JoVE Logo
Autoren
Kontakt

Anmelden

Zum Anzeigen dieser Inhalte ist ein JoVE-Abonnement erforderlich. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.

In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt ein neuartiges, robustes und reproduzierbares Kultursystem zur Erzeugung und zum Wachstum dreidimensionaler Sphäroide aus Caco2-Kolonadenokarzinomzellen dar. Die Ergebnisse liefern den ersten Proof-of-Concept für die Angemessenheit dieses Ansatzes zur Untersuchung der Krebsstammzellbiologie, einschließlich der Reaktion auf Chemotherapie.

Zusammenfassung

Darmkrebs ist durch Heterogenität und eine hierarchische Organisation gekennzeichnet, die eine Population von Krebsstammzellen (CSCs) umfasst, die für die Tumorentwicklung, -erhaltung und -resistenz gegen Medikamente verantwortlich sind. Ein besseres Verständnis der CSC-Eigenschaften für ihre spezifische Ausrichtung ist daher eine Voraussetzung für eine effektive Therapie. Es gibt jedoch einen Mangel an geeigneten präklinischen Modellen für eingehende Untersuchungen. Obwohl in vitro zweidimensionale (2D) Krebszelllinien wertvolle Einblicke in die Tumorbiologie liefern, replizieren sie die phänotypische und genetische Tumorheterogenität nicht. Im Gegensatz dazu adressieren und reproduzieren dreidimensionale (3D) Modelle die nahe physiologische Krebskomplexität und Zellheterogenität. Ziel dieser Arbeit war es, ein robustes und reproduzierbares 3D-Kultursystem zu entwerfen, um CSC-Biologie zu studieren. Die vorliegende Methodik beschreibt die Entwicklung und Optimierung von Bedingungen zur Erzeugung von 3D-Sphäroiden, die homogen in der Größe sind, aus Caco2-Kolon-Adenokarzinomzellen, einem Modell, das für die langfristige Kultur verwendet werden kann. Wichtig ist, dass innerhalb der Sphäroide die Zellen, die um lumenartige Strukturen organisiert waren, durch differentiale Zellproliferationsmuster und durch das Vorhandensein von CSCs gekennzeichnet waren, die ein Panel von Markern ausdrückten. Diese Ergebnisse liefern den ersten Proof-of-Concept für die Angemessenheit dieses 3D-Ansatzes zur Untersuchung der Zellheterogenität und CSC-Biologie, einschließlich der Reaktion auf Chemotherapie.

Einleitung

Darmkrebs (CRC) ist nach wie vor die zweithäufigste Ursache für krebsassoziierte Todesfälle weltweit1. Die Entwicklung von SCRC ist das Ergebnis einer fortschreitenden Erfassung und Akkumulation genetischer Mutationen und/oder epigenetischer Veränderungen2,3, einschließlich der Aktivierung von Onkogenen und der Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen3,4. Darüber hinaus können nichtgenetische Faktoren (z. B. die Mikroumgebung) zur onkogenen Transformation beitragen und diese fördern und somit an der Entwicklung der SFB5teilnehmen. Wichtig ist, dass CRCs aus verschiedenen Zellpopulationen bestehen, einschließlich undifferenzierter CSCs und Massentumorzellen, die einige Differenzierungsmerkmale aufweisen, die eine hierarchische Struktur darstellen, die an die Organisation des Epithels in einer normalen Doppelpunktkryptaerinnert 6,7.

CSCs gelten als verantwortlich für Tumor aussehen8, seine Wartung und Wachstum, metastasierende Kapazität, und Resistenz gegen konventionelle Therapien6,7. Innerhalb von Tumoren weisen Krebszellen, einschließlich CSCs, ein hohes Maß an Heterogenität und Komplexität in Bezug auf ihre ausgeprägten Mutations- und Epigenetischen Profile, morphologische und phäkotypische Unterschiede, Genexpression, Stoffwechsel, Proliferationsraten und metastasisches Potenzialauf 9. Daher, um Krebsbiologie besser zu verstehen, Tumorprogression, und Erwerb der Resistenz gegen Therapie und ihre Umsetzung in wirksame Behandlungen, menschliche präklinische Modelle erfassung diese Krebsheterogenität und Hierarchie sind wichtig10,11.

