大腸癌幹細胞を研究するスフェロイドの3次元モデル

要約

このプロトコルは、Caco2結腸腺癌細胞から3次元スフェロイドを生成し、増殖させる新規、堅牢、再現性培養システムを提示する。この結果は、化学療法への応答を含む癌幹細胞生物学を研究するためのこのアプローチの適切性に関する最初の概念実証を提供する。

要約

大腸癌は、異質性および腫瘍の発達、維持、および薬剤に対する耐性を担う癌幹細胞(CSC)の集団からなる階層的組織によって特徴付けられる。したがって、特定の標的化に対するCSC特性のより良い理解は、効果的な治療のための前提条件である。しかし、詳細な調査には適切な前臨床モデルの貧弱さがあります。in vitro 2次元(2D)癌細胞株は腫瘍生物学に関する貴重な洞察を提供するが、彼らは表現型および遺伝的腫瘍不均一性を複製しない。対照的に、3次元(3D)モデルは、ほぼ生理学的癌の複雑さと細胞の不均一性に対処し、再生する。この研究の目的は、CSC生物学を研究するための堅牢で再現性の高い3D培養システムを設計することであった。本手法は、Caco2結腸腺癌細胞から、サイズが均質な3Dスフェロイドを生成する条件の開発と最適化を説明する、長期培養に使用できるモデルである。重要なことに、スフェロイド内では、内腔様構造の周りに組織された細胞は、細胞増殖パターンの差動と、マーカーのパネルを発現するCSCの存在によって特徴づけられた。これらの結果は、化学療法に対する応答を含む細胞の異質性およびCSC生物学を研究するためのこの3Dアプローチの妥当性に関する最初の概念実証を提供する。

概要

大腸癌(CRC)は、世界における癌関連死の第2位の原因^である。CRCの開発は、遺伝子変異および/またはエピジェネティックな変化の進行的な獲得および蓄積の結果^{である2、3、}腫瘍抑制遺伝子の活性化および腫瘍抑制遺伝子^3の不活性化を含^む。さらに、非遺伝的要因(例えば、微小環境)は、発癌性転換に寄与し、そして促進し、したがって^CRCs5の進化に関与することができる。重要なことに、CRCは、未分化CSCおよびバルク腫瘍細胞を含む異なる細胞集団で構成され、いくつかの分化形質を示し、これは正常な結^腸暗号6,7における上皮の組織を連想させる階層構造を構成する。

CSCは腫瘍の外観^8、その維持と成長、転移能力、および従来の治療法^6、7に対する耐性を担うと考えられている。腫瘍内では、CSCを含む癌細胞は、その明確な突然変異およびエピジェネティックなプロファイル、形態学的および表現性の違い、遺伝子発現、代謝、増殖率、および転移電位の点で高レベルの不均一性および複雑さを示す^9。したがって、がん生物学、腫瘍進行、および治療に対する耐性の獲得および有効な治療への翻訳をよりよく理解するために、この癌の異質性および階層を捉えるヒト前臨床モデルは^{重要である10,11}である。

In vitro 2Dがん細胞株は、長い間使用されており、腫瘍の発達と治療分子の有効性の基礎となるメカニズムに関する貴重な洞察を提供してきました。しかし、元の腫瘍に見られる形質および遺伝的不均一性の欠如に関するそれらの限界は現在広く認識されている^12。また、栄養素、酸素、pH勾配、及び腫瘍微小環境は再生されず^、CSCs11,12を含む異なる細胞タイプの維持のために特に重要な微小環境である。これらの主な欠点を克服するために、いくつかの3Dモデルが実験的に対処し、癌の複雑さと不均一性を再現するために開発されました。事実上、これらのモデルは、腫瘍細胞異質性、細胞細胞相互作用、および空間的アーキテクチャを再現し、生体内^12、13、14で観察されたものと同様^である。新鮮な腫瘍から樹立された原発性腫瘍オルガノイドは、細胞系由来のスフェロイドと同様に、主に^15,16個を採用している。

スフェロイドは、細胞を強制的に形成し、細胞凝集体で増殖させるために、足場を含まないまたは足場ベースの方法で培養することができる。足場を含まない方法は、非接着条件下での細胞の培養(例えば、吊り下げ法または超低添付プレート)に基づくが、足場ベースのモデルは、培養細胞^12、13、14に天然、合成、またはハイブリッドバイオマテリアルに依存する。スキャフォールドベースのスフェロイドは、最終的なスフェロイド形成が使用される(バイオ)材料の性質および組成に依存するので、異なる欠点を提示する。これまで入手可能な足場を含まないスフェロイド法は基板の性質に依存しないが、それらは構造およびサイズ^17、18で変化するスフェロイドを生成する。

