Un modèle tridimensionnel des sphéroïdes pour étudier les cellules souches du cancer du côlon

Résumé

Ce protocole présente un système original, robuste, et reproductible de culture pour générer et faire croître les sphéroïdes tridimensionnels des cellules caco2 d’adénocarcinome de deux points. Les résultats fournissent la première preuve de concept de la pertinence de cette approche pour étudier la biologie des cellules souches cancéreuses, y compris la réponse à la chimiothérapie.

Résumé

Les cancers colorectaux sont caractérisés par une hétérogénéité et une organisation hiérarchique comprenant une population de cellules souches cancéreuses (CSC) responsables du développement tumoral, de l’entretien et de la résistance aux médicaments. Une meilleure compréhension des propriétés du SCC pour leur ciblage spécifique est donc une condition préalable à l’efficacité d’un traitement. Cependant, il y a un manque de modèles précliniques appropriés pour des enquêtes approfondies. Bien que les variétés de cellule bidimensionnelles in vitro de cancer (2D) fournissent des aperçus valables dans la biologie de tumeur, elles ne répliquent pas l’hétérogénéité phénotypique et génétique de tumeur. En revanche, les modèles tridimensionnels (3D) abordent et reproduisent la complexité quasi physiologique du cancer et l’hétérogénéité cellulaire. L’objectif de ces travaux était de concevoir un système de culture 3D robuste et reproductible pour étudier la biologie du CSC. La méthodologie actuelle décrit le développement et l’optimisation des conditions pour générer des sphéroïdes 3D, qui sont homogènes dans la taille, des cellules caco2 d’adénocarcinome de deux points, un modèle qui peut être employé pour la culture à long terme. D’une manière primordiale, dans les sphéroïdes, les cellules qui ont été organisées autour de lumen-comme des structures, ont été caractérisées par des modèles différentiels de prolifération cellulaire et par la présence de CSCs exprimant un panneau de marqueurs. Ces résultats fournissent la première preuve de concept de la pertinence de cette approche 3D pour étudier l’hétérogénéité cellulaire et la biologie du CSC, y compris la réponse à la chimiothérapie.

Introduction

Le cancer colorectal (CCR) reste la deuxième cause de décès associés au cancer dans le monde¹. Le développement du CRC est le résultat d’une acquisition et d’une accumulation progressives de mutations génétiques et/ou d’altérations épigénétiques^2,3,notamment l’activation d’oncogènes et l’inactivation de gènes suppresseurs de^{tumeurs 3,4.} De plus, des facteurs non génétiques (p. ex. le microenvironnement) peuvent contribuer à la transformation oncogène et la promouvoir, et ainsi participer à l’évolution des CRC^5. Il est important de faire en sorte que les CRC soient composés de différentes populations cellulaires, notamment de CSC indifférenciés et de cellules tumorales en vrac présentant certains traits de différenciation, qui constituent une structure hiérarchique rappelant l’organisation de l’épithélium dans une crypte normale du côlon^6,7.

Les CSC sont considérés comme responsables de l’aspect tumoral^8,de son maintien et de sa croissance, de sa capacité métastatique et de sa résistance aux thérapies conventionnelles^6,7. Dans les tumeurs, les cellules cancéreuses, y compris les CSC, présentent un niveau élevé d’hétérogénéité et de complexité en termes de profils mutationnels et épigénétiques distincts, de différences morphologiques et phénotypiques, d’expression génique, de métabolisme, de taux de prolifération et de potentiel métastatique^9. Par conséquent, pour mieux comprendre la biologie du cancer, la progression tumorale et l’acquisition de la résistance à la thérapie et sa traduction en traitements efficaces, les modèles précliniques humains capturant cette hétérogénéité et cette hiérarchie du cancer sont importants^10,11.

