研究结肠癌干细胞的球体三维模型

摘要

该协议提出了一个新型的，强大的，可重复的文化系统，以产生和生长三维球体从Caco2结肠腺癌细胞。研究结果为研究癌症干细胞生物学（包括化疗反应）的方法的恰当性提供了第一个概念证明。

摘要

结肠直肠癌的特点是异质性和分层组织，由负责肿瘤开发、维持和抗药性的癌症干细胞（CSC）群体组成。因此，更好地了解CSC特性对于其特定目标来说是有效治疗的先决条件。然而，缺乏适合深入调查的可适用的前科模型。虽然体外二维（2D）癌细胞系为肿瘤生物学提供了有价值的见解，但它们不会复制表型和遗传肿瘤异质性。相比之下，三维（3D）模型处理和再现近生理癌症的复杂性和细胞异质性。这项工作的目的是设计一个强大和可重复的3D培养系统来研究CSC生物学。目前的方法描述了从Caco2结肠腺癌细胞中产生3D球体的条件的发展和优化，这种模型可用于长期培养。重要的是，在球体中，围绕流明状结构组织的细胞的特点是微分细胞增殖模式，以及CSC的存在，这些细胞表示一组标记物。这些结果为研究细胞异质性和CSC生物学（包括对化疗的反应）的这种3D方法的恰当性提供了第一个概念证明。

引言

结肠直肠癌（CRC）仍然是世界第二大癌症相关死亡原因^。CRC的发展是基因突变和/或表观遗传改变^2，3逐步获取和积累的结果，包括肿瘤基因的激活和肿瘤抑制基因^3，4的灭活。此外，非遗传因素（如微环境）可以促进和促进原基因转化，从而参与CRC⁵的演变。重要的是，CRC由不同的细胞群组成，包括未分化的CSC和显示一些分化特征的散装肿瘤细胞，它们构成了一个层次结构，让人联想到正常结肠密码^6、7中的上皮组织。

CSC被认为是负责肿瘤外观^8，其维持和生长，转移能力，和耐常规疗法^6，7。在肿瘤中，癌细胞，包括CSC，在它们独特的突变和表观遗传特征、形态和表型差异、基因表达、新陈代谢、增殖率和转移潜力方面表现出高度的异质性和复杂性^。因此，为了更好地了解癌症生物学，肿瘤进展，并获得抗药性治疗及其转化为有效的治疗，人类前科模型捕捉这种癌症的异质性和层次性是重要的^10，11。

体外2D癌细胞系已被长期使用，为肿瘤的发展和治疗分子疗效的机制提供了宝贵的见解。然而，由于原始肿瘤中缺乏表型和遗传异质性，它们的限制现在已得到^广泛认可。此外，营养物质、氧气、pH梯度和肿瘤微环境不复发生，微环境对于维持包括CSC^11、12在内的不同细胞类型的特别重要。为了克服这些主要缺点，已经开发了几种3D模型，以实验性地解决和再现癌症的复杂性和异质性。实际上，这些模型可回顾肿瘤细胞异质性、细胞相互作用和空间结构，类似于^{体内12、13、14}中观察到的模型。从新鲜肿瘤以及细胞线衍生球体中建立的原发性肿瘤器官主要采用^15、16。

球体可以以无脚手架或脚手架的方式培养，以迫使细胞形成细胞并在细胞聚合体中生长。无脚手架的方法基于非粘附条件下的细胞培养（例如，悬垂法或超低附着板），而基于脚手架的模型则依赖于自然、合成或混合生物材料来培养细胞^{12、13、14。}基于脚手架的球体呈现不同的缺点，因为最终的球体形成将取决于所用（生物）材料的性质和组成。虽然脚手架无球体方法，到目前为止不依赖于基板的性质，他们产生球体，在结构和大小^17，18变化。