この研究は、CSC生物学を研究するためにCaco2結腸腺癌細胞で構成される、サイズが均質であるスフェロイドの堅牢で再現可能な3D培養システムを設計することを目的としていた。Caco2細胞は、時間^19,20の経過とともに分化する能力のために特に関心があり、ステムのような可能性を強く示唆している。従って、スフェロイドの長期培養は、化学療法に対する異なる応答を有する異なるCSC集団の存在を明らかにした。

プロトコル

注: すべての試薬と材料の詳細は、 材料表に記載されています。

1. スフェロイド形成

1. スフェロイド培養培地
   1. 4 mM L-アラニル-L-グルタミンジペプチドを添加したダルベックコの修飾イーグル培地(DMEM)からなる基底培地を調製する。
   2. ステップ1.1.1から基礎培地に10%のウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリンストレプトマイシン(ペン/ストレップ)を含むDMEM完全培地を調製する。
   3. ステップ1.1.1から2.5%基底膜マトリックス、10%FBS、および1%のペン/ストレップを基底培地に含むDMEM/基底膜マトリックス培地を調製します。
2. スフェロイド形成用プレートの作製
   1. 温かい基底およびDMEM/基底膜マトリックス媒体を室温(RT)で約20分間使用します。
   2. 500μLの抗付着リンス溶液を各ウェルに添加することで、スフェロイド形成専用の24ウェルプレートのウェルを退却させます。
      注:これらのプレートでは、各井戸は1,200マイクロウェルで構成されています。
   3. プレート用アダプター付きのスイングバケットローターで、1,200×gで5分間プレートを遠心します。
      注:1つのプレートのみを使用する場合は、重量のバランスを取るために水で満たされた追加の標準プレートを準備してください。
   4. 温かい基底培地を2mLずつよく洗い、井戸から培地を吸引する。
   5. マイクロウェルから泡が完全に取り除かれていることを確認するために、顕微鏡の下でプレートを観察します。気泡が閉じ込められたままの場合、気泡を除去するために5分間1,200×gで再び遠心分離機。
   6. リンスの手順 1.2.4~ 1.2.5 を繰り返します。
   7. 各ウェルに1mLの温かいDMEM/基質膜マトリックス培地を加えます。
3. スフェロイドの生成
   1. Caco2細胞を、5%CO2(以下37°C/5%CO2と呼ぶ)を含む加湿雰囲気で37°Cで10%FBSおよび1%のペン/ストレップを添加したDMEM培地中の2D単層で増殖させる。
      注: 使用するセルの通過の最大数は 80 です。
   2. 合流率の80%に達したら、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)1x(10cm皿の場合は5mL)で細胞を洗浄し、トリプシンエチレン酢酸(EDTA)(10cm皿の場合は2mL)を加え、37°C/5%CO2で2〜5分間インキュベートする。
   3. 顕微鏡下で細胞剥離をチェックし、10cm皿あたり4 mLのDMEM完全培地を加えてトリプシンを中和します。
   4. ヘモサイトメーターを使用して細胞の総数を計算するセルをカウントします。
   5. 細胞懸濁液を1,200×gで5分間遠心する。上清を捨て、ペレットを適切な容積のDMEM/基底膜マトリックス媒体で再懸濁する。
   6. マイクロウェル当たりの所望の細胞数を達成するためにウェル当たりの必要な細胞数を決定するには 、表1 を参照してください。または、24ウェルプレートに対して次の式を使用してセル数を計算し、各ウェルに1,200マイクロウェルが含まれていることを考慮します。
      ウェルあたりの必要なセル数 = マイクロウェル当たりの必要数 × 1,200
   7. 各ウェルに細胞懸濁液の必要量を加えて、最終体積1mLで所望のセル数を達成します。
   8. DMEM/基膜マトリックス培地を1 mLずつウェルあたり2 mLの最終体積に達します(ステップ1.2.7も参照)。
      注意:マイクロウェルに泡を入れないように注意してください。
   9. マイクロウェル内の細胞を捕捉するために5分間1,200×gでプレートを直ちに遠心します。 必要に応じて、遠心分離機と水で満たされた標準的なプレートのバランスを取ります。
   10. 顕微鏡下でプレートを観察し、細胞がマイクロウェルに均等に分布していることを確認します。
   11. プレートを邪魔することなく、37°C/5%CO2で48時間インキュベートします。