Les lignées cellulaires in vitro du cancer 2D sont utilisées depuis longtemps et fournissent des informations précieuses sur le développement tumoral et les mécanismes sous-jacents à l’efficacité des molécules thérapeutiques. Cependant, leur limitation en ce qui concerne l’absence de l’hétérogénéité phénotypique et génétique trouvée dans les tumeurs originales est maintenant largement reconnue^12. De plus, les nutriments, l’oxygène, les gradients de pH et le microenvironnement tumoral ne sont pas reproduits, le microenvironnement étant particulièrement important pour le maintien des différents types de cellules, y compris les CSC^11,12. Pour surmonter ces principaux inconvénients, plusieurs modèles 3D ont été développés pour traiter et reproduire expérimentalement la complexité et l’hétérogénéité des cancers. En effet, ces modèles récapitulent l’hétérogénéité cellulaire tumorale, les interactions cellule-cellule, et l’architecture spatiale, semblables à celles observées in vivo^12,13,14. Les organoïdes tumoraux primaires établis à partir de tumeurs fraîches, ainsi que des sphéroïdes dérivés de la lignée cellulaire, sont largement employés^15,16.

Les sphéroïdes peuvent être cultivés d’une manière sans échafaudage ou basée sur l’échafaudage pour forcer les cellules à se former et à se développer dans des agrégats cellulaires. Les méthodes sans échafaudage sont basées sur la culture de cellules dans des conditions non adhérentes (par exemple, la méthode de suspension-goutte ou les plaques de fixation ultra-basses), tandis que les modèles à base d’échafaudages reposent sur des biomatériaux naturels, synthétiques ou hybrides pour les cellules de culture^12,13,14. Les sphéroïdes à base d’échafaudage présentent différents inconvénients car la formation finale des sphéroïdes dépendra de la nature et de la composition du (bio)matériau utilisé. Bien que les méthodes de sphéroïdes sans échafaudage disponibles jusqu’à présent ne reposent pas sur la nature du substrat, elles génèrent des sphéroïdes dont la structure et la taille^{varient 17,18.}

Ce travail visait à concevoir un système de culture 3D robuste et reproductible d’asphéroïdes, de taille homogène, composé de cellules d’adénocarcinome du côlon Caco2 pour étudier la biologie du CSC. Les cellules Caco2 présentent un intérêt particulier en raison de leur capacité à se différencier au fil du temps^19,20,suggérant fortement un potentiel de type radical. En conséquence, la culture à long terme des sphéroïdes a indiqué la présence de différentes populations de CSC avec différentes réponses à la chimiothérapie.

Protocole

REMARQUE : Les détails de tous les réactifs et matériaux sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Formation de sphéroïdes