In-vitro-2D-Krebszelllinien werden seit langem verwendet und liefern wertvolle Einblicke in die Tumorentwicklung und die Mechanismen, die der Wirksamkeit therapeutischer Moleküle zugrunde liegen. Jedoch, ihre Beschränkung in Bezug auf das Fehlen der phänotypischen und genetischen Heterogenität in den ursprünglichen Tumoren gefunden ist jetzt weithin anerkannt12. Darüber hinaus werden Nährstoffe, Sauerstoff, pH-Gradienten und die Tumormikroumgebung nicht reproduziert, wobei die Mikroumgebung für die Aufrechterhaltung verschiedener Zelltypen, einschließlich CSCs11,12,besonders wichtig ist. Um diese Hauptnachteile zu überwinden, wurden mehrere 3D-Modelle entwickelt, um die Komplexität und Heterogenität von Krebsen experimentell anzugehen und zu reproduzieren. In der Tat rekapitulieren diese Modelle tumorzelluläre Heterogenität, Zell-Zell-Interaktionen und räumliche Architektur, ähnlich denen, die in vivo12,13,14beobachtet wurden. Primäre Tumororganoide, die aus frischen Tumoren sowie zelllinienabgeleiteten Sphäroiden hergestellt werden, werden größtenteils15,16eingesetzt.

Sphäroide können auf Gerüst-freie oder Gerüstbasis kultiviert werden, um die Zellen zu zwingen, sich in Zellaggregaten zu bilden und zu wachsen. Gerüstfreie Methoden basieren auf der Kultur von Zellen unter nicht haftenden Bedingungen (z.B. die Hängetropfenmethode oder ultraniedrige Aufsatzplatten), während Gerüstmodelle auf natürlichen, synthetischen oder hybriden Biomaterialien zu Kulturzellen12,13,14basieren. Gerüst-basierte Sphäroide stellen unterschiedliche Nachteile dar, da die endgültige Sphäroidbildung von der Art und Zusammensetzung des verwendeten (Bio-)Materials abhängt. Obwohl die gerüstfreien Sphäroid-Methoden, die bisher zur Verfügung stehen, nicht auf die Art des Substrats angewiesen sind, erzeugen sie Sphäroide, die in Struktur und Größe17,18variieren.

Diese Arbeit zielte darauf ab, ein robustes und reproduzierbares 3D-Kultursystem von Sphäroiden zu entwerfen, die homogen in der Größe sind und aus Caco2-Kolonadenokarzinomzellen bestehen, um die CSC-Biologie zu studieren. Caco2-Zellen sind von besonderem Interesse aufgrund ihrer Fähigkeit, im Laufe der Zeit zu differenzieren19,20, stark auf ein Stammpotenzial hindeutend. Dementsprechend zeigte die Langzeitkultur der Sphäroide das Vorhandensein verschiedener CSC-Populationen mit unterschiedlichen Reaktionen auf die Chemotherapie.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokoll

HINWEIS: Die Einzelheiten aller Reagenzien und Materialien sind in der Materialtabelleaufgeführt.