       注:元のプロトコル²¹によれば、多くの細胞株は24時間以内にスフェロイドを形成することができるが、一部はより長いインキュベーション時間を必要とする。このプロトコルでは、48時間はスフェロイド形成に十分である。
4. マイクロウェルからスフェロイドを収穫する
   1. 約20分間RTで基底とDMEM/基底膜マトリックス培地を温めます。
   2. 血清ピペットを使用して、各ウェルから培養培地(1mL)の半分を除去する。
   3. マイクロウェルからスフェロイドを取り除くためにウェルの表面に媒体を戻します。
      メモ:回転楕円体に触れたり、三角回転させたりしないでください。
   4. 37 μm リバーシブルストレーナー(または40 μm標準ストレーナー)を15 mL円錐形チューブの上に置き、スフェロイドを収集します。
      注:40 μmの標準ストレーナーを使用する場合は、上下逆に置きます。
   5. 取り外したスフェロイドを静かに吸引し(ステップ1.4.3から)、ストレーナーを通してスフェロイド懸濁液を通過させる。
      注: 回転楕円体はフィルタに残ります。単一のセルは、媒体と一緒に流れます。
   6. 血清ピペットを使用して、ウェルの全表面に暖かい基底媒体の1 mLを分配し、残りのスフェロイドを取り除き、ストレーナーに回収します。
   7. この洗浄手順 1.4.6 を 2 回繰り返します。
   8. 顕微鏡下でプレートを観察し、すべての回転楕円体がマイクロウェルから取り除かれていることを確認します。必要に応じて洗浄を繰り返します(ステップ1.4.6~1.4.7)。
   9. ストレーナーを反転し、新しい15 mL円錐形チューブに置きます。DMEM/基膜マトリックス媒体でストレーナーを洗浄することにより、スフェロイドを収集します。
      注: 収集されたスフェロイドは、下流のアプリケーションと分析の準備が整っています。
5. スフェロイドの長期培養
   1. 1.5%アガロース溶液を基底培地で調製し、オートクレーブ(標準サイクル)で滅菌します。
   2. アガロース溶液が暖かく、まだ液体である間、 表2に記載されているように、標準的な培養プレートまたは皿の井戸をコーティングする。
      注:オーブンで皿/プレートを温めるので、コーティングのステップが容易になります。コーティングされた皿/皿は無菌環境で10日までRTで残され、光から保護することができる。
   3. 採取したスフェロイド(ステップ1.4.9から)をアガロースコーティングプレートにシードし、DMEM/基膜マトリックス媒体を添加してプレートのサイズに応じて最終的な体積を達成します。
      注:スフェロイド凝集体を避けるために、22のスフェロイド/cm²の最適な密度でそれらを播種します。コーティングが完全に平坦ではなく、エッジに向かって上昇し、プレートの中心に光の凹面を作り出すことに注意してください。スフェロイドの数が多すぎると、互いに付着する可能性が高くなります。
   4. 特定の分析のためにスフェロイドを回収するまで、プレートを37°C/5%CO2でインキュベート_します。
6. 化学療法薬によるスフェロイドの治療
   1. ステップ1.5.4からプレートスフェロイド、および2日間それらを成長させます。3日目(D3)から、FOLFIRI(5-フルオロウラシル、50 μg/mL)でそれらを治療します。イリノテカン、100 μg/mL;ロイコボリン、25 μg/mL)またはFOLFOX(5-フルオロウラシル、50 μg/mL;オキサリプラチン、10 μg/mL;ロイコボリン、25 μg/mL)化学療法レジメンの組み合わせは^{、CRC患者22、23、24、25}を治療するために日常的に使用される、または(コントロール)非治療(NT)状態でそれらを維持するために使用される。
   2. 3日間の処理後に、チップを切り取ったピペット(1,000 μLチップ)を使用してスフェロイドを回収し、各条件が少なくとも3回の反復で表されることを確認します。遠心分離機 1,000 × g で 3 分間、上清を取り除く。
   3. 組織学的分析のために2%パラホルムアルデヒド(PFA)にペレットを固定するか(セクション3を参照)、RNA抽出用のペレットを使用(セクション4参照)。
   4. 細胞死を解析するために、DMEM/基膜マトリックス培地中の黒い培養ウェルプレートのステップ1.6.1から、生細胞に浸透しない核酸染色(1:5000希釈)を有する30分間の黒い培養ウェルプレートで、生細胞^の侵害された膜を貫通する。マイクロプレートリーダーで蛍光の蓄積を測定します。

