研究结肠癌干细胞的球体三维模型

摘要

该协议提出了一个新型的，强大的，可重复的文化系统，以产生和生长三维球体从Caco2结肠腺癌细胞。研究结果为研究癌症干细胞生物学（包括化疗反应）的方法的恰当性提供了第一个概念证明。

摘要

结肠直肠癌的特点是异质性和分层组织，由负责肿瘤开发、维持和抗药性的癌症干细胞（CSC）群体组成。因此，更好地了解CSC特性对于其特定目标来说是有效治疗的先决条件。然而，缺乏适合深入调查的可适用的前科模型。虽然体外二维（2D）癌细胞系为肿瘤生物学提供了有价值的见解，但它们不会复制表型和遗传肿瘤异质性。相比之下，三维（3D）模型处理和再现近生理癌症的复杂性和细胞异质性。这项工作的目的是设计一个强大和可重复的3D培养系统来研究CSC生物学。目前的方法描述了从Caco2结肠腺癌细胞中产生3D球体的条件的发展和优化，这种模型可用于长期培养。重要的是，在球体中，围绕流明状结构组织的细胞的特点是微分细胞增殖模式，以及CSC的存在，这些细胞表示一组标记物。这些结果为研究细胞异质性和CSC生物学（包括对化疗的反应）的这种3D方法的恰当性提供了第一个概念证明。

引言

结肠直肠癌（CRC）仍然是世界第二大癌症相关死亡原因^。CRC的发展是基因突变和/或表观遗传改变^2，3逐步获取和积累的结果，包括肿瘤基因的激活和肿瘤抑制基因^3，4的灭活。此外，非遗传因素（如微环境）可以促进和促进原基因转化，从而参与CRC⁵的演变。重要的是，CRC由不同的细胞群组成，包括未分化的CSC和显示一些分化特征的散装肿瘤细胞，它们构成了一个层次结构，让人联想到正常结肠密码^6、7中的上皮组织。

CSC被认为是负责肿瘤外观^8，其维持和生长，转移能力，和耐常规疗法^6，7。在肿瘤中，癌细胞，包括CSC，在它们独特的突变和表观遗传特征、形态和表型差异、基因表达、新陈代谢、增殖率和转移潜力方面表现出高度的异质性和复杂性^。因此，为了....

研究方案

注：所有试剂和材料的详细信息都列在 材料表中。

1. 球形形成

1. 球形文化媒体
   1. 准备基础介质，包括杜尔贝科的改良鹰介质 （DMEM）， 辅以 4 mM L-阿拉尼尔- L - 谷氨酰二肽.
   2. 从步骤 1.1.1 开始，在基础介质中准备包含 10% 胎儿牛血清 （FBS） 和 1% 青霉素链霉素 （笔/链球菌） 的 DMEM 完整介质。
   3. 从步骤 1.1.1 开始，在基础介质中准备包含 2.5% 的基层膜基质、10% FBS 和 1% 笔/链球菌的 DMEM/地下室膜基质介质。
2. 球形形成板的准备
   1. 温暖的基底和DMEM/地下室膜基质介质在室温（RT）约20分钟。
   2. 通过在每口井中添加 500μL 的防粘性冲洗溶液，预处理专用于球形形成的 24 井板的井。
      注：在这些板块中，每口井由1，200个微井组成。
   3. 在摆动桶转子中以 1，200 × g 的速度将板分流 5 分钟，并配有板材适配器。
      注意：如果只使用一个盘子，请准备一个装满水的额外标准板，以平衡重量。
   4. 用2mL的暖基底介质冲洗每口井，并从井中吸气介质。
   5. 观察显微镜下的板，以确保气泡已完全从微井中去除。如果气泡仍然被困住，离心机在1，200×

结果

由于球体大小缺乏同质性是目前可用的3D球形培养系统¹³的主要缺点之一，这项工作的目的是建立一个可靠和可重复的协议，以获得同质球体。首先，为了建立理想的工作条件，使用专用板（表1）测试了不同数量的Caco2细胞，每个微孔/球体的细胞从50到2000个不等。实际上，这些板块中的每口井都含有1，200个微孔，使每口井形成相同数量的球?.......

讨论

体外3D模型克服了2D癌细胞培养的主要实验缺陷，因为它们在回顾典型的肿瘤特征（包括微环境和细胞异质性）方面似乎更可靠。常用的球体 3D 模型是无脚手架（在低附件条件下培养）或基于脚手架（使用生物材料培养细胞）。这些方法由于取决于使用的脚手架的性质或产生结构和大小变化的球体而呈现不同的缺点。

本协议报告了使用无脚手架方法从结肠腺癌细胞系 Caco2 中?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
37 µm Reversible Strainer, Large	STEMCELL Technologies	27250	To be used with 50 mL conical tubes
5-Fluorouracil	Gift from Pharmacy of the Centre Leon Berard (CLB)	-	stock solution, 5 mg/100 mL; final concentration, 50 µg/mL
Agarose	Sigma	A9539
Aggrewell 400 24-well plates	STEMCELL Technologies	34411	1,200 microwells per well for spheroid formation and growth
Anti Caspase3 - Rabbit	Cell Signaling	9661	dilution 1:200
Anti Musashi-1 (14H1) - Rat	eBioscience/Thermo Fisher	14-9896-82	dilution 1:500
Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mL	STEMCELL Technologies	07010
Anti-CD133 (13A4) - Rat	Invitrogen	14-133-82	dilution 1:100
Anti-CD44 -Rabbit	Abcam	ab157107	dilution 1:2000
Anti-PCNA - Mouse	Dako	M0879	dilution 1:1000
Anti-β-catenin - Mouse	Santa Cruz Biotechnology	sc-7963	dilution 1:50
Black multiwell plates	Thermo Fisher Scientific	237108
Citric Acid Monohydrate	Sigma	C1909
CLARIOstar apparatus	BMG Labtech		microplate reader
Dako pen			marker pen to mark circles on slides for creating barriers for liquids
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A21202	dilution 1:1000
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A10037	dilution 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A21206	dilution 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A10042	dilution 1:1000
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide)	Gibco	10569010
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	16000044
Fluorogel mounting medium with DAPI	Interchim	FP-DT094B
Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A11077	dilution 1:1000
ImageJ software			Spheroid image analysis
Irinotecan	Gift from Pharmacy CLB	-	stock solution, 20 mg/mL; final concentration, 100 µg/mL
iScript reverse transcriptase	Bio-Rad	1708891
Leucovorin	Gift from Pharmacy CLB	-	stock solution, 50 mg/mL; final concentration, 25 µg/mL
Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning	354234	Basement membrane matrix
Nucleospin RNA XS Kit	Macherey-Nagel	740902 .250
Oxaliplatin	Gift from Pharmacy CLB	-	stock solution, 100 mg/20 mL;final concentration, 10 µg/mL
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140130
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Gibco	14190250
SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)	Takara	RR420B
SYTOX- Green	Thermo Fisher Scientific	S7020	nucleic acid stain; dilution 1:5000
Trypsin-EDTA (0.05 %)	Gibco	25300062
Zeiss-Axiovert microscope			inverted microscope for acquiring images of spheroids