这项工作旨在设计一个强大和可重复的球体3D培养系统，其大小是同质的，由Caco2结肠腺癌细胞组成，以研究CSC生物学。Caco2细胞特别感兴趣，因为它们能够随着时间的推移分化^19，20，强烈地暗示了干细胞般的潜力。因此，球体的长期培养揭示了不同CSC人群对化疗有不同的反应。

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研究方案

注:所有试剂和材料的详细信息都列在 材料表中。

1. 球形形成

1. 球形文化媒体
   1. 准备基础介质，包括杜尔贝科的改良鹰介质 （DMEM）， 辅以 4 mM L-阿拉尼尔- L - 谷氨酰二肽.
   2. 从步骤 1.1.1 开始，在基础介质中准备包含 10% 胎儿牛血清 （FBS） 和 1% 青霉素链霉素 （笔/链球菌） 的 DMEM 完整介质。
   3. 从步骤 1.1.1 开始，在基础介质中准备包含 2.5% 的基层膜基质、10% FBS 和 1% 笔/链球菌的 DMEM/地下室膜基质介质。
2. 球形形成板的准备
   1. 温暖的基底和DMEM/地下室膜基质介质在室温（RT）约20分钟。
   2. 通过在每口井中添加 500μL 的防粘性冲洗溶液，预处理专用于球形形成的 24 井板的井。
      注:在这些板块中，每口井由1，200个微井组成。
   3. 在摆动桶转子中以 1，200 × g 的速度将板分流 5 分钟，并配有板材适配器。
      注意:如果只使用一个盘子，请准备一个装满水的额外标准板，以平衡重量。
   4. 用2mL的暖基底介质冲洗每口井，并从井中吸气介质。
   5. 观察显微镜下的板，以确保气泡已完全从微井中去除。如果气泡仍然被困住，离心机在1，200× 克 时再停留5分钟，以消除气泡。
   6. 重复冲洗步骤 1.2.4-1.2.5。
   7. 在每个井中加入 1 mL 的暖 DMEM/地下室膜基质介质。
3. 球体的生成
   1. 在含有 5%_CO 2 的潮湿大气中，在 DMEM 介质中的 2D 单层中生长 Caco2 细胞，辅以 10% FBS 和 1% 笔/链球，温度为 37 °C（以下简称 37 °C/5% CO_2）。
      注:要使用的细胞通道的最大数量为 80。
   2. 当达到80%的共生性时，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）1x（10厘米菜5毫升）清洗细胞，加入三聚氰胺四乙酸（EDTA）（10厘米菜2毫克），在37°C/5%CO₂孵育2-5分钟。
   3. 检查显微镜下的细胞分离，并通过每10厘米盘中加入4毫升的DMEM完整介质来中和三氯丁香。
   4. 使用血细胞计计算细胞以确定细胞总数。
   5. 将细胞悬架在 1，200 × g 下，悬架 5 分钟。丢弃超母体，并以适当的DMEM/基础膜基质介质体体恢复颗粒。
   6. 参考 表1， 以确定每口井所需的细胞数量，以达到每个微井所需的细胞数量。或者，考虑到每口井包含 1，200 个微井，请计算使用以下公式进行 24 井板的细胞数量
      每口井所需的细胞数量 = 每个微井所需的细胞数量× 1，200 个
   7. 将细胞悬架的所需体积添加到每个井中，以达到最终 1 mL 的所需的细胞数。
   8. 向每口油井添加 1 mL 的 DMEM/地下室膜基质介质，以达到每口井 2 mL 的最终体积（另请参阅步骤 1.2.7）。
      注意:小心不要将气泡引入微井。
   9. 立即以1，200× 克 的速度将盘子离心5分钟，以捕获微井中的细胞。如有必要，用装满水的标准板平衡离心机。