2. スフェロイドの成長のモニタリング

1. 逆顕微鏡を用いて、培養中の日々を通して異なる条件下で維持されたスフェロイドの代表的な画像を取得する。
2. 適切なソフトウェアを使用して、各回転楕円体の3つの異なる代表直径を測定することによって画像を分析します。
3. 次の式を使用して、推定球体積を取得します。
   
   
   注: d1、d2、および d3 という用語は、回転楕円体の 3 つの直径です。

3. 免疫蛍光(IF)と組織学的染色

1. 固定およびパラフィン埋め込み
   1. ステップ1.6.2で説明したようにチップを切り取ったピペットを使用して、選択した時点でスフェロイドを収集し、2%PFAのRTで30分間固定します。
      注:または、このステップでサンプルを4°Cで保存し、さらに使用するまで保管してください。
   2. パラフィン埋め込みの場合は、スフェロイド3xをPBS 1xで洗浄し、70%エタノールで再懸濁します。パラフィンの包含および切除後、組織学的分析のためにヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色を行う。
2. パラフィン切片の免疫標識
   注:間接免疫染色には5μmの厚いセクションを使用してください。
   1. 60°Cで2時間滑り込み、ワックスを溶かし、脱パラフィンを改善します。
   2. メチルシクロヘキサンで3分間、スライドを2回洗います。
   3. 1:1メチルシクロヘキサン:100%エタノールで3分間スライドを洗浄します。
   4. スライドを100%エタノールで3分間2回洗浄します。
      注:ステップ3.2.2からステップ3.2.4までの操作をすべて化学フードで実行します。
   5. スライドを90%エタノールで3分間洗います。
   6. 75%エタノールで3分間スライドを洗います。
   7. スライドを50%エタノールで3分間洗います。
   8. 水道水の下でスライドを洗います。
   9. スライドを蒸留水で5分間水分補給します。
   10. 0.01 Mクエン酸バッファー、pH 6.0の700 mLを準備し、適切な容器(幅:11.5 cm、長さ:17センチメートル、高さ:7センチメートル)に追加します。その中のスライドをマージします。700 Wで9〜10分間電子レンジに容器を熱し、沸騰が始まったら、さらに10分間インキュベートする400-450 Wに電力を下げます。
   11. スライドをバッファ内で約30〜40分間RTに冷却します。
   12. スライドをPBSで2回5分間洗います。
   13. マーカー ペンでセクションの周囲に円を描き、セクションに適用される液体のバリアを作成します。
   14. 各セクションを50 μLのブロッキングバッファー(通常のヤギ血清10%、牛血清アルブミン(BSA)、0.02%トリトンX-100(PBS)でRTで少なくとも30分間インキュベートします。
   15. ブロッキングバッファーを取り外し、インキュベーションバッファーで希釈した一次抗体の 50 μL を加えます (PBS では、通常のヤギ血清 1%、BSA 0.1% BSA、および 0.02% トリトン X-100)。RTで2時間、または4°Cで一晩インキュベートする。
   16. 一次抗体を取り出し、スライド3xをPBSで5分間洗浄します。
   17. RTで1時間インキュベーションバッファーに希釈された蛍光二次抗体の50 μLでスライドをインキュベートします。
   18. 二次抗体を取り除き、スライド3xをPBSで5分間洗浄します。
   19. 各セクションに4′,6-ジミディノ-2-フェニリンドールを用いた取り付け媒体50μLを加え、ガラスカバースリップをセクションの上に置きます。