1. Sphäroidbildung

  1. Sphäroide Kulturmedien
    1. Bereiten Sie Basalmedium bestehend aus Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 4 mM L-Alanyl-L-Glutamin Dipeptid.
    2. Bereiten Sie DMEM komplettes Medium mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep) im Basalmedium ab Schritt 1.1.1 vor.
    3. Bereiten Sie DMEM/Basement Membranmatrixmedium mit 2,5% Kellermembranmatrix, 10% FBS und 1% Pen/Strep im Basalmedium ab Schritt 1.1.1 vor.
  2. Vorbereitung von Platten zur Sphäroidbildung
    1. Warmes Basal- und DMEM/Kellermembranmatrixmedium bei Raumtemperatur (RT) ca. 20 min.
    2. Ziehen Sie die Brunnen einer 24-Well-Platte, die der Sphäroidbildung gewidmet ist, ab, indem Sie jedem Brunnen 500 l Anti-Haft-Spüllösung hinzufügen.
      HINWEIS: In diesen Platten besteht jeder Brunnen aus 1.200 Mikrobrunnen.
    3. Zentrifugieren Sie die Platte bei 1.200 × g für 5 min in einem schwingenden Schaufelrotor mit Adaptern für Platten.
      HINWEIS: Wenn nur eine Platte verwendet wird, bereiten Sie eine zusätzliche Standardplatte mit Wasser gefüllt, um das Gewicht auszugleichen.
    4. Spülen Sie jeden Brunnen mit 2 ml warmem Basalmedium, und aspirieren Sie das Medium aus den Brunnen.
    5. Beobachten Sie die Platte unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass Blasen vollständig aus den Mikrobrunnen entfernt wurden. Wenn Blasen gefangen bleiben, Zentrifuge wieder bei 1.200 × g für 5 min, um die Blasen zu beseitigen.
    6. Wiederholen Sie die Spülschritte 1.2.4-1.2.5.
    7. Fügen Sie 1 ml warmes DMEM/Kellermembranmatrixmedium zu jedem Brunnen hinzu.
  3. Erzeugung von Sphäroiden
    1. Wachsen Sie die Caco2-Zellen in einer 2D-Monoschicht in DMEM-Medium, ergänzt mit 10% FBS und 1% Pen/Strep bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5%CO2 (im Folgenden 37 °C/5% CO2).
      HINWEIS: Die maximale Anzahl der zu verwendenden Zellpassagen beträgt 80.
    2. Wenn 80% der Konfluenz erreicht ist, waschen Sie die Zellen mit phosphatgepufferter Saline (PBS) 1x (5 ml für eine 10 cm Schale), trypsin-ethylenediamine tetraessig acid (EDTA) (2 ml für eine 10 cm Schale) hinzufügen und für 2-5 min bei 37 °C/5% CO2brüten.
    3. Überprüfen Sie die Zellablösung unter dem Mikroskop und neutralisieren Sie das Trypsin, indem Sie 4 ml DMEM-Gesamtmedium pro 10 cm Schale hinzufügen.
    4. Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer, um die Gesamtzahl der Zellen zu bestimmen.
    5. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 1.200 × g für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in einem entsprechenden Volumen von DMEM/Kellermembranmatrixmedium wieder auf.
    6. Siehe Tabelle 1, um die Anzahl der Zellen zu bestimmen, die pro Bohrkörper erforderlich sind, um die gewünschte Anzahl von Zellen pro Mikrowell zu erreichen. Alternativ können Sie die Anzahl der Zellen mit der folgenden Formel für eine 24-Well-Platte berechnen, wobei jeder Brunnen 1.200 Mikrobrunnen enthält.
      Erforderliche Anzahl von Zellen pro Bohrkörper = Gewünschte Anzahl von Zellen pro Mikrowell × 1.200
    7. Fügen Sie das erforderliche Volumen der Zellsuspension zu jedem Brunnen hinzu, um die gewünschte Zellzahl in einem Endvolumen von 1 ml zu erreichen.
    8. Fügen Sie 1 ml DMEM/Kellermembranmatrixmedium zu jedem Brunnen hinzu, um das Endvolumen von 2 ml pro Bohrung zu erreichen (siehe auch Schritt 1.2.7).
      HINWEIS: Achten Sie darauf, keine Blasen in die Mikrobrunnen einzuführen.
    9. Zentrifugieren Sie die Platte sofort bei 1.200 × g für 5 min, um die Zellen in den Mikrobrunnen zu erfassen. Bei Bedarf die Zentrifuge mit einer mit Wasser gefüllten Standardplatte ausgleichen.
    10. Beobachten Sie die Platte unter dem Mikroskop, um zu überprüfen, ob die Zellen gleichmäßig auf die Mikrobrunnen verteilt sind.
    11. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C/5%CO2 für 48 h, ohne die Platte zu stören.
      HINWEIS: Laut dem ursprünglichen Protokoll21können viele Zelllinien sphäroide innerhalb von 24 h bilden, einige benötigen jedoch eine längere Inkubationszeit. In diesem Protokoll sind 48 h ausreichend für die Sphäroidbildung.
  4. Ernte der Sphäroide aus den Mikrobrunnen
    1. Das Basal- und DMEM/Kellermembranmatrixmedium bei RT ca. 20 min erwärmen.
    2. Mit einer serologischen Pipette die Hälfte des Kulturmediums (1 ml) aus jedem Brunnen entfernen.
    3. Fügen Sie das Medium wieder auf die Oberfläche des Brunnens, um die Sphäroide aus den Mikrobrunnen zu lösen.
      HINWEIS: Berühren oder trituieren Sie die Sphäroide nicht.
    4. Legen Sie ein umkehrbares Sieb (oder ein Standardsieb von 40 m) auf ein 15 ml konisches Rohr, um die Sphäroide zu sammeln.
      HINWEIS: Wenn Sie ein Standardsieb mit 40 m verwenden, stellen Sie es auf den Kopf.
    5. Die ausgleiteten Sphäroide (ab Schritt 1.4.3) vorsichtig ansaugen und die Sphäroidaufhängung durch das Sieb passieren.
      HINWEIS: Die Sphäroide bleiben auf dem Filter; einzelne Zellen fließen mit dem Medium durch.
    6. Mit einer serologischen Pipette 1 ml des warmen Basalmediums über die gesamte Oberfläche des Brunnens verteilen, um alle verbleibenden Sphäroide zu lösen und auf dem Sieb zurückzugewinnen.
    7. Wiederholen Sie diesen Waschschritt 1.4.6 zweimal.
    8. Beobachten Sie die Platte unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass alle Sphäroide aus den Mikrobrunnen entfernt wurden. Wiederholen Sie die Wäsche bei Bedarf (Schritte 1.4.6-1.4.7).
    9. Invertieren Sie das Sieb, und legen Sie es auf einem neuen 15 ml konischen Rohr. Sammeln Sie die Sphäroide, indem Sie das Sieb mit DMEM/Basement Membran Matrix Medium waschen.
      HINWEIS: Die gesammelten Sphäroide sind bereit für nachgelagerte Anwendungen und Analysen.
  5. Langfristige Kultur der Sphäroide
    1. 1,5% Agarose-Lösung im Basalmedium vorbereiten und durch Autoklavieren sterilisieren (Standardzyklus).
    2. Während die Agarose-Lösung warm und noch flüssig ist, beschichten Sie die Brunnen von Standard-Kulturtellern oder Gerichten, wie in Tabelle 2beschrieben.
      HINWEIS: Das Erwärmen der Schale/Platte im Ofen erleichtert den Beschichtungsschritt. Beschichtete Teller können bis zu 10 Tage in einer sterilen Umgebung bei RT zurückgelassen und vor dem Licht geschützt werden.
    3. Säen Sie die geernteten Sphäroide (ab Schritt 1.4.9) in den Agarose-beschichteten Platten, und fügen Sie DMEM/Kellermembranmatrixmedium hinzu, um das endgültige Volumen je nach Größe der Platte zu erreichen.
      ANMERKUNG: Um Sphäroidaggregate zu vermeiden, säen Sie sie bei der optimalen Dichte von 22 Sphäroiden/cm2. Beachten Sie, dass die Beschichtung nicht perfekt flach ist, und es steigt in Richtung der Kante, wodurch eine leichte Konkavität in der Mitte der Platte. Wenn die Anzahl der Sphäroide zu hoch ist, sind sie eher aneinander kleben.
    4. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C/5%CO2 bis zur Rückgewinnung der Sphäroide für spezifische Analysen.
  6. Behandlung von Sphäroiden mit Chemotherapeutika
    1. Plattensphäride ab Schritt 1.5.4, und wachsen sie für 2 Tage. Ab Tag 3 (D3) mit FOLFIRI (5-Fluorouracil, 50 g/ml; Irinotecan, 100 g/ml; Leucovorin, 25 g/ml) oder mit FOLFOX (5-Fluorouracil, 50 g/ml; Oxaliplatin, 10 g/ml; Leucovorin, 25 g/ml) Chemotherapie-Kombinationen routinemäßig verwendet, um CRC-Patienten zu behandeln22,23,24,25, oder halten sie in (Kontrolle) nicht behandelt (NT) Zustand.
    2. Sammeln Sie die Sphäroide nach 3 Tagen der Behandlung mit einer Pipette mit abgeschnittener Spitze (1.000 L-Spitze), um sicherzustellen, dass jede Bedingung durch mindestens drei Wiederholungen dargestellt wird. Zentrifugieren Sie sie bei 1.000 × g für 3 min, und entfernen Sie dann den Überstand.
    3. Fixieren Sie die Pellets in 2% Paraformaldehyd (PFA) für die histologische Analyse (siehe Abschnitt 3), oder verwenden Sie die Pellets für die RNA-Extraktion (siehe Abschnitt 4).
    4. Um den Zelltod zu analysieren, inkubieren Sie die Sphäroide aus Schritt 1.6.1 in schwarzen Kulturbrunnenplatten in DMEM/Kellermembranmatrixmedium für 30 min mit einem Nukleinsäurefleck (1:5000 Verdünnung), der keine lebenden Zellen durchdringt, sondern die kompromittierten Membranen abgestorbener Zellen durchdringt26. Messen Sie die Fluoreszenzakkumulation mit einem Mikroplattenleser.