   10. 观察显微镜下的板，以验证细胞均匀地分布在微井中。
   11. 在不干扰板的情况下，以 37 °C/5% CO₂ 48 h 孵化板。
       注:根据最初的协议^21，虽然许多细胞系可以在24小时内形成球体，但有些细胞线需要更长的潜伏时间。在此协议中，48 h 足以形成球形。
4. 从微井中采集球体
   1. 在 RT 加热基底和 DMEM/地下室膜基质介质约 20 分钟。
   2. 使用血清学移液器，从每口井中取出一半的培养介质（1 mL）。
   3. 将介质重新添加到井面，将球体从微井中分离。
      注意:不要触摸或修剪球形。
   4. 将 37μm 可逆滤应变器（或 40μm 标准滤应变器）放在 15 mL 锥形管的顶部以收集球形。
      注意:如果使用 40μm 标准滤网，请将其倒置。
   5. 轻轻地吸气脱落的球体（从步骤1.4.3），并通过过滤器通过球形悬架。
      注意:球体将保留在过滤器上:单个细胞将流过与介质。
   6. 使用血清学移液器，在整个井面上分配1mL的温暖基底介质，以去除了任何剩余的球体，并在过滤器上恢复它们。
   7. 重复此洗涤步骤 1.4.6 两次。
   8. 观察显微镜下的板，以确保从微井中去除所有球体。如有必要，重复洗涤（步骤 1.4.6-1.4.7）。
   9. 倒置滤网，并将其放置在新的15mL圆锥管上。通过用DMEM/地下室膜基质介质清洗滤网收集球体。
      注:收集的球体已准备好用于下游应用和分析。
5. 球体的长期文化
   1. 在基础介质中准备 1.5% 的 agarose 溶液，并通过自杀灭（标准循环）消毒。
   2. 虽然蔗糖溶液是温暖和静止的液体，涂上标准培养板或菜肴的井，如 表2所述。
      注意:加热烤箱中的盘子/盘子将促进涂层步骤。涂层的盘子/盘子可以在RT的无菌环境中最多留10天，并免受光线的伤害。
   3. 在糖衣板中播种收获的球体（从步骤 1.4.9 开始），并添加 DMEM/地下室膜基质介质，根据板的大小实现最终体积。
      注意:为了避免球形聚合物，以22球形/cm²的最佳密度播种它们。观察涂层并非完全平坦，它向边缘上升，在板的中心产生光凹。如果球体的数量过高，它们更有可能相互粘附。
   4. 在37°C/5%CO₂ 中孵化板，直到球体恢复以进行特定分析_。
6. 用化疗药物治疗球形
   1. 板球体从步骤1.5.4，并增长他们2天。从第3天（D3）开始，用福尔菲里（5-氟酸，50微克/升） 治疗:伊里诺特坎， 100μg/mL;卢科沃林，25微克/升）或与福尔福克斯（5-氟酸，50微克/升;氧化铂，10微克/升;Leucovorin， 25 μg/mL） 化疗方案组合通常用于治疗CRC患者22，23，24，25，或保持他们在（控制）未治疗（NT）状态。
   2. 经过3天的治疗后，使用尖端切断的移液器（1，000μL尖端）收集球体，确保每个情况至少由三个复制品表示。以1，000× 克 的速度将它们离心3分钟，然后取出超自然。
   3. 修复颗粒在2%的副甲醛（PFA）组织学分析（见第3节），或使用颗粒进行RNA提取（见第4节）。
   4. 为了分析细胞死亡，在DMEM/地下室膜基质介质中从步骤1.6.1中孵育球体30分钟，核酸污渍（1:5000稀释）不会渗透活细胞，而是穿透死细胞²⁶的受损膜。用微板读卡器测量荧光的积累。

2. 监测球形生长

1. 使用倒显微镜，获取不同条件下在不同条件下保持的球体的代表性图像。
2. 使用适当的软件测量每个球形的三个不同代表性直径来分析图像。
3. 使用以下公式获取估计的球体体积。
   