1. Milieux de culture sphéroïdes
   1. Préparer un milieu basal composé du milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par un dipeptide L-alanyl-L-glutamine de 4 mM.
   2. Préparer le milieu complet DMEM contenant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de pénicilline-streptomycine (Pen/Strep) en milieu basal à partir de l’étape 1.1.1.
   3. Préparer un milieu matriciel DMEM/membrane basale contenant 2,5 % de matrice membranaire de sous-sol, 10 % de FBS et 1 % de pen/streptocoque en milieu basal à partir de l’étape 1.1.1.
2. Préparation de plaques pour la formation de sphéroïdes
   1. Milieu matriciel basal chaud et DMEM/membrane basale à température ambiante (RT) pendant environ 20 min.
   2. Prétraiter les puits d’une plaque de 24 puits dédiée à la formation d’sphéroïdes en ajoutant 500μL de solution de rinçage anti-adhérence à chaque puits.
      REMARQUE : Dans ces plaques, chaque puits est constitué de 1 200 micropuits.
   3. Centrifuger la plaque à 1 200 × g pendant 5 min dans un rotor à godet oscillant avec des adaptateurs pour plaques.
      NOTA : Si une seule plaque est utilisée, préparez une plaque étalon supplémentaire remplie d’eau pour contrebalancer le poids.
   4. Rincez chaque puits avec 2 mL de milieu basal chaud et aspirez le milieu des puits.
   5. Observez la plaque au microscope pour vous assurer que les bulles ont été complètement retirées des micropuits. Si les bulles restent piégées, centrifuger à nouveau à 1 200 × g pendant 5 min pour éliminer les bulles.
   6. Répétez les étapes de rinçage 1.2.4-1.2.5.
   7. Ajouter 1 mL de milieu matriciel chaud DMEM/membrane basale à chaque puits.
3. Génération d’asphéroïdes
   1. Cultiver les cellules Caco2 dans une monocouche 2D en milieu DMEM complétée par 10% FBS et 1% Pen/Strep à 37°C dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de_CO2 (ci-après dénommée 37°C/5%_CO2).
      Remarque : le nombre maximal de passages de cellule à utiliser est 80.
   2. Lorsque 80 % de confluence est atteinte, laver les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1x (5 mL pour une boîte de 10 cm), ajouter de l’acide tétraacétique trypsine-éthylènediamine (EDTA) (2 mL pour une boîte de 10 cm) et incuber pendant 2 à 5 min à 37 °C/5 % de_CO2.
   3. Vérifiez le détachement cellulaire au microscope et neutralisez la trypsine en ajoutant 4 mL de milieu complet DMEM par plat de 10 cm.
   4. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre pour déterminer le nombre total de cellules.
   5. Centrifuger la suspension cellulaire à 1 200 × g pendant 5 min. Jetez le surnageant et ressuscitez la pastille dans un volume approprié de milieu matriciel DMEM/membrane basale.
   6. Reportez-vous au tableau 1 pour déterminer le nombre de cellules nécessaires par puits pour atteindre le nombre souhaité de cellules par micropuit. Vous pouvez également calculer le nombre de cellules à l’aide de la formule suivante pour une plaque de 24 puits, étant donné que chaque puits contient 1 200 micropuits
      Nombre requis de cellules par puits = Nombre souhaité de cellules par micropuit × 1 200
   7. Ajouter le volume requis de la suspension cellulaire à chaque puits pour obtenir le numéro de cellule souhaité dans un volume final de 1 mL.
   8. Ajouter 1 mL de milieu matriciel DMEM/membrane basale à chaque puits pour atteindre le volume final de 2 mL par puits (voir aussi l’étape 1.2.7).
      REMARQUE: Veillez à ne pas introduire de bulles dans les micropuits.
   9. Centrifuger la plaque immédiatement à 1 200 × g pendant 5 min pour capturer les cellules dans les micropuits. Si nécessaire, contrebalancez la centrifugeuse avec une plaque standard remplie d’eau.
   10. Observez la plaque au microscope pour vérifier que les cellules sont réparties uniformément entre les micropuits.
   11. Incuber la plaque à 37 °C/5 % de_CO2 pendant 48 h sans la perturber.
       REMARQUE: Selon le protocole original²¹, bien que de nombreuses lignées cellulaires puissent former des sphéroïdes dans les 24 h, certaines nécessitent un temps d’incubation plus long. Dans ce protocole, 48 h sont suffisants pour la formation sphéroïde.
4. Récolte des sphéroïdes des micro-puits