4. RNA抽出、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)、定量RT-PCR(qRT-PCR)

1. 異なるポイントで、少なくとも3つの反復によって表される各点でスフェロイドを収集する。遠心分離機 1,000 × g で 3 分間、上清を取り除く。
   注:ペレットは、RNA抽出に直接使用するか、さらに使用されるまで-20°Cで保存することができます。
2. メーカーの指示に従って、市販のRNA分離キットを使用してRNA全体を分離します。
3. メーカーの指示に従って、各RNAサンプルの500 ngを相補DNA(cDNA)に逆転写します。
4. 逆転写後、1 μLのcDNAに対してPCR分析を行い、異なるエキソンに配置されたプライマーを用いてハウスキーピング遺伝子を増幅します。
   注:このステップはRNAの準備の任意のゲノムDNA汚染の不在の検証を可能にする。このプロトコルには、ペプチジルプロリリルイソメラーゼB(PPIB) プライマーが用いられた。
5. 対象遺伝子に特異的なプライマーを用いて、希釈したcDNAの4 μL(RNAAseフリーの二重蒸留水で1:10)にqPCR増幅を行います。各サンプルにおいて、ΔΔCt法を用いて特定のmRNA発現を定量化し、ハウスキーピング遺伝子レベルに対して正規化した値を用いる。
   メモ: このプロトコルでは、β-actin(ACTB) が 選択されました。このプロトコルで使用されているプライマーを 表 3に示します。

結果

スフェロイドの大きさの均質性の欠如は、現在利用可能な3Dスフェロイド培養システム¹³の主な欠点の1つであるため、この研究の目的は、均質なスフェロイドを得るための信頼性と再現性の高いプロトコルを設定することであった。まず、理想的な作業条件を確立するために、Caco2細胞の異なる数を、専用プレートを用いてマイクロウェル/スフェロ?...

ディスカッション

in vitro 3Dモデルは、2Dがん細胞培養の主な実験的欠点を克服し、微小環境や細胞の不均一性を含む典型的な腫瘍特徴をより再現する際に信頼性が高いように見えます。一般的に使用されるスフェロイドの3Dモデルは、足場を含まない(低い付着条件で培養)または足場ベース(培養細胞に生体材料を使用する)です。これらの方法は、使用される足場の性質に依存したり、構造やサイズが可変のスフ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
37 µm Reversible Strainer, Large	STEMCELL Technologies	27250	To be used with 50 mL conical tubes
5-Fluorouracil	Gift from Pharmacy of the Centre Leon Berard (CLB)	-	stock solution, 5 mg/100 mL; final concentration, 50 µg/mL
Agarose	Sigma	A9539
Aggrewell 400 24-well plates	STEMCELL Technologies	34411	1,200 microwells per well for spheroid formation and growth
Anti Caspase3 - Rabbit	Cell Signaling	9661	dilution 1:200
Anti Musashi-1 (14H1) - Rat	eBioscience/Thermo Fisher	14-9896-82	dilution 1:500
Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mL	STEMCELL Technologies	07010
Anti-CD133 (13A4) - Rat	Invitrogen	14-133-82	dilution 1:100
Anti-CD44 -Rabbit	Abcam	ab157107	dilution 1:2000
Anti-PCNA - Mouse	Dako	M0879	dilution 1:1000
Anti-β-catenin - Mouse	Santa Cruz Biotechnology	sc-7963	dilution 1:50
Black multiwell plates	Thermo Fisher Scientific	237108
Citric Acid Monohydrate	Sigma	C1909
CLARIOstar apparatus	BMG Labtech		microplate reader
Dako pen			marker pen to mark circles on slides for creating barriers for liquids
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A21202	dilution 1:1000
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A10037	dilution 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A21206	dilution 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A10042	dilution 1:1000
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide)	Gibco	10569010
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	16000044
Fluorogel mounting medium with DAPI	Interchim	FP-DT094B
Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A11077	dilution 1:1000
ImageJ software			Spheroid image analysis
Irinotecan	Gift from Pharmacy CLB	-	stock solution, 20 mg/mL; final concentration, 100 µg/mL
iScript reverse transcriptase	Bio-Rad	1708891
Leucovorin	Gift from Pharmacy CLB	-	stock solution, 50 mg/mL; final concentration, 25 µg/mL
Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning	354234	Basement membrane matrix
Nucleospin RNA XS Kit	Macherey-Nagel	740902 .250
Oxaliplatin	Gift from Pharmacy CLB	-	stock solution, 100 mg/20 mL;final concentration, 10 µg/mL
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140130
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Gibco	14190250
SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)	Takara	RR420B
SYTOX- Green	Thermo Fisher Scientific	S7020	nucleic acid stain; dilution 1:5000
Trypsin-EDTA (0.05 %)	Gibco	25300062
Zeiss-Axiovert microscope			inverted microscope for acquiring images of spheroids