   
   注:术语，d1，d2和d3，是球体的三个直径。

3. 免疫荧光（IF）和组织染色

1. 固定和石蜡嵌入
   1. 使用移液器在选定的时间点收集球体，并按步骤 1.6.2 将尖端切断，并在 RT 以 2% PFA 固定 30 分钟。
      注:或者，在此步骤中将样品存储在 4 °C，直到进一步使用。
   2. 对于石蜡嵌入，用PBS 1x清洗球体3倍，并以70%乙醇重新填充。石蜡内含和分割后，进行血氧林和异丙辛 （H&E） 染色，用于组织学分析。
2. 石蜡部分的免疫带
   注:使用5微米厚的部分进行间接免疫染色。
   1. 在 60 °C 下孵化滑梯，持续 2 小时，以熔化蜡并改善去帕芬化。
   2. 用甲基环丙烷清洗两次幻灯片3分钟。
   3. 在 1:1 甲基环丙烷:100% 乙醇中清洗幻灯片 3 分钟。
   4. 在100%乙醇中清洗幻灯片两次，3分钟。
      注意:执行所有操作步骤 3.2.2 到步骤 3.2.4 在化学罩。
   5. 在90%乙醇中清洗幻灯片3分钟。
   6. 在 75% 乙醇中清洗幻灯片 3 分钟。
   7. 在50%乙醇中清洗幻灯片3分钟。
   8. 在自来水下清洗滑梯。
   9. 在蒸馏水中补充滑梯水分5分钟。
   10. 准备700mL的0.01 M柠檬酸盐缓冲器，pH 6.0，并将其添加到一个合适的容器（宽度:11.5厘米，长度:17厘米，高度:7厘米）:淹没在它的幻灯片。在 700 W 时在微波炉中加热容器 9-10 分钟，当沸腾开始时，将功率降低到 400-450 W. 孵化再加热 10 分钟。
   11. 让幻灯片在缓冲区冷却到RT约30-40分钟。
   12. 在 PBS 中清洗幻灯片两次，5 分钟。
   13. 用记号笔在各部分周围画一个圆圈，为应用于各部分的液体设置屏障。
   14. 在 RT 中用 50 μL 的阻塞缓冲区（10% 普通山羊血清、1% 牛血清白蛋白 （BSA） 和 0.02% Triton X-100 在 PBS 中孵化每个部分，至少 30 分钟。
   15. 取出阻塞缓冲，并在孵化缓冲区中稀释 50μL 的主要抗体（1% 普通山羊血清、0.1% BSA 和 0.02% Triton X-100 在 PBS 中）。在RT孵化2小时或在4°C过夜。
   16. 取出主要抗体，在PBS中清洗幻灯片3次5分钟。
   17. 在 RT 的孵化缓冲区中用 50μL 的荧光二次抗体稀释 1 小时，孵化幻灯片。
   18. 去除辅助抗体，在PBS中清洗幻灯片3次5分钟。
   19. 在每个部分添加 50μL 的安装介质，并加入 4+，6-2-苯绒，并在该部分放置玻璃盖片。

4. RNA提取、反向转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和定量RT-PCR（qRT-PCR）

1. 在不同的时间点收集球体，每个点由至少三个复制品表示。以1，000× 克 的速度将它们离心3分钟，然后取出超自然。
   注:颗粒可直接用于RNA提取或存储在-20°C，直到进一步使用。
2. 根据制造商的说明，使用商用 RNA 隔离套件分离总 RNA。
3. 根据制造商的说明，将每个RNA样本中的500 ng反向转录为补充DNA（cDNA），并使用商业套件。
4. 反向转录后，对 cDNA 的 1 μL 进行 PCR 分析，以放大位于不同外位的引物的内务基因。
   注:此步骤可验证RNA制剂中没有任何基因组DNA污染。对于此协议，使用多肽异丙酶 B（PPIB） 引因。
5. 使用特定于感兴趣基因的引物，对先前稀释的 cDNA 的 4μL（无 RNAse 双蒸馏水中的 1:10）进行 qPCR 放大。在每个样本中，使用与家政基因水平正常化的ΔΔCt方法和值来量化特定的 mRNA 表达。
   注:对于此协议，选择了β行为（ACTB）。 本协议中使用的引金列在 表 3 中。

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结果

由于球体大小缺乏同质性是目前可用的3D球形培养系统¹³的主要缺点之一，这项工作的目的是建立一个可靠和可重复的协议，以获得同质球体。首先，为了建立理想的工作条件，使用专用板（表1）测试了不同数量的Caco2细胞，每个微孔/球体的细胞从50到2000个不等。实际上，这些板块中的每口井都含有1，200个微孔，使每口井形成相同数量的球?...

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讨论

体外3D模型克服了2D癌细胞培养的主要实验缺陷，因为它们在回顾典型的肿瘤特征（包括微环境和细胞异质性）方面似乎更可靠。常用的球体 3D 模型是无脚手架（在低附件条件下培养）或基于脚手架（使用生物材料培养细胞）。这些方法由于取决于使用的脚手架的性质或产生结构和大小变化的球体而呈现不同的缺点。

本协议报告了使用无脚手架方法从结肠腺癌细胞系 Caco2 中?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
37 µm Reversible Strainer, Large	STEMCELL Technologies	27250	To be used with 50 mL conical tubes
5-Fluorouracil	Gift from Pharmacy of the Centre Leon Berard (CLB)	-	stock solution, 5 mg/100 mL; final concentration, 50 µg/mL
Agarose	Sigma	A9539
Aggrewell 400 24-well plates	STEMCELL Technologies	34411	1,200 microwells per well for spheroid formation and growth
Anti Caspase3 - Rabbit	Cell Signaling	9661	dilution 1:200
Anti Musashi-1 (14H1) - Rat	eBioscience/Thermo Fisher	14-9896-82	dilution 1:500
Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mL	STEMCELL Technologies	07010
Anti-CD133 (13A4) - Rat	Invitrogen	14-133-82	dilution 1:100
Anti-CD44 -Rabbit	Abcam	ab157107	dilution 1:2000
Anti-PCNA - Mouse	Dako	M0879	dilution 1:1000
Anti-β-catenin - Mouse	Santa Cruz Biotechnology	sc-7963	dilution 1:50
Black multiwell plates	Thermo Fisher Scientific	237108
Citric Acid Monohydrate	Sigma	C1909
CLARIOstar apparatus	BMG Labtech		microplate reader
Dako pen			marker pen to mark circles on slides for creating barriers for liquids
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A21202	dilution 1:1000
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A10037	dilution 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A21206	dilution 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A10042	dilution 1:1000
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide)	Gibco	10569010
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	16000044
Fluorogel mounting medium with DAPI	Interchim	FP-DT094B
Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A11077	dilution 1:1000
ImageJ software			Spheroid image analysis
Irinotecan	Gift from Pharmacy CLB	-	stock solution, 20 mg/mL; final concentration, 100 µg/mL
iScript reverse transcriptase	Bio-Rad	1708891
Leucovorin	Gift from Pharmacy CLB	-	stock solution, 50 mg/mL; final concentration, 25 µg/mL
Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning	354234	Basement membrane matrix
Nucleospin RNA XS Kit	Macherey-Nagel	740902 .250
Oxaliplatin	Gift from Pharmacy CLB	-	stock solution, 100 mg/20 mL;final concentration, 10 µg/mL
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140130
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Gibco	14190250
SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)	Takara	RR420B
SYTOX- Green	Thermo Fisher Scientific	S7020	nucleic acid stain; dilution 1:5000
Trypsin-EDTA (0.05 %)	Gibco	25300062
Zeiss-Axiovert microscope			inverted microscope for acquiring images of spheroids