   1. Réchauffer le milieu matriciel basal et DMEM/sous-sol à TA pendant environ 20 min.
   2. À l’aide d’une pipette sérologique, retirer la moitié du milieu de culture (1 mL) de chaque puits.
   3. Rajouter le milieu à la surface du puits pour déloger les sphéroïdes des micropuits.
      Remarque : ne touchez pas ou triturate les sphéroïdes.
   4. Placez une passoire réversible de 37 μm (ou une passoire standard de 40 μm) sur le dessus d’un tube conique de 15 mL pour recueillir les sphéroïdes.
      REMARQUE: Si vous utilisez une passoire standard de 40 μm, placez-la à l’envers.
   5. Aspirez doucement les sphéroïdes délogés (à partir de l’étape 1.4.3) et passez la suspension sphéroïde à travers la passoire.
      Remarque : les sphéroïdes resteront sur le filtre ; les cellules simples circuleront avec le milieu.
   6. À l’aide d’une pipette sérologique, distribuez 1 mL du milieu basal chaud sur toute la surface du puits pour déloger les sphéroïdes restants et les récupérer sur la passoire.
   7. Répétez deux fois cette étape de lavage 1.4.6.
   8. Observez la plaque au microscope pour vous assurer que tous les sphéroïdes ont été retirés des micropuits. Répéter le lavage si nécessaire (étapes 1.4.6-1.4.7).
   9. Inversez la passoire et placez-la sur un nouveau tube conique de 15 mL. Recueillir les sphéroïdes en lavant la passoire avec DMEM / milieu de matrice de membrane de sous-sol.
      REMARQUE: Les sphéroïdes collectés sont prêts pour les applications et les analyses en aval.
5. Culture à long terme de sphéroïdes
   1. Préparer une solution d’agarose à 1,5% en milieu basal et la stériliser par autoclavage (cycle standard).
   2. Bien que la solution d’agarose soit chaude et encore liquide, enrobez les puits de plaques ou de plats de culture standard, comme décrit dans le tableau 2.
      REMARQUE: Le réchauffement de la vaisselle / plaque dans le four facilitera l’étape de revêtement. Les plats /assiettes enduits peuvent être laissés à RT jusqu’à 10 jours dans un environnement stérile et protégés de la lumière.
   3. Ensemencez les sphéroïdes récoltés (à partir de l’étape 1.4.9) dans les plaques recouvertes d’agarose et ajoutez le milieu matriciel DMEM/membrane basale pour atteindre le volume final en fonction de la taille de la plaque.
      REMARQUE: Pour éviter les agrégats sphéroïdes, ensemencez-les à la densité optimale de 22 sphéroïdes / cm². Observez que le revêtement n’est pas parfaitement plat et qu’il s’élève vers le bord, créant une concavité légère au centre de la plaque. Si le nombre de sphéroïdes est trop élevé, ils sont plus susceptibles d’adhérer les uns aux autres.
   4. Incuber la plaque à 37 °C/5 % de_CO2 jusqu’à récupération des sphéroïdes pour des analyses_{spécifiques.}
6. Traitement des sphéroïdes avec des médicaments chimiothérapeutiques
   1. Plaque sphéroïdes de l’étape 1.5.4, et les cultiver pendant 2 jours. À partir du jour 3 (D3), traitez-les avec FOLFIRI (5-fluorouracile, 50 μg/mL; Irinotécan, 100 μg/mL; Leucovorine, 25 μg/mL) ou avec FOLFOX (5-fluorouracile, 50 μg/mL; Oxaliplatine, 10 μg/mL; Leucovorine, 25 μg/mL) combinaisons de régimes chimiothérapeutiques couramment utilisées pour traiter les patients atteints de CCR^22,23,24,25, ou les maintenir dans un état (témoin) non traité (NT).
   2. Recueillir les sphéroïdes après 3 jours de traitement à l’aide d’une pipette avec la pointe coupée (pointe de 1 000 μL), en veillant à ce que chaque condition soit représentée par au moins trois répétitions. Centrifugez-les à 1 000 × g pendant 3 min, puis retirez le surnageant.
   3. Fixer les pastilles dans du paraformaldéhyde à 2 % (PFA) pour l’analyse histologique (voir la section 3), ou utiliser les pastilles pour l’extraction de l’ARN (voir la section 4).
   4. Pour analyser la mort cellulaire, incuber les sphéroïdes de l’étape 1.6.1 dans des plaques de puits de culture noires dans un milieu matriciel DMEM/membrane basale pendant 30 min avec une coloration d’acide nucléique (dilution 1:5000) qui n’imprègne pas les cellules vivantes, mais pénètre dans les membranes compromises des cellules mortes^26. Mesurer l’accumulation de fluorescence avec un lecteur de microplaque.

2. Surveillance de la croissance des sphéroïdes

1. À l’aide d’un microscope inversé, acquérir des images représentatives des sphéroïdes maintenus dans différentes conditions tout au long des jours en culture.
2. Analysez les images en mesurant trois diamètres représentatifs différents de chaque sphéroïde à l’aide d’un logiciel approprié.
3. Utilisez la formule suivante pour obtenir le volume de sphère estimé.
   
   
   Remarque : Les termes, d1, d2 et d3, sont les trois diamètres de l’asphéroïde.

3. Immunofluorescence (FI) et coloration histologique

1. Fixation et incorporation de paraffine
   1. Recueillir les sphéroïdes à des points de temps choisis à l’aide d’une pipette avec la pointe coupée comme décrit à l’étape 1.6.2, et les fixer pendant 30 minutes à droite dans 2% PFA.
      NOTA : Vous pouvez également conserver les échantillons à cette étape à 4 °C jusqu’à une utilisation ultérieure.
   2. Pour l’incorporation de paraffine, lavez les sphéroïdes 3x avec du PBS 1x et ressuscitez-les dans de l’éthanol à 70%. Après l’inclusion et le sectionnement de paraffine, effectuez une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) pour l’analyse histologique.
2. Immunomarquage des sections de paraffine
   REMARQUE : Utilisez des sections de 5 μm d’épaisseur pour l’immunomarquage indirect.
   1. Incuber les lames à 60 °C pendant 2 h pour faire fondre la cire et améliorer la déparaffination.
   2. Laver les lames deux fois pendant 3 min dans du méthylcyclohexane.
   3. Laver les lames pendant 3 min dans du méthylcyclohexane 1:1 : 100 % éthanol.
   4. Lavez les lames deux fois pendant 3 min dans de l’éthanol à 100%.
      NOTA : Effectuer toutes les manipulations pour les étapes 3.2.2 à 3.2.4 dans une hotte chimique.
   5. Laver les lames pendant 3 min dans de l’éthanol à 90%.
   6. Laver les lames pendant 3 min dans de l’éthanol à 75%.
   7. Laver les lames pendant 3 min dans de l’éthanol à 50%.
   8. Lavez les toboggans sous l’eau du robinet.
   9. Réhydratez les lames dans de l’eau distillée pendant 5 min.
   10. Préparer 700 mL de tampon citrate de 0,01 M, pH 6,0, et l’ajouter à un récipient approprié (largeur: 11,5 cm, longueur: 17 cm, hauteur: 7 cm); submerger les toboggans dedans. Chauffer le récipient au micro-ondes pendant 9-10 min à 700 W, et lorsque l’ébullition commence, diminuer la puissance à 400-450 W. Incuber pendant 10 minutes supplémentaires.
   11. Laissez les lames refroidir dans le tampon à RT pendant environ 30-40 min.
   12. Lavez les lames deux fois en PBS pendant 5 min.
   13. Dessinez un cercle autour des sections à l’aide d’un stylo marqueur pour créer une barrière pour les liquides appliqués aux sections.
   14. Incuber chaque section avec 50 μL de tampon de blocage (10 % de sérum de chèvre normal, 1 % d’albumine sérique bovine (BSA) et 0,02 % de Triton X-100 dans du PBS) pendant au moins 30 minutes à TA.
   15. Retirer le tampon de blocage et ajouter 50 μL d’anticorps primaires dilués dans le tampon d’incubation (1 % de sérum de chèvre normal, 0,1 % de BSA et 0,02 % de Triton X-100 dans du PBS). Incuber pendant 2 h à TA ou pendant une nuit à 4 °C.
   16. Retirez les anticorps primaires et lavez les lames 3x dans du PBS pendant 5 min.
   17. Incuber les lames avec 50 μL d’anticorps secondaires fluorescents dilués dans le tampon d’incubation pendant 1 h à TA.
   18. Retirez les anticorps secondaires et lavez les lames 3x dans du PBS pendant 5 min.
   19. Ajouter 50 μL de milieu de montage avec 4′,6-diamidino-2-phénylindole à chaque section, et placer une lame de couverture en verre sur la section.

4. Extraction de l’ARN, réaction en chaîne de la transcription-polymérase inverse (RT-PCR) et RT-PCR quantitative (qRT-PCR)

1. Recueillir des sphéroïdes à différents points de temps, chaque point représenté par au moins trois répétitions. Centrifugez-les à 1 000 × g pendant 3 min, puis retirez le surnageant.
   REMARQUE: Les granulés peuvent être utilisés directement pour l’extraction de l’ARN ou stockés à -20 ° C jusqu’à une utilisation ultérieure.
2. Isolez l’ARN total à l’aide d’un kit d’isolation de l’ARN commercial, conformément aux instructions du fabricant.
3. Transcrivez à l’envers 500 ng de chaque échantillon d’ARN en ADN complémentaire (ADNc) avec un kit commercial selon les instructions du fabricant.
4. Après transcription inverse, effectuer une analyse PCR sur 1 μL d’ADNc pour amplifier un gène d’entretien ménager avec des amorces situées dans différents exons.
   REMARQUE: Cette étape permet de vérifier l’absence de toute contamination génomique de l’ADN dans les préparations d’ARN. Pour ce protocole, des amorces de peptidylprolyl isomerase B(PPIB) ont été employées.
5. Effectuer une amplification qPCR sur 4 μL d’ADNc préalablement dilué (1:10 dans de l’eau doublement distillée sans RNAse) en utilisant des amorces spécifiques aux gènes d’intérêt. Dans chaque échantillon, quantifier l’expression spécifique de l’ARNm en utilisant la méthode ΔΔCt et les valeurs normalisées par rapport à des niveaux de gènes d’entretien ménager.
   REMARQUE: Pour ce protocole, β-actine(ACTB) a été sélectionné. Les amorces utilisées dans ce protocole sont répertoriées dans le tableau 3.

Résultats

Comme le manque d’homogénéité dans la taille des sphéroïdes est l’un des principaux inconvénients des systèmes de culture sphéroïde 3D actuellement disponibles^13,le but de ce travail était de mettre en place un protocole fiable et reproductible pour obtenir des sphéroïdes homogènes. Tout d’abord, pour établir des conditions de travail idéales, différents nombres de cellules Caco2 ont été testés, allant de 50 à 2 000 cellules par microwell ...

Discussion

Les modèles 3D in vitro surmontent les principaux inconvénients expérimentaux des cultures de cellules cancéreuses 2D, car ils semblent être plus fiables pour récapituler les caractéristiques tumorales typiques, y compris le microenvironnement et l’hétérogénéité cellulaire. Les modèles 3D couramment utilisés de sphéroïdes sont sans échafaudage (cultivés dans des conditions de faible fixation) ou à base d’échafaudage (en utilisant des biomatériaux pour faire culturer des cellules). Ces méthodes p...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
37 µm Reversible Strainer, Large	STEMCELL Technologies	27250	To be used with 50 mL conical tubes
5-Fluorouracil	Gift from Pharmacy of the Centre Leon Berard (CLB)	-	stock solution, 5 mg/100 mL; final concentration, 50 µg/mL
Agarose	Sigma	A9539
Aggrewell 400 24-well plates	STEMCELL Technologies	34411	1,200 microwells per well for spheroid formation and growth
Anti Caspase3 - Rabbit	Cell Signaling	9661	dilution 1:200
Anti Musashi-1 (14H1) - Rat	eBioscience/Thermo Fisher	14-9896-82	dilution 1:500
Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mL	STEMCELL Technologies	07010
Anti-CD133 (13A4) - Rat	Invitrogen	14-133-82	dilution 1:100
Anti-CD44 -Rabbit	Abcam	ab157107	dilution 1:2000
Anti-PCNA - Mouse	Dako	M0879	dilution 1:1000
Anti-β-catenin - Mouse	Santa Cruz Biotechnology	sc-7963	dilution 1:50
Black multiwell plates	Thermo Fisher Scientific	237108
Citric Acid Monohydrate	Sigma	C1909
CLARIOstar apparatus	BMG Labtech		microplate reader
Dako pen			marker pen to mark circles on slides for creating barriers for liquids
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A21202	dilution 1:1000
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A10037	dilution 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A21206	dilution 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A10042	dilution 1:1000
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide)	Gibco	10569010
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	16000044
Fluorogel mounting medium with DAPI	Interchim	FP-DT094B
Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A11077	dilution 1:1000
ImageJ software			Spheroid image analysis
Irinotecan	Gift from Pharmacy CLB	-	stock solution, 20 mg/mL; final concentration, 100 µg/mL
iScript reverse transcriptase	Bio-Rad	1708891
Leucovorin	Gift from Pharmacy CLB	-	stock solution, 50 mg/mL; final concentration, 25 µg/mL
Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning	354234	Basement membrane matrix
Nucleospin RNA XS Kit	Macherey-Nagel	740902 .250
Oxaliplatin	Gift from Pharmacy CLB	-	stock solution, 100 mg/20 mL;final concentration, 10 µg/mL
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140130
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Gibco	14190250
SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)	Takara	RR420B
SYTOX- Green	Thermo Fisher Scientific	S7020	nucleic acid stain; dilution 1:5000
Trypsin-EDTA (0.05 %)	Gibco	25300062
Zeiss-Axiovert microscope			inverted microscope for acquiring images of spheroids