2. Überwachung des Sphäroidwachstums

  1. Erfassen Sie mit Hilfe eines invertierten Mikroskops repräsentative Bilder von Sphäroiden, die während der Tage in der Kultur unter verschiedenen Bedingungen gehalten werden.
  2. Analysieren Sie die Bilder, indem Sie mit entsprechender Software drei verschiedene repräsentative Durchmesser jedes Sphäroids messen.
  3. Verwenden Sie die folgende Formel, um das geschätzte Kugelvolumen zu erhalten.
    figure-protocol-9425

    HINWEIS: Die Begriffe d1, d2 und d3 sind die drei Durchmesser des Sphäroids.

3. Immunfluoreszenz (IF) und histologische Färbung

  1. Fixierung und Paraffineinbettung
    1. Sammeln Sie die Sphäroide an ausgewählten Zeitpunkten mit einer Pipette mit abgeschnittener Spitze wie in Schritt 1.6.2 beschrieben, und fixieren Sie sie für 30 min bei RT in 2% PFA.
      HINWEIS: Alternativ können Sie die Proben in diesem Schritt bei 4 °C bis zur weiteren Verwendung aufbewahren.
    2. Zum Paraffineinbetten die Sphäroide 3x mit PBS 1x waschen und in 70% Ethanol wieder aufsetzen. Nach Paraffin-Einschluss und Schnitt durchführen Sie Hämatoxylin & Eosin (H&E) Färbung für die histologische Analyse.
  2. Immunolabeling von Paraffinabschnitten
    HINWEIS: Verwenden Sie 5-m-dicke Abschnitte für die indirekte Immunfärbung.
    1. Inkubieren Sie Diaglüg bei 60 °C für 2 h, um das Wachs zu schmelzen und die Deparaffinierung zu verbessern.
    2. Waschen Sie die Dias zweimal für 3 min in Methylcyclohexan.
    3. Waschen Sie die Dias für 3 min in 1:1 Methylcyclohexan: 100% Ethanol.
    4. Waschen Sie die Dias zweimal für 3 min in 100% Ethanol.
      HINWEIS: Führen Sie alle Manipulationen für Schritt 3.2.2 bis Schritt 3.2.4 in einer chemischen Haube durch.
    5. Waschen Sie die Dias für 3 min in 90% Ethanol.
    6. Waschen Sie die Dias für 3 min in 75% Ethanol.
    7. Waschen Sie die Dias für 3 min in 50% Ethanol.
    8. Waschen Sie die Rutschen unter Leitungswasser.
    9. Rehydrieren Sie die Dias in destilliertem Wasser für 5 min.
    10. 700 ml 0,01 M Citratpuffer, pH 6,0 vorbereiten und in einen geeigneten Behälter geben (Breite: 11,5 cm, Länge: 17 cm, Höhe: 7 cm); die Dias darin untertauchen. Erhitzen Sie den Behälter in der Mikrowelle für 9-10 min bei 700 W, und wenn das Kochen beginnt, verringern Sie die Leistung auf 400-450 W. Inkubieren für weitere 10 min.
    11. Lassen Sie die Dias im Puffer ca. 30-40 min auf RT abkühlen.
    12. Waschen Sie die Dias zweimal in PBS für 5 min.
    13. Zeichnen Sie einen Kreis um die Abschnitte mit einem Markerstift, um eine Barriere für Flüssigkeiten zu schaffen, die auf die Abschnitte angewendet werden.
    14. Inkubieren Sie jeden Abschnitt mit 50 l Blockierpuffer (10% normales Ziegenserum, 1% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,02% Triton X-100 in PBS) für mindestens 30 min bei RT.
    15. Entfernen Sie den Blockierpuffer, und fügen Sie 50 L primärer Antikörper hinzu, die im Inkubationspuffer verdünnt wurden (1% normales Ziegenserum, 0,1% BSA und 0,02 % Triton X-100 in PBS). 2 h bei RT oder über Nacht bei 4 °C inkubieren.
    16. Entfernen Sie die primären Antikörper, und waschen Sie die Dias 3x in PBS für 5 min.
    17. Inkubieren Sie die Dias mit 50 l fluoreszierenden Sekundärantikörpern, die im Inkubationspuffer für 1 h bei RT verdünnt werden.
    18. Entfernen Sie die sekundären Antikörper, und waschen Sie die Dias 3x in PBS für 5 min.
    19. Fügen Sie jedem Abschnitt 50 l Montagemedium mit 4,6-Diamidino-2-Phenylindole hinzu und legen Sie einen Glasdeckel über den Abschnitt.

4. RNA-Extraktion, Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) und quantitative RT-PCR (qRT-PCR)

  1. Sammeln Sie Sphäroide zu verschiedenen Zeitpunkten, wobei jeder Punkt durch mindestens drei Replikationen dargestellt wird. Zentrifugieren Sie sie bei 1.000 × g für 3 min, und entfernen Sie dann den Überstand.
    HINWEIS: Pellets können bis zur weiteren Verwendung direkt zur RNA-Extraktion verwendet oder bei -20 °C gelagert werden.
  2. Isolieren Sie die gesamte RNA mit einem kommerziellen RNA-Isolationskit, gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  3. Reverse-Transcribe 500 ng jeder RNA-Probe in komplementäre DNA (cDNA) mit einem kommerziellen Kit nach den Anweisungen des Herstellers.
  4. Führen Sie nach der umgekehrten Transkription eine PCR-Analyse an 1 L cDNA durch, um ein Housekeeping-Gen mit Primern in verschiedenen Exons zu verstärken.
    HINWEIS: Dieser Schritt ermöglicht die Überprüfung des Fehlens einer genomischen DNA-Kontamination in den RNA-Präparaten. Für dieses Protokoll wurden Peptidylprolyl-Isomerase-B-Grundierungen(PPIB) verwendet.
  5. Führen Sie die qPCR-Amplifikation auf 4 l zuvor verdünnter cDNA (1:10 in RNAse-freiem doppeldestilliertem Wasser) durch, indem Sie Primer verwenden, die speziell für die Gene von Interesse sind. In jeder Probe wird die spezifische mRNA-Expression mit der Methode "Ct" und den werten, die gegen ein Housekeeping-Genniveau normalisiert wurden, quantifiziert.
    HINWEIS: Für dieses Protokoll wurde β-Actin (ACTB) ausgewählt. Die in diesem Protokoll verwendeten Primer sind in Tabelle 3aufgeführt.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ergebnisse

Da der Mangel an Homogenität in der Größe der Sphäroide einer der Hauptnachteile der derzeit verfügbaren 3D-Sphäroid-Kultursysteme13ist, bestand das Ziel dieser Arbeit darin, ein zuverlässiges und reproduzierbares Protokoll zur Erzielung homogener Sphäroide zu erstellen. Um ideale Arbeitsbedingungen zu schaffen, wurden verschiedene Anzahl von Caco2-Zellen getestet, die von 50 bis 2.000 Zellen pro Mikrowell/Spheroid mit speziellen Platten reichten (T...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Diskussion

In-vitro-3D-Modelle überwinden die wichtigsten experimentellen Nachteile von 2D-Krebszellkulturen, da sie bei der Rekapitulation typischer Tumormerkmale wie Mikroumgebung und Zellheterogenität zuverlässiger zu sein scheinen. Häufig verwendete 3D-Modelle von Sphäroiden sind gerüstfrei (kultiviert unter niedriganbaulichen Bedingungen) oder Gerüstbasis (mit Biomaterialien zur Kulturvon Zellen). Diese Methoden weisen unterschiedliche Nachteile auf, da sie von der Art des verwendeten Gerüsts abhängen oder sphäroide ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten

Danksagungen

Wir erkennen die Imaging- und Anipath-Recherche-Histologie-Plattformen (CRCL, CLB) an. Wir sind der Apotheke des Centre Léon Bérard (CLB) Krankenhauses für das freundliche Geschenk von FOLFOX und FOLFIRI zu verdanken. Wir danken auch Brigitte Manship für die kritische Lektüre des Manuskripts. Die Arbeiten wurden vom FRM (Equipes FRM 2018, DEQ20181039598) und der Inca (PLBIO19-289) unterstützt. MVG und LC erhielten Unterstützung von der FRM und CF erhielt Unterstützung von der ARC-Stiftung und dem Centre Léon Bérard.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
37 µm Reversible Strainer, Large STEMCELL Technologies27250To be used with 50 mL conical tubes
5-FluorouracilGift from Pharmacy of the Centre Leon Berard (CLB)-stock solution, 5 mg/100 mL; final concentration, 50 µg/mL
Agarose SigmaA9539
Aggrewell 400 24-well platesSTEMCELL Technologies344111,200 microwells per well for spheroid formation and growth
Anti Caspase3 - RabbitCell Signaling9661dilution 1:200
Anti Musashi-1 (14H1) - RateBioscience/Thermo Fisher14-9896-82dilution 1:500
Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mLSTEMCELL Technologies07010
Anti-CD133 (13A4) - RatInvitrogen14-133-82dilution 1:100
Anti-CD44 -RabbitAbcamab157107dilution 1:2000
Anti-PCNA - MouseDakoM0879dilution 1:1000
Anti-β-catenin - MouseSanta Cruz Biotechnologysc-7963dilution 1:50
Black multiwell platesThermo Fisher Scientific237108
Citric Acid MonohydrateSigmaC1909
CLARIOstar apparatus BMG Labtechmicroplate reader
Dako penmarker pen to mark circles on slides for creating barriers for liquids
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA21202dilution 1:1000
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA10037dilution 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA21206dilution 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA10042dilution 1:1000
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide)Gibco10569010
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco16000044
Fluorogel mounting medium with DAPIInterchimFP-DT094B
Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA11077dilution 1:1000
ImageJ softwareSpheroid image analysis
Irinotecan Gift from Pharmacy CLB-stock solution, 20 mg/mL; final concentration, 100 µg/mL
iScript reverse transcriptase Bio-Rad1708891
LeucovorinGift from Pharmacy CLB-stock solution, 50 mg/mL; final concentration, 25 µg/mL
Matrigel Basement Membrane MatrixCorning354234Basement membrane matrix
Nucleospin RNA XS KitMacherey-Nagel740902 .250
OxaliplatinGift from Pharmacy CLB-stock solution, 100 mg/20 mL;final concentration, 10 µg/mL
Penicillin-streptomycinGibco15140130
Phosphate Buffer Saline (PBS)Gibco14190250
SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)TakaraRR420B
SYTOX- GreenThermo Fisher ScientificS7020nucleic acid stain; dilution 1:5000
Trypsin-EDTA (0.05 %)Gibco25300062
Zeiss-Axiovert microscopeinverted microscope for acquiring images of spheroids

Referenzen

  1. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
  2. Fearon, E. R., Vogelstein, B. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell. 61 (5), 759-767 (1990).
  3. Rao, C. V., Yamada, H. Y. Genomic instability and colon carcinogenesis: from the perspective of genes. Frontiers in Oncology. 3, 130(2013).
  4. Fearon, E. R. Molecular genetics of colorectal cancer. Annual Review of Pathology. 6 (1), 479-507 (2011).
  5. Tran, T. Q., et al. α-Ketoglutarate attenuates Wnt signaling and drives differentiation in colorectal cancer. Nature Cancer. 1 (3), 345-358 (2020).
  6. Batlle, E., Clevers, H. Cancer stem cells revisited. Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).
  7. Clevers, H. The cancer stem cell: premises, promises and challenges. Nature Medicine. 17 (3), 313-319 (2011).
  8. Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
  9. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
  10. Bleijs, M., van de Wetering, M., Clevers, H., Drost, J. Xenograft and organoid model systems in cancer research. The EMBO Journal. 38 (15), 101654(2019).
  11. Kawai, S., et al. Three-dimensional culture models mimic colon cancer heterogeneity induced by different microenvironments. Scientific Reports. 10 (1), 3156(2020).
  12. Ferreira, L. P., Gaspar, V. M., Mano, J. F. Design of spherically structured 3D in vitro tumor models -Advances and prospects. Acta Biomaterialia. 75, 11-34 (2018).
  13. Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nature Protocols. 4 (3), 309-324 (2009).
  14. Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling. World Journal of Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).
  15. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  16. Weiswald, L. -B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
  17. Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
  18. Silva-Almeida, C., Ewart, M. -A., Wilde, C. 3D gastrointestinal models and organoids to study metabolism in human colon cancer. Seminars in Cell & Developmental Biology. 98, 98-104 (2020).
  19. Chantret, I., Barbat, A., Dussaulx, E., Brattain, M. G., Zweibaum, A. Epithelial polarity, villin expression, and enterocytic differentiation of cultured human colon carcinoma cells: A survey of twenty cell lines. Cancer Research. 48 (7), 1936-1942 (1988).
  20. Caro, I., et al. Characterisation of a newly isolated Caco-2 clone (TC-7), as a model of transport processes and biotransformation of drugs. International Journal of Pharmaceutics. 116 (2), 147-158 (1995).
  21. Antonchuk, J. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWellTM plates. Methods in Molecular Biology. 946, 523-533 (2013).
  22. Wolpin, B. M., Mayer, R. J. Systemic treatment of colorectal cancer. Gastroenterology. 134 (5), 1296-1310 (2008).
  23. Yaffee, P., Osipov, A., Tan, C., Tuli, R., Hendifar, A. Review of systemic therapies for locally advanced and metastatic rectal cancer. Journal of Gastrointestinal Oncology. 6 (2), 185-200 (2015).
  24. Fujita, K., Kubota, Y., Ishida, H., Sasaki, Y. Irinotecan, a key chemotherapeutic drug for metastatic colorectal cancer. World Journal of Gastroenterology. 21 (43), 12234-12248 (2015).
  25. Mohelnikova-Duchonova, B., Melichar, B., Soucek, P. FOLFOX/FOLFIRI pharmacogenetics: the call for a personalized approach in colorectal cancer therapy. World Journal of Gastroenterology. 20 (30), 10316-10330 (2014).
  26. Jordan, N. J., et al. Impact of dual mTORC1/2 mTOR kinase inhibitor AZD8055 on acquired endocrine resistance in breast cancer in vitro. Breast Cancer Research. 16 (1), 12(2014).
  27. Mohr, J. C., et al. The microwell control of embryoid body size in order to regulate cardiac differentiation of human embryonic stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1885-1893 (2010).
  28. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  29. Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8 (3), 59689(2013).
  30. Petersen, O. W., Rønnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  31. Nusse, R., Clevers, H. Wnt/β-catenin signaling, disease, and emerging therapeutic modalities. Cell. 169 (6), 985-999 (2017).
  32. Sambuy, Y., De Angelis, I., Ranaldi, G., Scarino, M. L., Stammati, A., Zucco, F. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biology and Toxicology. 21 (1), 1-26 (2005).
  33. Vermeulen, L., Snippert, H. J. Stem cell dynamics in homeostasis and cancer of the intestine. Nature Reviews Cancer. 14 (7), 468-480 (2014).
  34. van der Heijden, M., Vermeulen, L. Stem cells in homeostasis and cancer of the gut. Molecular Cancer. 18 (1), 66(2019).
  35. Barker, N., Bartfeld, S., Clevers, H. Tissue-resident adult stem cell populations of rapidly self-renewing organs. Cell Stem Cell. 7 (6), 656-670 (2010).
  36. van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).
  37. Potten, C. S., et al. Identification of a putative intestinal stem cell and early lineage marker; musashi-1. Differentiation. 71 (1), 28-41 (2003).
  38. Clevers, H. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment. Cell. 154 (2), 274-284 (2013).
  39. Clark, D. W., Palle, K. Aldehyde dehydrogenases in cancer stem cells: potential as therapeutic targets. Annals of Translational Medicine. 4 (24), 518(2016).
  40. Tomita, H., Tanaka, K., Tanaka, T., Hara, A. Aldehyde dehydrogenase 1A1 in stem cells and cancer. Oncotarget. 7 (10), 11018-11032 (2016).
  41. Zoetemelk, M., Rausch, M., Colin, D. J., Dormond, O., Nowak-Sliwinska, P. Short-term 3D culture systems of various complexity for treatment optimization of colorectal carcinoma. Scientific Reports. 9 (1), 7103(2019).
  42. Garcia-Mayea, Y., Mir, C., Masson, F., Paciucci, R., Leonart, M. E. Insights into new mechanisms and models of cancer stem cell multidrug resistance. Seminars in Cancer Biology. 60, 166-180 (2020).
  43. Marusyk, A., Janiszewska, M., Polyak, K. Intratumor heterogeneity: The Rosetta Stone of therapy resistance. Cancer Cell. 37 (4), 471-484 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Weitere Artikel entdecken

KrebsforschungAusgabe 167Caco2 ZellenKrebsstammzellenZellproliferationDarmkrebsKolonosph renWachstum der Kolonosph ren

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Kontakt

BIBLIOTHEKS-EMPFEHLUNG

JoVE-Newsletter

Forschung

Lehre

Autoren

Bibliothekare

ÜBER JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten