام طريقة ΔΔCt والقيم تطبيع ضد مستويات الجينات التدبير المنزلي.
    ملاحظة: لهذا البروتوكول، تم تحديد β-actin(ACTB). يتم سرد التمهيديات المستخدمة في هذا البروتوكول في الجدول 3.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

وبما أن عدم وجود تجانس في حجم كرويات هو واحد من العيوب الرئيسية المتاحة حاليا أنظمة ثقافة كروية 3D13، وكان الهدف من هذا العمل لاقامة بروتوكول موثوق بها وقابلة للاستنساخ للحصول على كرويدات متجانسة. أولا، لتهيئة ظروف عمل مثالية، تم اختبار أعداد مختلفة من خلايا ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

في المختبر نماذج 3D التغلب على العيوب التجريبية الرئيسية من ثقافات الخلايا السرطانية 2D، كما يبدو أنها أكثر موثوقية في تلخيص الميزات السرطانية النموذجية بما في ذلك البيئة الدقيقة وتغايرية الخلايا. النماذج ثلاثية الأبعاد الشائعة الاستخدام للكرويدات خالية من السقالات (مثقفة في ظروف منخفضة ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه

Acknowledgements

نحن نعترف بمنصات التصوير ومنصات علم الأنسجة Anipath (CRCL، CLB). نحن مدينون لصيدلية مستشفى سنتر ليون بيرارد (CLB) لهدية من نوع FOLFOX وFOLFIRI. كما نشكر بريجيت مانشيب على القراءة النقدية للمخطوطة. تم دعم العمل من قبل FRM (Equipes FRM 2018 و DEQ20181039598) والإنكا (PLBIO19-289). وتلقت مجموعة MVG وLC الدعم من FRM وCF تلقى الدعم من مؤسسة ARC ومركز ليون بيرارد.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
37 µm Reversible Strainer, Large STEMCELL Technologies27250To be used with 50 mL conical tubes
5-FluorouracilGift from Pharmacy of the Centre Leon Berard (CLB)-stock solution, 5 mg/100 mL; final concentration, 50 µg/mL
Agarose SigmaA9539
Aggrewell 400 24-well platesSTEMCELL Technologies344111,200 microwells per well for spheroid formation and growth
Anti Caspase3 - RabbitCell Signaling9661dilution 1:200
Anti Musashi-1 (14H1) - RateBioscience/Thermo Fisher14-9896-82dilution 1:500
Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mLSTEMCELL Technologies07010
Anti-CD133 (13A4) - RatInvitrogen14-133-82dilution 1:100
Anti-CD44 -RabbitAbcamab157107dilution 1:2000
Anti-PCNA - MouseDakoM0879dilution 1:1000
Anti-β-catenin - MouseSanta Cruz Biotechnologysc-7963dilution 1:50
Black multiwell platesThermo Fisher Scientific237108
Citric Acid MonohydrateSigmaC1909
CLARIOstar apparatus BMG Labtechmicroplate reader
Dako penmarker pen to mark circles on slides for creating barriers for liquids
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA21202dilution 1:1000
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA10037dilution 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA21206dilution 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA10042dilution 1:1000
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide)Gibco10569010
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco16000044
Fluorogel mounting medium with DAPIInterchimFP-DT094B
Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA11077dilution 1:1000
ImageJ softwareSpheroid image analysis
Irinotecan Gift from Pharmacy CLB-stock solution, 20 mg/mL; final concentration, 100 µg/mL
iScript reverse transcriptase Bio-Rad1708891
LeucovorinGift from Pharmacy CLB-stock solution, 50 mg/mL; final concentration, 25 µg/mL
Matrigel Basement Membrane MatrixCorning354234Basement membrane matrix
Nucleospin RNA XS KitMacherey-Nagel740902 .250
OxaliplatinGift from Pharmacy CLB-stock solution, 100 mg/20 mL;final concentration, 10 µg/mL
Penicillin-streptomycinGibco15140130
Phosphate Buffer Saline (PBS)Gibco14190250
SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)TakaraRR420B
SYTOX- GreenThermo Fisher ScientificS7020nucleic acid stain; dilution 1:5000
Trypsin-EDTA (0.05 %)Gibco25300062
Zeiss-Axiovert microscopeinverted microscope for acquiring images of spheroids

References

  1. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
  2. Fearon, E. R., Vogelstein, B. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell. 61 (5), 759-767 (1990).
  3. Rao, C. V., Yamada, H. Y. Genomic instability and colon carcinogenesis: from the perspective of genes. Frontiers in Oncology. 3, 130(2013).
  4. Fearon, E. R. Molecular genetics of colorectal cancer. Annual Review of Pathology. 6 (1), 479-507 (2011).
  5. Tran, T. Q., et al. α-Ketoglutarate attenuates Wnt signaling and drives differentiation in colorectal cancer. Nature Cancer. 1 (3), 345-358 (2020).
  6. Batlle, E., Clevers, H. Cancer stem cells revisited. Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).
  7. Clevers, H. The cancer stem cell: premises, promises and challenges. Nature Medicine. 17 (3), 313-319 (2011).
  8. Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
  9. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
  10. Bleijs, M., van de Wetering, M., Clevers, H., Drost, J. Xenograft and organoid model systems in cancer research. The EMBO Journal. 38 (15), 101654(2019).
  11. Kawai, S., et al. Three-dimensional culture models mimic colon cancer heterogeneity induced by different microenvironments. Scientific Reports. 10 (1), 3156(2020).
  12. Ferreira, L. P., Gaspar, V. M., Mano, J. F. Design of spherically structured 3D in vitro tumor models -Advances and prospects. Acta Biomaterialia. 75, 11-34 (2018).
  13. Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nature Protocols. 4 (3), 309-324 (2009).
  14. Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling. World Journal of Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).
  15. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  16. Weiswald, L. -B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
  17. Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
  18. Silva-Almeida, C., Ewart, M. -A., Wilde, C. 3D gastrointestinal models and organoids to study metabolism in human colon cancer. Seminars in Cell & Developmental Biology. 98, 98-104 (2020).
  19. Chantret, I., Barbat, A., Dussaulx, E., Brattain, M. G., Zweibaum, A. Epithelial polarity, villin expression, and enterocytic differentiation of cultured human colon carcinoma cells: A survey of twenty cell lines. Cancer Research. 48 (7), 1936-1942 (1988).
  20. Caro, I., et al. Characterisation of a newly isolated Caco-2 clone (TC-7), as a model of transport processes and biotransformation of drugs. International Journal of Pharmaceutics. 116 (2), 147-158 (1995).
  21. Antonchuk, J. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWellTM plates. Methods in Molecular Biology. 946, 523-533 (2013).
  22. Wolpin, B. M., Mayer, R. J. Systemic treatment of colorectal cancer. Gastroenterology. 134 (5), 1296-1310 (2008).
  23. Yaffee, P., Osipov, A., Tan, C., Tuli, R., Hendifar, A. Review of systemic therapies for locally advanced and metastatic rectal cancer. Journal of Gastrointestinal Oncology. 6 (2), 185-200 (2015).
  24. Fujita, K., Kubota, Y., Ishida, H., Sasaki, Y. Irinotecan, a key chemotherapeutic drug for metastatic colorectal cancer. World Journal of Gastroenterology. 21 (43), 12234-12248 (2015).
  25. Mohelnikova-Duchonova, B., Melichar, B., Soucek, P. FOLFOX/FOLFIRI pharmacogenetics: the call for a personalized approach in colorectal cancer therapy. World Journal of Gastroenterology. 20 (30), 10316-10330 (2014).
  26. Jordan, N. J., et al. Impact of dual mTORC1/2 mTOR kinase inhibitor AZD8055 on acquired endocrine resistance in breast cancer in vitro. Breast Cancer Research. 16 (1), 12(2014).
  27. Mohr, J. C., et al. The microwell control of embryoid body size in order to regulate cardiac differentiation of human embryonic stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1885-1893 (2010).
  28. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  29. Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8 (3), 59689(2013).
  30. Petersen, O. W., Rønnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  31. Nusse, R., Clevers, H. Wnt/β-catenin signaling, disease, and emerging therapeutic modalities. Cell. 169 (6), 985-999 (2017).
  32. Sambuy, Y., De Angelis, I., Ranaldi, G., Scarino, M. L., Stammati, A., Zucco, F. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biology and Toxicology. 21 (1), 1-26 (2005).
  33. Vermeulen, L., Snippert, H. J. Stem cell dynamics in homeostasis and cancer of the intestine. Nature Reviews Cancer. 14 (7), 468-480 (2014).
  34. van der Heijden, M., Vermeulen, L. Stem cells in homeostasis and cancer of the gut. Molecular Cancer. 18 (1), 66(2019).
  35. Barker, N., Bartfeld, S., Clevers, H. Tissue-resident adult stem cell populations of rapidly self-renewing organs. Cell Stem Cell. 7 (6), 656-670 (2010).
  36. van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).
  37. Potten, C. S., et al. Identification of a putative intestinal stem cell and early lineage marker; musashi-1. Differentiation. 71 (1), 28-41 (2003).
  38. Clevers, H. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment. Cell. 154 (2), 274-284 (2013).
  39. Clark, D. W., Palle, K. Aldehyde dehydrogenases in cancer stem cells: potential as therapeutic targets. Annals of Translational Medicine. 4 (24), 518(2016).
  40. Tomita, H., Tanaka, K., Tanaka, T., Hara, A. Aldehyde dehydrogenase 1A1 in stem cells and cancer. Oncotarget. 7 (10), 11018-11032 (2016).
  41. Zoetemelk, M., Rausch, M., Colin, D. J., Dormond, O., Nowak-Sliwinska, P. Short-term 3D culture systems of various complexity for treatment optimization of colorectal carcinoma. Scientific Reports. 9 (1), 7103(2019).
  42. Garcia-Mayea, Y., Mir, C., Masson, F., Paciucci, R., Leonart, M. E. Insights into new mechanisms and models of cancer stem cell multidrug resistance. Seminars in Cancer Biology. 60, 166-180 (2020).
  43. Marusyk, A., Janiszewska, M., Polyak, K. Intratumor heterogeneity: The Rosetta Stone of therapy resistance. Cancer Cell. 37 (4), 471-484 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

167 2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved